Wydajna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu ograniczonych ilości biomasy

Summary

Opisujemy solidną metodę immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu pierwotnych limfocytów T. Metoda opiera się na standardowych podejściach, ale wykorzystuje określony zestaw warunków i odczynników, które poprawiają wydajność dla ograniczonej liczby komórek. Co ważne, przedstawiono szczegółowy opis fazy analizy danych.

Abstract

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest powszechnie stosowaną metodą określania interakcji różnych białek z DNA w chromatynie żywych komórek. Przykłady obejmują specyficzne dla sekwencji czynniki transkrypcyjne wiążące DNA, histony i ich różne stany modyfikacji, enzymy, takie jak polimerazy RNA i czynniki pomocnicze oraz komponenty naprawy DNA. Pomimo jego wszechobecności brakuje aktualnych, szczegółowych metodologii zarówno do przygotowywania materiału na ławce rezerwowych, jak i do dokładnej analizy umożliwiającej ilościowe wskaźniki interakcji. Z powodu tego braku informacji, a także dlatego, że podobnie jak w przypadku każdej immunoprecypitacji, warunki muszą być ponownie zoptymalizowane pod kątem nowych zestawów warunków eksperymentalnych, test ChIP jest podatny na niedokładne lub słabo ilościowe wyniki.

Nasz protokół ostatecznie wywodzi się z przełomowych prac nad czynnikiem transkrypcyjnym:interakcje DNA^1,2 , ale zawiera szereg ulepszeń czułości i odtwarzalności dla trudnych do uzyskania typów komórek. Protokół był z powodzeniem stosowany^3,4 , zarówno przy użyciu qPCR do ilościowego oznaczania wzbogacenia DNA, jak i przy użyciu półilościowego wariantu poniższego protokołu.

Ta analiza ilościowa materiału amplifikowanego PCR jest wykonywana obliczeniowo i stanowi czynnik ograniczający w teście. Ważne kontrole i inne względy obejmują użycie przeciwciała dopasowanego do izotypu, a także ocenę regionu kontrolnego genomowego DNA, takiego jak region międzygenowy, co do którego przewiduje się, że nie zostanie związany przez badane białko (lub przewiduje się, że nie wykaże zmian w warunkach eksperymentalnych). Ponadto standardowa krzywa materiału wejściowego dla każdej próbki ChIP jest używana do wyprowadzenia bezwzględnych poziomów wzbogacenia w materiale doświadczalnym. Zastosowanie krzywych standardowych pomaga uwzględnić różnice między zestawami podkładów, niezależnie od tego, jak starannie zostały zaprojektowane, a także różnice w wydajności w całym zakresie stężeń matrycy dla pojedynczego zestawu podkładów. Nasz protokół różni się od innych, które są dostępne^5-8 tym, że obszernie omawiamy późniejszą fazę analizy.

Protocol

1. Izolacja naiwnych limfocytów T CD4 myszy ze śledzioną

1. Złóż mysz w ofierze w humanitarny sposób, zgodnie z protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania (IACUC). Wyciąć śledzionę i umieścić ją na szalce Petriego zawierającej 10 ml DMEM z 10% FBS.
2. Zmiażdż śledzionę za pomocą matowych końców dwóch szklanych szkiełek, aby uwolnić splenocyty. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
3. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 200 x g (~1 200 obr./min dla wirówki klinicznej o typowej średnicy wirnika) przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
4. Ponownie zawieś komórki w 2 ml buforu ACK w celu lizy czerwonych krwinek, 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT). Zatrzymaj reakcję, dodając 8 ml DMEM z FBS.
5. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
6. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml DMEM zawierającym FBS i przepuścić przez filtr siatkowy 70 μm (BD Falcon, Cat# 352350). Policz komórki i przystąp do izolacji naiwnych limfocytów T CD4 za pomocą zestawu do izolacji CD4 (Miltenyi, Cat# 130-095-248) zgodnie z instrukcjami producenta. Zebrać naiwne limfocyty T CD4 przez odwirowanie w stężeniu 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić komórki w 10 ml DMEM za pomocą FBS.

