Artykuł metodologiczny

Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty) Wzrost przy użyciu ludzkiej hemoglobiny jako źródła żelaza

DOI:

10.3791/50072

⸱

7 lutego 2013

 ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy test wzrostu Staphylococcus aureus przy użyciu hemoglobiny jako jedynego źródła dostępnego składnika odżywczego żelaza. Test ten określa rolę czynników bakteryjnych zaangażowanych w pozyskiwanie żelaza pochodzącego z hemoglobiny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus to bakteria chorobotwórczy, która potrzebuje żelaza do wykonywania ważnych funkcji metabolicznych i wywoływania chorób. Najobfitszym rezerwuarem żelaza wewnątrz ludzkiego gospodarza jest hem, który jest kofaktorem hemoglobiny. Aby pozyskać żelazo z hemoglobiny, S. aureus wykorzystuje skomplikowany system znany jako system determinantów powierzchni regulowanych żelazem (Isd)1. Składniki układu Isd najpierw wiążą hemoglobinę gospodarza, następnie ekstrahują i importują hem, a na końcu uwalniają żelazo z hemu w cytoplazmie bakteryjnej2,3. Szlak ten został przeanalizowany w licznych badaniach in vitro 4-9. Co więcej, udział systemu Isd w infekcji został wielokrotnie wykazany w modelachmysich 8,10-14. Ustalenie udziału systemu Isd w pozyskiwaniu i wzroście żelaza pochodzącego z hemoglobiny okazało się większym wyzwaniem. Testy wzrostu wykorzystujące hemoglobinę jako jedyne źródło żelaza są skomplikowane ze względu na niestabilność dostępnej na rynku hemoglobiny, zanieczyszczenie wolnego żelaza w pożywce wzrostowej oraz toksyczność związaną z chelatorami żelaza. Poniżej przedstawiamy metodę, która pozwala przezwyciężyć te ograniczenia. Wysokiej jakości hemoglobina jest przygotowywana ze świeżej krwi i jest przechowywana w ciekłym azocie. Oczyszczona hemoglobina jest uzupełniana do pożywki zubożonej w żelazo, naśladującej środowisko ubogie w żelazo, z którym spotykają się patogeny wewnątrz gospodarza kręgowców. Pozbawiając S. aureus wolnego żelaza i uzupełniając go minimalnie zmanipulowaną formą hemoglobiny, indukujemy wzrost w sposób, który jest całkowicie zależny od zdolności do wiązania hemoglobiny, ekstrakcji hemu, przepuszczania hemu przez otoczkę komórki bakteryjnej i degradacji hemu w cytoplazmie. Test ten będzie przydatny dla naukowców dążących do wyjaśnienia mechanizmów pozyskiwania żelaza pochodzącego z hemoglobiny/hemu w S. aureus i prawdopodobnie innych patogenach bakteryjnych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oczyszczanie hemoglobiny ze świeżej krwi

