Izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy

Podsumowanie

Astrocyty zostały uznane za wszechstronne komórki uczestniczące w podstawowych procesach biologicznych, które są niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu oraz naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Tutaj przedstawiamy szybką procedurę uzyskiwania czystych hodowli astrocytów myszy w celu zbadania biologii tej głównej klasy komórek ośrodkowego układu nerwowego.

Streszczenie

Astrocyty są licznym typem komórek w mózgu ssaków, jednak wiele pozostaje do nauczenia się o ich cechach molekularnych i funkcjonalnych. Systemy hodowli komórek astrocytów in vitro mogą być wykorzystywane do szczegółowego badania funkcji biologicznych tych komórek glejowych. Ten protokół wideo pokazuje, jak uzyskać czyste astrocyty poprzez izolację i hodowlę mieszanych komórek korowych młodych myszy. Metoda opiera się na braku żywotnych neuronów i oddzieleniu astrocytów, oligodendrocytów i mikrogleju, trzech głównych populacji komórek glejowych ośrodkowego układu nerwowego, w hodowli. Reprezentatywne obrazy z pierwszych dni hodowli wykazują obecność mieszanej populacji komórek i wskazują punkt czasowy, w którym astrocyty stają się zlewające i powinny być oddzielone od mikrogleju i oligodendrocytów. Ponadto wykazujemy czystość i morfologię astrocytów hodowanych astrocytów za pomocą barwień immunocytochemicznych dla dobrze znanych i nowo opisanych markerów astrocytów. Ten system hodowli może być łatwo wykorzystany do uzyskania czystych astrocytów myszy i pożywki kondycjonowanej przez astrocyty do badania różnych aspektów biologii astrocytów.

Wprowadzenie

Astrocyty są bardzo licznym typem komórek w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Stosunek astrocytów do neuronów wynosi 1:3 w korze myszy i szczurów, podczas gdy w ludzkiej korze 1 na neuron przypada ^1,4 astrocytów. Zainteresowanie funkcją astrocytów dramatycznie wzrosło w ostatnich latach. Kluczową funkcją astrocytów jest ich rola w zapewnianiu neuronom strukturalnego i metabolicznego wsparcia ^2,3. Nowo odkryte role astrocytów obejmują szerokie spektrum funkcji. Obejmują one kierowanie migracją rozwijających się aksonów i niektórych neuroblastów podczas rozwoju^4-6, funkcje w przekaźnictwie synaptycznym, siłę synaps i przetwarzanie informacji przez obwody neuronalne ^7-9, role w tworzeniu bariery krew-mózg (BBB) 10 i integralności ^11-13 oraz regulację napięcia naczyniowo-mózgowego ¹⁴ . Inną ważną cechą astrocytów jest ich reakcja na urazy. W warunkach patologicznych astrocyty stają się reaktywne i dalej zwiększają ekspresję pośrednich białek fibrylarnych fibrylarnych glejowych (GFAP) i hamujących białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) ^15,16. Reaktywne astrocyty oddzielają miejsce urazu od zdrowej tkanki, tworząc bliznę glejową, która składa się głównie z wydzielanych przez astrocyty białek ECM z rodziny proteoglikanów siarczanu chondroityny (CSPG), głównych czynników hamujących regenerację aksonów po uszkodzeniu OUN ^15-17.

