Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

13.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50076

⸱

23 czerwca 2013

 ,  , 
1The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Streszczenie

Ochrona przed chorobami zakaźnymi jest wspierana przez układ odpornościowy 1,2. Limfocyty T są głównymi koordynatorami układu odpornościowego, regulującymi aktywację i odpowiedzi wielu komórek odpornościowych 3,4. Aktywacja limfocytów T zależy od rozpoznania specyficznych antygenów wyświetlanych przez komórki prezentujące antygen (APC). Receptor antygenu limfocytów T (TCR) jest specyficzny dla każdego klonu komórek T i określa swoistość antygenu 5. Wiązanie TCR z antygenem indukuje fosforylację składników kompleksu TCR. Aby promować aktywację limfocytów T, sygnał ten musi zostać przetransdukowany z błony do cytoplazmy i jądra, inicjując różne kluczowe odpowiedzi, takie jak rekrutacja białek sygnałowych do TCR; APC (synapsa immunologiczna), ich aktywacja molekularna, przegrupowanie cytoszkieletu, zwiększenie wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i zmiany w ekspresji genów 6,7. Prawidłowa inicjacja i zakończenie sygnałów aktywujących ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej odpowiedzi limfocytów T. Aktywność białek sygnałowych zależy od tworzenia i kończenia interakcji białko-białko, modyfikacji potranslacyjnych, takich jak fosforylacja białek, tworzenie kompleksów białkowych, ubikwitylacja białek i rekrutacja białek do różnych miejsc komórkowych 8. Zrozumienie wewnętrznego działania procesu aktywacji limfocytów T ma kluczowe znaczenie zarówno dla badań immunologicznych, jak i zastosowań klinicznych.

Opracowano różne testy w celu zbadania interakcji białko-białko; jednak testy biochemiczne, takie jak szeroko stosowana metoda koimmunoprecypitacji, nie pozwalają na rozpoznanie lokalizacji białka, co uniemożliwia obserwację cennych spostrzeżeń na temat dynamiki mechanizmów komórkowych. Dodatkowo, te masowe testy zwykle łączą białka z wielu różnych komórek, które mogą znajdować się na różnych etapach badanego procesu komórkowego. Może to mieć szkodliwy wpływ na rozdzielczość czasową. Wykorzystanie obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym pozwala zarówno na przestrzenne śledzenie białek, jak i na możliwość czasowego rozróżniania zdarzeń sygnalizacyjnych, rzucając w ten sposób światło na dynamikę procesu 9,10. Przedstawiamy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym powstawania kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji limfocytów T. Pierwotne limfocyty T lub linie komórek T, takie jak Jurkat, są transfekowane plazmidami kodującymi interesujące białka połączone z monomerycznymi białkami fluorescencyjnymi, zapobiegając niefizjologicznej oligomeryzacji 11. Żywe limfocyty T umieszcza się na szkiełku nakrywkowym wstępnie pokrytym przeciwciałem aktywującym limfocyty T 8,9, które wiąże się z kompleksem CD3 / TCR, indukując aktywację limfocytów T, jednocześnie pokonując potrzebę stosowania specyficznych antygenów aktywujących. Aktywowane komórki są stale obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Dane obrazowe są analizowane w celu uzyskania wyników ilościowych, takich jak współczynnik kolokalizacji białek sygnałowych.