2. Przygotowanie chromatyny

1. Dodaj 37% formaldehydu do końcowego stężenia 1% do zawiesiny komórkowej w DMEM i delikatnie kołysz w RT (np. za pomocą nutatora) przez 15 minut, aby usieciować kompleksy DNA: białko.
2. Zatrzymaj sieciowanie, dodając 1 M glicyny do końcowego stężenia 125 mM. Kontynuuj kołysanie przez 5 minut przy RT.
3. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
4. Przemyć komórki przez ponowne zawieszenie w 5 ml lodowatego PBS zawierającego inhibitory proteazy. Przemyć w lodowatym PBS zawierającym inhibitory proteazy w sumie 3 razy i zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 °C.
5. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego buforu do lizy komórek zawierającego inhibitory proteazy. Inkubować na lodzie przez 15 minut. Skuteczność lizy komórek można określić poprzez ponowne zawieszenie małej porcji komórek w 0,4% roztworze błękitu trypanowego (Sigma, Cat# T8154) i obserwację pod mikroskopem.
6. Zebrać jądra przez odwirowanie przy 200 x g (zwykle ~1 200 obr./min) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie wyrzucić supernatant.
7. Zawiesić jądra w 500 μl buforu do lizy jądrowej zawierającego inhibitory proteazy. Inkubować na lodzie przez 15 minut.
8. Sonikuj komórki za pomocą Misonix Sonicator 3,000, rozmiar sondy 1,6 mm: Poziom wyjściowy 4, 15 sekund burst, 4 razy na lodzie. Każda próbka musi być schładzana na lodzie przez 1-2 minuty przed ponownym sonikacją, aby zapobiec przegrzaniu próbek. Przegrzanie może spowodować odwrócenie ogniw poprzecznych.
9. Odwirować sonikowaną chromatynę przy 16 000 x g (~13 200 obr./min w mikrowirówce) przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
10. Weź 20 μl podwielokrotności klarownego supernatantu, dodaj barwnik ładujący DNA i sprawdź sonikowane DNA za pomocą elektroforezy przez 2% żel agarozowy (idealny rozmiar sonikowanego DNA dla większości zastosowań to 200-500 pz).
11. Określ stężenie DNA za pomocą spektrofotometru UV. Chromatyna ścięta może być natychmiast użyta w celu wywołania reakcji immunoprecypitacji chromatyny lub przechowywana w temperaturze -80 °C. Zazwyczaj uzyskujemy 7,5-10 μg DNA z 2-3 X 10⁶ oczyszczonych limfocytów T CD4 na mysz.