Astrocyty pochodzą z promieniowych komórek glejowych (RG) w późnym okresie embriogenezy i wczesnego życia pourodzeniowego. Po określeniu astrocytów prekursory astrocytów migrują do swoich końcowych pozycji, gdzie rozpoczynają proces końcowego różnicowania. In vivo astrocyty wydają się być dojrzałe trzy do czterech tygodni po urodzeniu, na co wskazuje ich typowa morfologia ^18,19. Subpopulacja komórek RG przekształca się w astrocyty strefy podkomorowej (komórki typu B). Zarówno komórki RG, jak i komórki typu B funkcjonują jako podobne do astrocytów nerwowe komórki macierzyste (NSC) odpowiednio podczas rozwoju i u osoby dorosłej. Podobnie jak astrocyty, komórki RG i typu B również wyrażają transporter glutaminianu specyficzny dla astrocytów (GLAST), białko wiążące lipidy w mózgu (BLBP) i GFAP, co wskazuje, że markery te nie mogą być używane wyłącznie do specyficznego znakowania dorosłych astrocytów. W przeciwieństwie do dorosłych astrocytów miąższowych, które nie dzielą się w zdrowym mózgu, komórki RG i typu B wykazują potencjał komórek macierzystych, taki jak zdolność do samoodnawiania. Rozregulowanie astrocytów jest związane z wieloma patologiami, w tym z chorobą Alzheimera ^20,21, chorobą Huntingtona ²², chorobą Parkinsona ²³, zespołem Retta ²⁴ i chorobą Alexandra ²⁵. Co więcej, astrocyty reagują na wszelkie uszkodzenia OUN, co prowadzi do aktywacji astrocytów i tworzenia się astrocytowych blizn glejowych ^16,26. Uważa się, że astrocytowa blizna glejowa, która powstaje w wyniku urazu mózgu lub urazu rdzenia kręgowego, jest główną barierą zapobiegającą regeneracji neuronów ¹⁵.

Rozwój niezawodnych metod izolowania i utrzymywania oczyszczonych populacji komórek był niezbędny dla naszego zrozumienia układu nerwowego. Pionierskie prace McCarthy'ego i de Vellisa umożliwiły badaczom przygotowanie niemal czystych kultur astrocytów z tkanki noworodków szczurów ²⁷. Wiele dowiedziano się o biologii astrocytów przy użyciu tej metody, która jest tutaj przedstawiona w nieco zmodyfikowanej formie do izolowania astrocytów korowych myszy. Uzupełnieniem badań in vivo, astrocyty, a także kondycjonowana pożywka uzyskana przy użyciu opisanej kultury in vitro, są cennymi narzędziami do dalszego uzyskiwania wglądu w funkcje astrocytów.

Protokół

1. Izolacja i posiewanie mieszanych komórek korowych

Mieszana izolacja komórek korowych dla kultur astrocytów może być przeprowadzona przy użyciu mysich szczeniąt P1 do P4. W celu uzyskania odpowiedniej gęstości astrocytów konieczne jest użycie 4 kory mózgowej młodych myszy na kolbę do hodowli tkankowej T75. Dlatego objętości w poniższym protokole są obliczane dla preparatu komórkowego przy użyciu 4 mysich szczeniąt.