Protokół

1. Transfekcja komórek T

  1. Przygotować aktywowany roztwór Amaxa Nucleofector poprzez zmieszanie roztworu "Suplementu" z zestawu z roztworem Nucleofectora. Aktywowany roztwór może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do trzech miesięcy.
  2. Hoduj limfocyty T Jurkata w pożywce hodowlanej [10% płodowa surowica cielęca (FCS), 1% roztwór penicyliny-streptomycyny i 2 mM L-glutaminy w RPMI]. Optymalnie komórki należy zużyć 1-2 tygodnie po rozmrożeniu. Wykorzystanie kultur komórkowych we wzroście logarytmicznym ma kluczowe znaczenie dla wysokiej wydajności transfekcji i przeżycia komórek. Alternatywnie, z niewielkimi modyfikacjami, protokół ten może być stosowany z pierwotnymi limfocytami T, jak opisano wcześniej 8. Należy podkreślić, że ponieważ czas trwania procesu aktywacji pierwotnych limfocytów T jest dłuższy niż w przypadku limfocytów T Jurkat (~30 min), należy zastosować system inkubacji zamontowany na stoliku mikroskopowym, aby utrzymać poziomCO2, wilgotności i temperaturę przez cały proces aktywacji.
  3. Zebrać 5 × 106 limfocytów T z fazą logarytmiczną na transfekcję do probówki o pojemności 15 ml.
  4. Wirować komórki przez 7 minut w temperaturze 400 × g w temperaturze pokojowej.
  5. Podczas wirowania przygotuj płytkę 6-dołkową. Napełnić jedną studzienkę na każdą transfekcję 5 ml pożywki hodowlanej i przeprowadzić wstępną inkubację w temperaturze 37 °C.
  6. Zebrać probówki z wirówki i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml RPMI.
  7. Wirować komórki przez 7 minut w temperaturze 400 × g w temperaturze pokojowej.
  8. Podczas wirowania przygotuj roztwór do transfekcji. W jednym dołku 96-dołkowej płytki wymieszać aktywowane 100 μl roztworu Amaxa Nucleofector przygotowanego w kroku 1 z 5 μg DNA interesującego plazmidu kodującego fluorescencyjnie znakowane białko. Optymalnie stężenie DNA powinno być większe niż 1 μg/ml, aby uniknąć rozcieńczania roztworu do transfekcji.
  9. Dobrze wymieszać delikatnym pipetowaniem.
  10. Po odwirowaniu komórek ostrożnie usunąć cały supernatant, nie naruszając osadu.
  11. Dwukrotnie odpipetować roztwór DNA/roztwór do transfekcji.
  12. Dodać roztwór DNA/transfekcji do osadu.
  13. Przenieś ogniwa do kuwety Axa.
  14. Włóż kuwetę do urządzenia Amaxa Nucleofector .
  15. Użyj ustawienia transfekcji H-10 Amaxa do elektroporacji (dla Jurkat) lub T-23 (dla pierwotnych limfocytów T).
  16. Wyjąć płytkę 6-dołkową z inkubatora.
  17. Po elektroporacji ostrożnie przenieść supernatant z zawiesiną komórek na płytkę 6-dołkową za pomocą pipety Pasteura. Może powstać osad składający się z resztek komórek. Unikaj przenoszenia granulki.
  18. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
  19. Przenieść 2,5 ml zawiesiny komórkowej z każdej studzienki do nowej studzienki. Dodać 2,5 ml ciepłej pożywki hodowlanej (opisanej w kroku 2) do każdej studzienki.
  20. Po 72 godzinach przenieść komórki do sterylnej probówki i wirować przez 7 minut w temperaturze 400 × g w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i zastąpić go pożywką hodowlaną uzupełnioną antybiotykiem selekcyjnym odpowiednim dla zastosowanego plazmidu (zastosować stężenie odpowiednie dla zastosowanych antybiotyków; użyliśmy G418 i/lub higromycyny w stężeniach odpowiednio 1,3 mg/ml i/lub 0,2 mg/ml). Hoduj zawiesinę komórkową w świeżej studzience. Alternatywnie, komórki mogą być transfekowane przejściowo i obrazowane 48 godzin po transfekcji. Aby przygotować przejściowo transfekowane komórki, należy jednocześnie przetransfekować komórki z dwoma plazmidami w kroku 8, normalnie kontynuując do kroku 20, a następnie przejść bezpośrednio do kroku 23. Należy pamiętać, że w tym scenariuszu ogniwa powinny być używane natychmiast, a generalnie ich intensywność fluorescencji jest niejednorodna i niekoniecznie wysoka.
  21. Hoduj komórki za pomocą pożywki hodowlanej uzupełnionej odpowiednim antybiotykiem selekcyjnym. Podziel komórki i w razie potrzeby uzupełnij je pożywką hodowlaną uzupełnioną antybiotykiem.
  22. Po 2 tygodniach sprawdź, czy transfekcja przebiegła pomyślnie za pomocą FACS (sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją) w następujący sposób:
  23. Zbierz 106 transfekowanych komórek, 106 pozorowanych transfekowanych komórek (kontrola negatywna) i 106 komórek, o których wiadomo, że stabilnie wyrażają fluorescencyjnie znakowane białko. Jeśli komórki są transfekowane więcej niż jednym białkiem fluorescencyjnym (patrz krok 27), użyj wielu, pojedynczo oznakowanych linii komórkowych jako kontroli pozytywnej.
  24. Wirować komórki przez 7 minut w temperaturze 400 × g w temperaturze pokojowej.
  25. Odrzucić supernatant. Zawieś komórki w buforze FACS o pojemności 500 μl (PBS bez Ca2+ i Mg2+, 5% FCS, 0,05% azydku sodu).
  26. Użyj analitycznego FACS, aby zweryfikować fluorescencję komórkową. Porównaj fluorescencję transfekowanych komórek z fluorescencją kontroli negatywnej i pozytywnej.
  27. Aby transfekować komórki dodatkowym, znakowanym fluorescencyjnie białkiem, powtórz kroki 3-26 przy użyciu transfekowanych komórek.
  28. Należy stosować ogniwa wykazujące wysoki poziom fluorescencji. Optymalnie co najmniej 50% komórek w hodowli powinno być wysoce fluorescencyjnych. Fluorescencja komórek może być zwiększona przez sortowanie komórek za pomocą FACS.