  1. Zdobądź świeżą ludzką krew uzupełnioną antykoagulantem. Krew powinna być utrzymywana na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez cały czas oczyszczania.
  2. Odwirowywać krew przez 20 minut przy 1 500 x g. Czerwone krwinki (RBC) będą znajdować się na dnie probówki. Ostrożnie odessać supernatant i delikatnie zawiesić osad w lodowatym roztworze NaCl o stężeniu 0,9% (w/v). Powtórz wirowanie i umyj 3 razy.
  3. Zawiesić osad w 1 objętości lodowatego 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Spowoduje to lizę erytrocytów z powodu ciśnienia osmotycznego. Dodaj toluen do ~ 20% końcowej objętości.
  4. Inkubować w temperaturze 4 °C na rożnie przez noc.
  5. Odwirować lizat przy 20 000 x g przez 1 godzinę. Zebrać środkową frakcję hemolizatu, pozostawiając toluen (unoszący się na wierzchu) i osad nietknięte. Użyj pipety z długą szyjką, aby zebrać środkową frakcję.
  6. Przepuścić przez filtr strzykawkowy 0,44 μm. Jeśli roztwór zawiera cząstki stałe i nie może zostać przepuszczony przez filtr, powtórz krok 1.5.
  7. Oczyść hemoglobinę (Hb) za pomocą kolumny anionowymiennej do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (Varian, PL-SAX 1,000 Å 8 μm, 150 mm × 4,6 mm). Faza ruchoma A to 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), a faza ruchoma B to 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. Gradient 0%-100% rozpuszczalnika B jest prowadzony przez 2 minuty przy natężeniu przepływu 2,0 ml/min. Elucja jest monitorowana na podstawie absorpcji (λ: 410 nm i 280 nm). Zbierz tylko frakcję charakteryzującą się jaskrawoczerwonym kolorem i wyraźnym pikiem absorpcji (ryc. 1).
  8. Odcień należy dializować w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez noc, a następnie ponownie przez kilka godzin. Sterylizować, przepuszczając przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
  9. Aby zmierzyć stężenie Hb, należy przygotować wzorcowe roztwory Hb o znanych stężeniach w PBS. Oznaczyć stężenie Hb w próbce, mieszając roztwory wzorcowe (patrz tabela z zastosowanymi odczynnikami) lub roztwór próbki z 2x odczynnikiem Drabkina (przygotowanym z proszku) w stosunku 1:1. Na przykład, zmieszaj 100 μl roztworu Hb ze 100 μl 2x odczynnik Drabkina na 96-dołkowych płytkach. Inkubować przez 15 minut i mierzyć absorbancję przy 540 nm. Wykreślić krzywą wzorcową i oznaczyć stężenie Hb w próbce. Typowe są plony od pięciu do piętnastu mg/ml.
  10. Uruchom 15-20 μg oczyszczonej hemoglobiny na 15% SDS-PAGE w dwóch egzemplarzach. Plamić jeden z żeli; przenieść białka z innego żelu na błonę nitrocelulozową i immunoblot dla hemoglobiny (ryc. 2).
  11. Zamrozić i przechowywać 1 ml podwielokrotności hemoglobiny w ciekłym azocie.

2. Przygotowanie pożywki wzrostowej zubożonej w żelazo

  1. Przygotuj bulion Roswell Park Memorial Institute (RPMI), rozpuszczając proszek RPMI w wodzie, dodając wodorowęglan sodu zgodnie z zaleceniami producenta i 1% kassaaminokwasów (CA) (w/v). Sterylizować, przechodząc przez filtr 0,2 μm i przechowywać w lodówce.
  2. Przygotuj zubożone w metale RPMI (NRPMI), dodając 7% (w/v) Chelex 100 i mieszając przez noc na talerzu mieszającym. Chelex 100 należy usunąć przez filtr 0,2 μm i przechowywać w lodówce. Pożywki uzupełniające niezbędnymi metalami nieżelaznymi: 25 μM ZnCl2, 25 μM MnCl2, 100 mM CaCl2 i 1 mM MgCl2 przygotowane wcześniej jako sterylny roztwór 1,000x. Na tym etapie użyj jednorazowych plastikowych pojemników, aby uniknąć zanieczyszczenia żelazem z materiałów wielokrotnego użytku.