3. Immunoprecypitacja chromatyny (wszystkie etapy muszą być przeprowadzone w temperaturze 0-4 °C)

1. Rozcieńczyć sonikowaną chromatynę do stężenia DNA 5-10 μg/ml (objętość całkowita = 1 ml) w buforze rozcieńczającym ChIP z inhibitorami proteazy.
2. Zaoszczędź 100 μl (10%) jako dane wejściowe. Przechowywać na lodzie.
3. Podamy po 450 μl do dwóch probówek do mikrofug o pojemności 1,7 ml oznaczonych jako kontrola izotypu (mysia lub królicza IgG) i przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania. Jeżeli stosuje się wiele przeciwciał o tym samym izotypie, do przeprowadzenia tej analizy wystarczy jedna kontrolna izotyp. Będziesz potrzebował wielu kontroli izotypów, jeśli używane są przeciwciała o innym pochodzeniu zwierzęcym lub izotypie.
4. Dodać 2-5 μg specyficznego przeciwciała, w zależności od swoistości użytego przeciwciała, lub kontroli izotypu do odpowiednich probówek.
5. Kołysz probówkami za pomocą nutatora przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić tworzenie kompleksów chromatyna-przeciwciało.
6. Do powyższej mieszaniny dodać 25 μl kulek magnetycznych z białkiem G (zawiesina zawieszonych kulek w stosunku 1:1) i pozostawić na co najmniej 2 godziny w temperaturze 4 °C. Koraliki od naszego dostawcy mogą być używane bezpośrednio.
7. Umieść rurki do mikrofuge na stojaku magnetycznym i pozwól, aby koraliki zebrały się po namagnesowanej stronie.
8. Ostrożnie usuń roztwór przez aspirację, nie naruszając kulek.
9. Dodaj 1 ml roztworu do płukania o niskiej zawartości soli i pozwól delikatnie kołysać się przez 5 minut na nutatorze. Zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i usuń roztwór myjący. Powtórz raz.
10. Dodaj 1 ml roztworu do płukania o wysokiej zawartości soli i pozostaw na 5 minut na nutatorze. Zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i usuń roztwór myjący. Powtórz raz.
11. Dodaj 1 ml roztworu do płukania chlorku litu i pozostaw na 5 minut do kołysania na nutatorze. Zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i usuń roztwór myjący. Powtórz raz. Zastosowanie LiCl poprawia skuteczne usuwanie niespecyficznych oddziaływań chromatyny z kulkami.
12. Dodaj 1 ml roztworu TE i pozostaw na 5 minut do kołysania na nutatorze. Zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i usuń roztwór myjący.
13. Eluować DNA z kulek, dodając 250 μl buforu elucyjnego. Kołysz się przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odpipetować eluat i zachować ten materiał w nowej probówce do mikrofugu o pojemności 1,7 ml. Powtórz jeszcze raz i połącz obie elucjacje. Wyrzuć koraliki.
14. Aby odwrócić wiązania krzyżowe, dodaj 5 M NaCl do końcowego stężenia 0,3 M i 1 μl RNazy A (20 mg / ml) do eluowanego DNA. Dodać 400 μl buforu elucyjnego do wejść zapisanych w kroku 3.2, aby uzyskać objętość 500 μl. Do danych wejściowych dodać NaCl do 0,3 M, 1 μl RNazy A, 10 μl 0,5 M EDTA, 20 μl 1 M Tris-HCl pH 6,5 i 1 μl proteinazy K (20 mg/ml).
15. Inkubować probówki przez noc w temperaturze 65 °C w suchym bloku grzewczym. Aby uniknąć parowania próbek, należy uszczelnić lub obciążyć probówki, aby zapobiec ich otwarciu. Można również użyć pieca do hybrydyzacji.
16. Pozwól probówkom ostygnąć do temperatury suchej temperatury. Dodać 1 ml 100% etanolu i inkubować przez 2 godziny przez noc w temperaturze -80 °C, aby wytrącić DNA.
17. Odwirować probówki o masie 16 000 x g przez 15 minut, aby uzyskać granulki DNA. Umyj osad DNA raz 70% etanolem i wysusz go na powietrzu. Zawiesić osad DNA w 100 μl autoklawizowanej wody destylowanej.
18. Oczyść DNA za pomocą kolumn wirowych QiaQuick i eluuj w całkowitej objętości 50 μl buforu elucyjnego. To DNA jest gotowe do użycia do PCR.