Wszelkie dodatkowe oznaczone białka muszą być połączone z różnymi fluoroforami i zakodowane na plazmidach kodujących różne antybiotyki selekcyjne. Pożywka selekcyjna dla komórek transfekowanych więcej niż jednym plazmidem powinna być uzupełniona wszystkimi odpowiednimi antybiotykami.

2. Przygotowanie testu rozprzestrzeniania limfocytów T

  1. Stosować 4-komorowe szkiełka nakrywkowe Lab-Tek II German coverglass. Należy uważać, aby przypadkowo nie zarysować wewnętrznej powierzchni komór, np. końcówką pipety, podczas przygotowywania lub użytkowania.
  2. Przygotuj 50 ml roztworu do przygotowania szkiełek: Weź 4,6 ml 12 M (37%) HCl, dodaj 38,5 ml 100% etanolu i 6,9 ml podwójnie destylowanej wody.
  3. Napełnić każdą komorę szkiełka roztworem do przygotowywania szkiełek o stężeniu 500 μl.
  4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  5. Zassać komory, całkowicie je wysuszając.
  6. Inkubować odkryte szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze 45 °C aż do całkowitego wyschnięcia.
  7. Przygotować 0,01% roztwór poli-L-lizyny, rozcieńczając 0,1% poli-L-lizyny (Sigma-Aldrich) w podwójnie destylowanej wodzie.
  8. Nanieść 500 μl na każdą komorę.
  9. Inkubować szkiełko przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Zassać komory, całkowicie je wysuszając.
  11. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 45 °C aż do całkowitego wyschnięcia.
  12. Szkiełka powlekane można przechowywać w suchym stanie przez kilka miesięcy w temperaturze pokojowej.
  13. Przygotować aktywujący roztwór przeciwciała. Użyj przeciwciała anty-CD3: HIT3a (BD Pharmingen, #555337) lub UCHT1 (BD Pharmingen, #555330), 10 μg/ml w 400 μl PBS na komorę. Roztwór ten należy przygotować na krótko przed przygotowaniem preparatu.
  14. Napełnij każdą komorę 400 μl roztworu przeciwciała aktywującego.
  15. Inkubować szkiełko przez 2 godziny w temperaturze 37 °C lub, najlepiej, przez noc, w temperaturze 4 °C.
  16. Usunąć aktywujący roztwór przeciwciała i natychmiast przemyć komorę dwukrotnie 300 μl PBS. Od tego momentu upewnij się, że komory pozostają wypełnione buforem.
  17. Przechowywać szkiełko wypełnione PBS w temperaturze 4 °C. Sugerujemy wykorzystanie przygotowanych komór szkiełkowych w ciągu 1 tygodnia.