3. Wzrost Staphylococcus aureus przy użyciu hemoglobiny jako jedynego źródła żelaza

  1. Smuga S. aureus do izolacji na agarze sojowym tryptycznym (TSA) z zamrożonego bulionu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20-24 godziny.
  2. Zawiesić etylenodiamino-N,N'-bis(kwas 2-hydroksyfenylooctowy) (EDDHA) w bezwodnym etanolu do 100 mM. EDDHA nie przechodzi do roztworu, ale jest sterylizowany etanolem.
  3. Dodaj EDDHA do RPMI do końcowego stężenia 0,5 mM. Pozwól EDDHA rozpuścić się przez co najmniej 30 minut przed przejściem do następnego kroku. Ze względu na różnice między partiami, końcowe stężenie EDDHA może wymagać obniżenia do 0,25 mM, aby umożliwić rozwój bakterii.
  4. Zaszczepić pojedyncze kolonie S. aureus w 5 ml RPMI zawierającym EDDHA w 15 ml stożkowych probówkach z nakrętką gwintowaną. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 180 obrotów na minutę (obr./min) przez 16-20 godzin.
  5. Odwirować nocne kultury przez 5 minut przy 7 500 x g i ponownie zawiesić osad w NRPMI zawierającym 0,5 mM EDDHA. Normalizuj OD600 do ~3.
  6. Przygotować NRPMI zawierający 2,5 μg na ml Hb i 0,1-1,0 mM EDDHA. Ze względu na różnice między partiami, stężenie EDDHA wymagane do chelatowania wolnego żelaza w NRPMI może się różnić.
  7. Subkultura: 10 μl zawiesiny bakteryjnej z etapu 3,5 do 1 ml NRPMI + EDDHA + Hb w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  8. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C przez okres do 48 godzin, wytrząsając przy 180 obr./min lub na bębnie toczącym.
  9. Co 6-12 godzin wykonuj odczyty OD600, usuwając 50 μl kultury i mieszając ją ze 150 μl PBS w 96-dołkowych płytkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyściliśmy ludzką hemoglobinę z hemolizatu za pomocą HPLC (krok protokołu 1.7). Rysunek 1 przedstawia zarejestrowaną absorbancję eluatu przy długościach fal 280 i 410 nm. Frakcję 5 zebrano, a pozostałe frakcje wyrzucono. Zwykle uzyskuje się wydajność od pięciu do piętnastu miligramów hemoglobiny na mililitr eluatu. Oczyszczoną hemoglobinę analizowano za pomocą SDS-PAGE w dwóch egzemplarzach, a żele wybarwiono na białka lub przeniesiono na nitrocelulozę i poddano immunobloblocie (krok protokołu 1.10,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żelazo jest niezbędnym składnikiem odżywczym potrzebnym organizmom ze wszystkich królestw życia15. U kręgowców żelazo jest sekwestrowane, aby uniknąć toksyczności spowodowanej przez ten pierwiastek. Ta sekwestracja ukrywa również żelazo przed atakującymi drobnoustrojami w procesie znanym jako odporność odżywcza16. W odpowiedzi patogeny wyewoluowały strategie, które omijają odporność odżywczą. Jeden z takich mechanizmów opiera się na hemoglobinie, która jest najobfitszym źródłem żelaza w organizmie g...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty Publicznej Służby Zdrowia Stanów Zjednoczonych AI69233 i AI073843 z Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych. E.P.S. jest stypendystą Burroughs Wellcome Fellow w dziedzinie patogenezy chorób zakaźnych. K.P.H. został sfinansowany z grantu Cellular and Molecular Microbiology Training Program 5 T32 A107611-10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolumna wymiany anionów HPLCVarianPL1551-3802
Odczynnik DrabkinaSigmaD5941-6VL
Wzorzec hemoglobinyPointe ScientificH7506-STD
RPMIHyCloneSH30011.02
Chelex 100 forma soduSigmaC7901
EDDHALGC Standards GmbHANC 001
Przeciwciało przeciwko hemoglobinie ASanta Cruz Biotechnology, IncSC-21005
Tryptyczny agar sojowyBD236920

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535(2012).
  3. Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
  4. Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
  5. Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
  6. Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
  7. Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
  8. Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
  9. Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
  10. Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
  11. Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
  12. Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
  13. Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
  14. Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
  15. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  16. Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
  17. Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
  18. Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
  19. Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
  20. Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
  21. Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
  22. Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).
  23. Williams, R. C. Jr, Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
  24. Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
  25. Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
  26. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
  27. Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
  28. Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie hemoglobinypo ywka z obni on zawarto ci elazawysokosprawna chromatografia cieczowast enie hemoglobinytest wzrostu bakteriichelatowanie elazaSDS PAGEimmunoblottingprzechowywanie w ciek ym azocie

Powiązane artykuły