4. Przygotowanie reakcji PCR (wszystkie kroki muszą być przeprowadzone na lodzie)

1. Zbierz wszystkie próbki DNA z ChIP i odpowiadające im próbki wejściowe. Zbierz również wszystkie odczynniki i startery PCR dla regionu docelowego, a także regionu kontrolnego. Użyj polimerazy DNA Taq "gorącego startu". W tej procedurze użyjemy testu opartego na SYBR Green do ilościowego określenia amplifikacji DNA, ale w razie potrzeby można użyć zestawów qPCR mastermix.
2. Wykonaj szeregowe rozcieńczenie wejściowego DNA, aby wygenerować krzywą wzorcową w analizie qPCR: na przykład 10%, 1%, 0,1% i 0,01% w buforze elucyjnym (z kolumn wirowych QiaQuick w kroku 3.18). Zakres stężeń i przyrost tego standardowego zestawu szablonów krzywych może się różnić w zależności od oczekiwanych poziomów wzbogacenia ChIP itp. Dozować 10 μl wejściowych próbek DNA do odpowiednich dołków na 96-dołkowej płytce (Genemate, cat# T-3182-1), w dwóch egzemplarzach.
3. Dozować 10 ml DNA ChIP z kontroli izotypu, jak również specyficzne przeciwciało do odpowiednich studzienek, w trzech egzemplarzach.
4. Sporządzić "mieszankę wzorcową" zawierającą startery docelowe lub startery kontrolne (końcowe stężenie 0,1 μM każdego startera) i rozlać 10 μl do odpowiednich studzienek. Na przykład w poniższym szablonie należy dozować startery ukierunkowane zawierające mieszankę wzorcową do studzienek oznaczonych kolorem zielonym i dozować mieszankę wzorcową ze starterami kontrolnymi do studzienek oznaczonych kolorem czerwonym.
5. Przykryj płytkę PCR optyczną folią uszczelniającą z tworzywa sztucznego i odwiruj przy 500 x g w wirówce klinicznej (~1,200 obr./min) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby zebrać wszystko na dnie studzienki.
6. Rozpocznij reakcję PCR. W tym przykładzie użyjemy LightCycler 480 II (Roche) z oprogramowaniem LightCycler 480SW 1.5 do uruchomienia qPCR.

Wstępna inkubacja: 1 cykl: 95 °C/5 min.

Amplifikacja: 40-45 cykli: 94 °C/5 sek., 60 °C/5 sek., 72 °C/10 sek (temperatura wyżarzania powinna być o 2-3 °C niższa niż temperatura topnienia podkładów).

Krzywa topnienia: 1 cykl.

Chłodzenie: 1 cykl.

1 cyfra arabska 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ZA 10% Wejście 10% Wejście Izotypu specyficzny W 1% Wejście 1% Wejście Izotypu specyficzny Z Wejście 0,1% Wejście 0,1% Izotypu specyficzny D Wejście 0,01% Wejście 0,01% E 10% Wejście 10% Wejście Izotypu specyficzny Z 1% Wejście 1% Wejście Izotypu specyficzny Z Wejście 0,1% Wejście 0,1% Izotypu specyficzny H Wejście 0,01% Wejście 0,01%

Zielony: Użyj starterów dla wybranych regionów.

Czerwony: Użyj starterów regionu kontrolnego.