3. Aktywacja i obrazowanie limfocytów T

  1. Przygotować bufor obrazowania [1,25 ml HEPES (1 M), 10 ml FCS, 38,75 ml RPMI bez czerwieni fenolowej]. Bufor obrazowania może być przechowywany w temperaturze 4 °C po filtracji.
  2. Aktywuj mikroskop Zeiss LSM 510 Meta. Rozgrzej podgrzewaną ramę montażową mikroskopu do 37 °C. Wybierz "Tryb eksperta".
  3. Kliknij zakładkę "Nabycie" i otwórz następujące zakładki: Lasery; Mikroskopia; Konfiguracja; Skanować; Szeregi czasowe.
  4. Aktywuj potrzebne lasery. W celu wzbudzenia mCFP i mYFP należy ustawić laser Argon/2 w trybie "czuwania" na 5 minut, a następnie w trybie "włączonym".
  5. Jeśli wykonałeś wcześniej ten test obrazowania żywych komórek przy użyciu tych samych fluoroforów, otwórz wynikowy plik LSM, kliknij ikonę "użyj ponownie" i kontynuuj od kroku 9. W przeciwnym razie kontynuuj od kroku 6.
  6. Zdefiniuj kanały za pomocą filtrów odpowiednich do wzbudzenia i emisji użytych białek fluorescencyjnych.
  7. W oknie "Kontrola skanowania" wybierz opcję stosu Z.
  8. Wprowadź następujące parametry skanowania: Liczba plasterków: 5; Interwał: 0,5 μm; Bieżący wycinek: 3.
  9. Przygotować cyfrową suchą kąpiel Accublock (Labnet) w temperaturze 37 °C w pobliżu mikroskopu.
  10. Ogrzać bufor obrazowania do temperatury 37 °C.
  11. Przygotować zapisany preparat, zasysając PBS, zastępując go 600 μl ciepłego buforu do obrazowania.
  12. Inkubować szkiełko w temperaturze 37 °C. Przechowywać szkiełko w inkubatorze do etapu 13, przez co najmniej 15 minut.
  13. Zbierz 5 × 105 transfekowanych limfocytów T.
  14. Wirować komórki przez 2 minuty w temperaturze 400 × g.
  15. Odrzucić supernatant.
  16. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml ciepłym buforze obrazowania i przenieść je do 1,5 ml probówki Eppendorfa.
  17. Umieść probówkę w cyfrowej suchej kąpieli Accublock.
  18. Wyjmij podgrzane szkiełko z inkubatora i zamontuj je na rozgrzanej ramie montażowej mikroskopu.
  19. Kliknij ikonę "VIS".
  20. Wymieszać zawiesinę komórkową i usunąć 1-2 μl.
  21. Włożyć końcówkę pipety do bufora obrazowania znajdującego się nad dolną częścią szkiełka. Unikaj zarysowania zjeżdżalni.
  22. Zasiej komórki nad otworem obiektywu.
  23. Natychmiast zacznij wizualnie śledzić komórki fluorescencyjne w miarę ich opadania. Wybierz komórkę, która wyświetla wysoką fluorescencję w obu kanałach.
  24. Zanim komórka dotrze do powierzchni szkiełka, aktywuj tryb LSM.
  25. Przełącza tylko jeden laser wzbudzenia. Wybierz laser, dla którego masz kanał DIC.
  26. Ustaw wartość Zoom na 1. Kliknij ikonę "Szybki XY". Kliknij ikonę "Zatrzymaj". Za pomocą narzędzia Kadrowanie wybierz obszar zwrotu wyśrodkowany na komórce.
  27. Ustaw wartość Zoom na 3. Kliknij ikonę "Szybki XY", a następnie ręcznie ustaw fokus, aby optymalnie wyświetlić komórkę. Kliknij ikonę "Zatrzymaj".
  28. Przełącz wszystkie potrzebne lasery wzbudzenia.
  29. Rozpocznij nagrywanie, klikając ikonę "StartT". Zobrazuj komórkę dla całego procesu rozprowadzania (zwykle 5 minut). Po zakończeniu kliknij ikonę "Zatrzymaj".
  30. Zapisz plik.
  31. Aby uzyskać dodatkowe komórki, kliknij ikonę "VIS". Jeśli istnieją komórki, które nie zetknęły się jeszcze z dnem szkiełka, przejdź do kroku 23. Unikaj obrazowania komórek, które już rozpoczęły proces rozprzestrzeniania się. W przeciwnym razie przejdź do kroku 32.
  32. Jeśli obserwowany obszar slajdu jest w większości pozbawiony komórek, dodaj kolejną porcję komórek (kontynuuj od kroku 20). W przeciwnym razie przejdź do kroku 33.
  33. Aby uzyskać dodatkowe komórki, przesuń suwak tak, aby obszar nad otworem obiektywu był pozbawiony komórek.
  34. Dodaj kolejną porcję komórek (i kontynuuj od kroku 20).
  35. Po wykonaniu wszystkich żądanych czynności obrazowania otwórz zapisany plik LSM.
  36. Kliknij "Galeria", "Czas + Z" i "Podzbiór".
  37. Wybierz odpowiedni zakres czasu i stos Z.
  38. Zapisz nowy plik.
  39. Wykonaj kroki 35-38 dla wszystkich plików obrazowania.