5. Analiza

1. Zaprogramować oprogramowanie qPCR do ilościowego oznaczania bezwzględnej ilości DNA. Co ważne, zastosowanie krzywej standardowej do interpolacji ilości DNA w nieznanych próbkach specyficznych i izotypowych pozwala na ocenę i dopasowanie jakości i wydajności wszystkich zestawów starterów w zakresie stężeń występujących w próbkach. Co więcej, zapewnia również bardziej wiarygodną metodę konwersji wartości Cq (C_{, t} lub C_{, p}) na końcowe względne wyniki wzbogacania fałdowania niż przy użyciu ΔΔCq i powiązanych metod.
2. Przejdź do edytora próbek i oznacz studzienki zawierające próbki wejściowe o różnych rozcieńczeniach (10%, 1%, 0,1% i 0,01%) ich standardowymi wartościami krzywej. Oznacz również studzienki nieznanymi próbkami ChIP, dokładnie tak, jak ułożona jest płytka PCR. W równoważnym oprogramowaniu stosowanym w innych maszynach qPCR należy odpowiednio oznaczyć podzbiory odpowiadające reakcjom dla każdej pary starterów, wartości krzywej wzorcowej oraz próbki eksperymentalnej i kontrolnej izotypu.
3. W oprogramowaniu LightCycler przejdź do edytora podzbiorów i zaznacz podzbiory, w tym studzienki z próbkami wejściowymi, a także nieznane próbki ChIP. Nieznane próbki zostaną określone ilościowo przy użyciu krzywej wzorcowej uzyskanej ze znanych stężeń próbek wejściowych do analizy. W równoważnym oprogramowaniu stosowanym w innych maszynach qPCR należy wyznaczyć podzbiory odpowiadające wszystkim reakcjom dla każdej pary starterów.
4. Po zakończeniu amplifikacji PCR przeprowadź analizę za pomocą "Abs Quant/2nd Derivative Max" i wybierz podzbiór do analizy i naciśnij OK. W równoważnym oprogramowaniu używanym w innych maszynach qPCR przelicz wartość Cq na ilość DNA w każdym podzbiorze.
5. Naciśnij "Oblicz", co spowoduje wygenerowanie krzywej wzorcowej przy użyciu znanych stężeń próbek wejściowych i wyświetli bezwzględną ilość DNA obecnego w nieznanych próbkach.
6. Jeśli jakość ściętego DNA jest dobra i jeśli startery wiążą się specyficznie z docelowym regionem, wydajność PCR powinna być bliska 2.
7. Wykonaj analizę krzywej topnienia za pomocą opcji "Tm Calling" dla tego samego podzbioru, jeśli jest dostępna. Pojedynczy pik oznacza, że tylko jeden konkretny produkt został wzmocniony. Amplifikację specyficznego DNA można również przetestować poprzez elektroforezę produktu PCR wraz z drabinką DNA przez żel agarozowy.
8. Eksportuj dane jako plik tekstowy rozdzielany tabulatorami, który można otworzyć w programie Microsoft Excel w celu dalszej analizy.
9. Korzystając z programu Microsoft Excel, podziel ilość DNA dla specyficznego przeciwciała z kontrolą izotypu dla docelowych starterów. Powtórz ten krok dla starterów regionu kontrolnego. Jeśli do różnych immunoprecypitacji stosuje się wiele przeciwciał tego samego izotypu, należy znormalizować każde z nich wartościami z tej samej kontrolnej izotypu. Ponadto, jeśli stosuje się wiele docelowych par starterów, do normalizacji każdego celu należy użyć ilości DNA z pojedynczego zestawu par starterów kontrolnych (ryc. 1 i 2). Wartości wyjściowe reprezentują swoiste wzbogacenie immunoprecypitacji przeciwciał w każdym miejscu w stosunku do immunoprecypitacji tła przeciwciał nieswoistych.
10. Podziel wzbogacenie fałdowania (do kontroli izotypu) dla starterów docelowych ze wzbogaceniem fałdowania (do kontroli izotypu) dla starterów regionu kontrolnego, aby uzyskać wzbogacenie względem kontrolnego regionu niezwiązanego (rysunek 1). Co ważne, należy zauważyć, że ze względu na generowanie krzywych wzorcowych z całkowitym wejściowym DNA dla każdej próbki, każda z powyższych wartości immunoprecypitacji interpolowana z krzywych standardowych jest już znormalizowana i wyrażona jako ułamek całkowitego wkładu przez oprogramowanie maszyny.
11. Jeżeli rygorystyczność stosowanych do immunoprecypitacji lub przemywania jest zbyt wysoka, możliwe jest, że zaobserwuje się solidną amplifikację z próbek immunoprecypitowanych specyficznymi przeciwciałami, podczas gdy amplifikacja z próbek immunoprecypitowanych kontrolnych izotypu nie będzie obserwowana. W takim scenariuszu lepiej jest odjąć ilość kontrolnego ChIP Isotype od specyficznego przeciwciała ChIP zarówno dla regionu docelowego, jak i regionu niezwiązanego. Względne wzbogacenie można obliczyć, dzieląc różnicę dla regionu docelowego przez różnicę dla regionu niezwiązanego (rysunek 3).