4. Analiza danych obrazowania

  1. Otwórz pliki LSM za pomocą oprogramowania Imaris (Bitplane AG, Zurych, Szwajcaria).
  2. Kliknij "Prześcignij". Kliknij menu "Przetwarzanie obrazu" i wybierz "Czas zamiany i Z". Pomoże to w prawidłowym przycięciu obrazu.
  3. Kliknij pasek narzędzi "Edytuj" i wybierz opcję "Przytnij 3D" z menu rozwijanego. Przytnij obraz tak, aby obejmował tylko obszar otaczający komórkę. Sugerujemy przycięcie kwadratu o wymiarach 300 × 300 pikseli wyśrodkowanego na komórce. Należy pamiętać, że kształt i położenie komórki mogą się zmieniać w czasie. Obserwując oś t, upewnij się, że komórka znajduje się w przyciętym obszarze we wszystkich punktach czasu.
  4. Kliknij menu "Przetwarzanie obrazu" i wybierz "Zamień czas i Z", aby przywrócić oryginalną separację czasową obrazu.
  5. Naciśnij przycisk "Coloc" na głównym pasku narzędzi. Wybierz "Dep. Build Time Dep. Coloc". Imaris automatycznie obliczy progi intensywności dla każdego kanału w każdym punkcie czasowym.
  6. Zobacz wyniki analizy kolokalizacji, wybierając opcję "Statystyki kanału". Wyeksportuj dane, klikając "Eksportuj".
  7. Powtórz kroki od 1 do 6 dla każdej obrazowanej komórki. Zalecamy przeanalizowanie w ten sposób co najmniej 50 komórek.
  8. Oblicz średni współczynnik kolokalizacji Pearsona i jego błąd standardowy lub odchylenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiamy przykład obrazowania i analizy żywych limfocytów T. Przed eksperymentem obrazowania limfocyty T z niedoborem SLP76 (J14) poddano analizie FACS w celu określenia ekspresji białek fluorescencyjnych (Rysunek 1). Limfocyty T przetransfekowane znakowanymi białkami sygnałowymi mCFP-Nck i SLP76-mYFP naniesiono na płytki aktywujące i obrazowano podczas rozprzestrzeniania się komórek T (Rysunek 2). Zebrane obrazy pokazują dynamikę lokalizacji białek podczas aktywacji i rozprzestrzen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Regulacja i funkcja wielu procesów komórkowych zależy od tworzenia i kończenia interakcji białko-białko. Obrazowanie mikroskopowe umożliwia śledzenie w czasie rzeczywistym fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach. Kolokalizacja znakowanych białek może sugerować bezpośrednią lub pośrednią interakcję między białkami i może być wykorzystana do wzmocnienia wyników uzyskanych metodami biochemicznymi, takimi jak immunoprecypitacja. W przeciwieństwie do metod biochemicznych, obrazowanie żywych komórek umożliwia ob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy żadnych konfliktów interesów, które moglibyśmy ujawnić.

Podziękowania

Autorzy dziękują Sophii Fried za pomoc techniczną. MBS dziękuje następującym agencjom za wsparcie badawcze: Izraelskiej Fundacji Naukowej za granty nr 1659/08, 971/08, 1503/08 i 491/10, Ministerstwu Zdrowia i Nauki za granty nr 3-4114 i 3-6540, Izraelskiemu Stowarzyszeniu Walki z Rakiem za pośrednictwem Majątku zmarłego Alexandra Smidody oraz Fundacji Rodziny Taubenblatt za grant na doskonałość w dziedzinie biomedycyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik/Materiał
Amaxa zestaw nukleofektorów ludzkich limfocytów TLonzaVCA-1002
Anti CD3 (klon UCHT1) Rurki BioLegend300432
Falcon FACSBecton Dickinson352058
FCSHyCloneSV30160.03
G418Calbiochem345810
Niemiecki system szkła nakrywkowego 4 komorowe szkiełka Lab-Tek II155382
HClBio Lab8410501
Hepes Biological Industries03-025-1B
HygomycynaEnzoALX-380-306
L-glutamina SigmaG7513
PBS (10X)SigmaD1408
Penicylina-Streptomycyna SigmaP0781
Poli-L-lizyna 0,1 % (w/v) w H2OSigmaP8920
RPMISigmaR87589
Azydek soduSigmaS2002
Sprzęt
Cyfrowa sucha kąpiel AccublockLabnetD1105A
WirówkaEppendorfWirówka 5810 R
Mikroskop konfokalnyZeissLSM 510 Meta
Podgrzewana rama montażowa - Wkład grzewczy PS PeCon130-800-031
TempModule S (wymagany do podgrzewanej ramy montażowej)Zeiss411860-9010-000
Urządzenie do elektroporacjiAmaxaNucleofector I
Aktywowany fluorescencją sortownik komórekBecton DickinsonFACSVantage SE
Oprogramowanie do analizy obrazuBitplane7.0.0

Bibliografia

  1. Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
  2. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
  3. Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
  4. Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
  5. Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
  6. Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
  7. Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
  8. Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
  9. Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
  10. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
  11. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
  12. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
  13. Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
  14. Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
  15. Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
  16. Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
  17. Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
  18. Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia konfokalnaInterakcje białko-białkoBiałka fluorescencyjneAktywacja limfocytów TSynapsa immunologicznaAnaliza kolokalizacjiKomórki JurkatKompleks TCR
Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.