Results

Przedstawiony tutaj protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) kontroluje różnice, jeśli występują, w ilości DNA użytego w PCR poprzez użycie pary starterów, która amplifikuje niezwiązany region genomu, służąc w ten sposób jako "kontrola obciążenia". W przykładzie pokazanym na rysunku 3 użyliśmy regionu kodującego mysiego genu Actb jako regionu niezwiązanego z naszym białkiem będącym przedmiotem zainteresowania oraz miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego NFAT na mysim promotorze Il2

Discussion

Powyższy protokół zapewnia solidną metodę dokładnego ilościowego określania wzbogacenia DNA z pierwotnych limfocytów przy użyciu ChIP. Jednym z głównych powodów solidności tego protokołu jest uwzględnienie kontrprób biologicznych. Powyższy protokół wykorzystuje trzy powtórzenia, dla których wzbogacenie jest obliczane niezależnie. Wyniki są następnie uśredniane w celu zapewnienia stopnia wzbogacenia i odchyleń standardowych obliczanych w celu zapewnienia miary zmienności. Dla każdej próbki przeprowadza się również trzy ko...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyd	Sigma	F-8775	Przechowywać w RT
Fosforan buforowany solą fizjologiczną	hyklon	SH30256.01	Przechowywać w 4 stopniach; C
Inhibitor proteazy w tabletkach	Roche	04693116001	Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; Koraliki magnetyczne C
Białko G	Aktywny Motyw	101945	Przechowywać w 4 stopniach; C
RNaza A (20 mg / ml)	EMD Milipor	556746	Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
Proteinaza K (20 mg / ml)	Roche	03115879001	Rozpuścić w 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8,0
Polimeraza DNA Platinum Taq	Invitrogen	10966-034	Przechowywać w temperaturze -20 ° C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Przechowywać przy -20 ° C
1 M Glicyna			Przechowywać w RT
Bufor do lizy komórek (5 mM rury, pH 8,0; 85 mM KCl; 0,5% NP-40)			Przechowywać w temperaturze 4 ° C
Bufor do lizy jądrowej (50 mM Tris, pH 8,1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			Przechowywać w
RT Bufor rozcieńczający ChIP (0,01% SDS; 1,1% Triton X-100; 1,2 mM EDTA; 16,7 mM Tris pH 8,1; 190 mM NaCl)			Przechowywać w temperaturze 4 ° C
Bufor do przemywania o niskiej zawartości soli (0,1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8,1; 150 mM NaCl)			Przechowywać w temperaturze 4 & C
Bufor do płukania o wysokiej zawartości soli (0,1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8,1; 600 mM NaCl)			Przechowywać w temperaturze 4 stopni; Bufor
do płukania C LiCl (0,25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Deoksycholan sodu, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8,0)			Przechowywać w temperaturze 4 °
Bufor C TE (10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA)			Przechowywać w temperaturze 4 & Bufor
elucyjny C (1% SDS; 0,1 M NaHCO3)			Przygotuj świeży
5 M NaCl			Przechowywać w RT
0,5 M EDTA			Przechowywać w RT
1 M Tris-HCl, pH 6,5			Przechowywać w RT
Tabela specyficznych odczynników
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	Model: 421105
Stojak magnetyczny	Promega	Z5342
Zestaw do oczyszczania Qiaquick PCR	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Model: S3000
Spektrofotometr UV	NanoDrop Technologies	ND-1000
Blok grzewczy	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Wirówka stołowa z chłodzeniem	Beckman Coulter	Model: Mikrowirówka Allegra X-12R
	Eppendorf	5415 D
Tabela wyposażenia