1. Przed rozpoczęciem procedury preparacji należy ogrzać 30 ml pożywki do hodowli astrocytów (DMEM, wysoka zawartość glukozy + 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej + 1% penicyliny/streptomycyny; patrz tabela) do temperatury 37 °C. Pokryć jedną kolbę T75 20 ml poli-D-lizyny (PDL) o stężeniu 50 μg/ml w wodzie o czystości do hodowli komórkowych przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ .
2. Do procedury preparacji przygotuj wszystkie niezbędne odczynniki i materiały. Potrzebne będą: nożyczki chirurgiczne, gładkie kleszcze drobnoziarniste, kleszczyki z płaską końcówką, ręczniki papierowe, worek na odpady, 70% etanolu i 2 naczynia preparacyjne (o średnicy 3,5 cm) na lodzie wypełnione po 2 ml HBSS każda.
3. Delikatnie przytrzymaj i spryskaj głowę i szyję szczeniaka myszy 70% etanolem. Zwierzę składa się w ofierze przez ścięcie głowy za pomocą nożyczek.
4. Wykonaj nacięcie w linii środkowej, od tyłu do przodu, wzdłuż skóry głowy, aby odsłonić czaszkę.
5. Ostrożnie przeciąć czaszkę od szyi do nosa. Wykonuje się dwa dodatkowe cięcia, aby umożliwić dalszy dostęp do mózgu: pierwsze cięcie wykonuje się przed opuszkami węchowymi, drugie poniżej móżdżku, aby odłączyć czaszkę od podstawy czaszki.
6. Za pomocą kleszczy z płaską końcówką płaty czaszki są delikatnie odchylane na bok, a mózg jest wyjmowany i umieszczany w pierwszym naczyniu preparacyjnym wypełnionym HBSS. Umieść naczynie z powrotem na lodzie i kontynuuj zbieranie wszystkich 4 mózgów.
7. Pozostała część procedury preparacji jest wykonywana pod mikroskopem stereoskopowym. Najpierw opuszki węchowe i móżdżek są usuwane za pomocą cienkich kleszczy preparacyjnych (ryc. 1B).
8. Aby odzyskać korę, chwyć tylny koniec mózgu cienkimi kleszczami, wykonaj nacięcie w linii środkowej między półkulami, włóż drugi zestaw kleszczy do utworzonego zagajnika i oderwij płytkowatą strukturę kory od mózgu.
9. Ostrożnie wypreparuj opony mózgowe z półkul kory, ciągnąc cienkimi kleszczami (ryc. 1D'). Ten etap pozwala uniknąć zanieczyszczenia końcowej hodowli astrocytów komórkami opon mózgowych i fibroblastami. Przenieś przygotowane półkule kory mózgowej do drugiego naczynia wypełnionego HBSS i umieść je z powrotem na lodzie. Kontynuuj odpowiednio ze wszystkimi 4 korami.
10. Na koniec pokrój każdą półkulę kory na małe kawałki za pomocą ostrych ostrzy (około 4 do 8 razy).
11. W sterylnych warunkach przenieś kawałki kory mózgowej do jednej probówki Falcon o pojemności 50 ml i dodaj HBSS do całkowitej objętości 22,5 ml.
12. Dodać 2,5 ml 2,5 % trypsyny, wymieszać i inkubować tkankę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Mieszać od czasu do czasu wstrząsając co 10 minut.
13. Wirować przez 5 minut przy 300 x g, aby otopić kawałki tkanki kory mózgowej.
14. Ostrożnie usunąć supernatant przez dekantację. W celu uniknięcia utraty osadu tkankowego, można go mechanicznie zatrzymać za pomocą pipety. Dysocjować tkankę na zawiesinę pojedynczej komórki, dodając 10 ml pożywki do posiewu astrocytów i energicznie pipetując za pomocą plastikowej pipety o pojemności 10 ml, aż fragmenty tkanki zostaną zdysocjowane na pojedyncze komórki (20 do 30 razy). Dostosuj objętość do 20 ml za pomocą pożywki do posiewu astrocytów. Możesz udowodnić dysocjację tkanki kory na pojedyncze komórki, licząc za pomocą hematocytometru. Jedno przygotowanie 4 kory mózgowej mysich szczeniąt powinno dać 10-15 x10⁶ zdysocjowanych pojedynczych komórek.
15. Odessać PDL z kolby hodowlanej T75, rozlać na płytkę zdysocjowaną zawiesinę jednokomórkową i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ .

2. Uzyskanie wzbogaconej kultury astrocytów

1. Zmienić pożywkę 2 dni po posiewie zmieszanych komórek korowych i wszystkie 3 dni później.
2. Po 7 do 8 dniach, gdy astrocyty zlewają się ze sobą, a nakładający się mikroglej jest odsłonięty na warstwie astrocytów lub jest już odłączony od warstwy astrocytów (ryc. 2), potrząsaj kolbą T75 z prędkością 180 obr./min przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej, aby usunąć mikroglej. Odrzucić supernatant zawierający mikroglej lub, jeśli chcesz przeprowadzić hodowlę i zbadać mikroglej, odwirować go i płytkę do posiewu ^28,29.
3. Dodać 20 ml świeżej pożywki do hodowli astrocytów i kontynuować, potrząsając kolbą z prędkością 240 obr./min przez 6 godzin w celu usunięcia komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC). Ponieważ niektóre OPC nie odłączają się całkowicie od warstwy astrocytów, kontynuuj energiczne potrząsanie ręką przez 1 minutę, aby zapobiec zanieczyszczeniu OPC. Odrzucić supernatant lub odwirować go i pokryć płytką, jeśli chcesz hodować OPC ²⁹.
4. Przepłukać pozostałą warstwę zlewających się astrocytów dwukrotnie PBS, odessać PBS, dodać 5 ml trypsyny-EDTA i inkubować w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C. Sprawdzaj oderwanie astrocytów co 5 minut i wymuś oderwanie astrocytów, uderzając kolbą o dłoń (2-3 razy).
5. Po odłączeniu astrocytów od kolby hodowlanej dodać 5 ml pożywki do hodowli astrocytów, wirować komórki pod ciśnieniem 180 x g przez 5 minut, aspirować supernatant i dodać 40 ml świeżej pożywki do posiewu astrocytów. Jedna kolba do hodowli tkankowej T75 powinna dać około 1x10⁶ komórek po pierwszym podziale komórek. Umieścić komórki w dwóch kolbach hodowlanych T75 i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ . Zmieniaj podłoże co 2 do 3 dni.
6. 12-14 dni po pierwszym rozszczepieniu astrocyty są siane w odpowiednim stężeniu komórek 24-48 godzin przed wykonaniem eksperymentu. Jedna kolba do hodowli tkankowej T75 powinna dać około 1,5-2 x10⁶ komórek po podziale drugiej komórki.

Wyniki

Po wyizolowaniu całego mózgu myszy (Rysunek 1A), należy usunąć móżdżek oraz opuszki węchowe (Rysunek 1B). Korę odseparowuje się od pnia mózgu myszy (Rysunek 1C), a następnie ostrożnie usuwa opony pojedynczej półkuli (Rysunek 1D') (Rysunek 1E). Opony są łatwo rozpoznawalne dzięki układowi tętnic oponowych, a ich niepełne usunięcie prowadzi do zanieczyszczenia końcowej kultury astrocytów komórkami oponowymi i fibroblastami.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda opiera się na przygotowaniu hodowli astrocytów z mózgów noworodków gryzoni, pierwotnie opisanej przez McCarthy'ego i de Vellisa w 1980 ^roku. Przedstawiona tutaj zmodyfikowana metoda izolacji i hodowli astrocytów korowych z postnatalnej myszy P1 do P4 jest szybka, daje czyste astrocyty pierwotne i jest wysoce odtwarzalna. Technikę tę można łatwo przenieść do izolacji astrocytów od innych gatunków, takich jak szczury lub świnie oraz od innych obszarów mózgu, takich jak rdzeń kręgowy. Podczas...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka do hodowli astrocytów
DMEM, wysoka glukoza	Life Technologies	31966-021
FBS, inaktywowane termicznie	Life Technologies	10082-147	Końcowe stężenie: 10%
Penicylina-Streptomycyna	Life Technologies	15140-122	Końcowe stężenie: 1%
Roztwór do trawienia tkanki mózgowej
HBSS	Life Technologies	14170-088
2,5% Trypsin	Life Technologies	15090-046	Stężenie końcowe: 0,25%
Inne
70% (vol/vol) etanol	Roth	9065.2
Poli-D-lizyna	Milipor	A-003-E	50 μ g / ml
Woda	PAA	S15-012	klasa hodowli komórkowej
PBS	PAA	H15-002	klasa hodowli komórkowej
0,05% Trypsyna-EDTA	Life Technologies	25300-062
0,45 i mu; m Filtr sterylny	Sartorius	16555
3,5 cm szalka Petriego	BD Falcon	353001
15 ml Probówka Falcon	BD Falcon	352096
50 ml Rurka Falcon	BD Falcon	352070
75 cm2 Kolba do hodowli tkanek	BD Falcon	353136
Kleszcze, drobne	Dumont	2-1032; 2-1033	# 3c; # 5
Kleszcze, płaska końcówka	KLS Martin	12-120-11
Nożyczki chirurgiczne 13 cm	Aesculap	BC-140-R
Mikroskop stereoskopowy	Leica		MZ7.5
+ aparat	Leica		MZ16F; DFC320
Mikroskop + kamera	Zeiss; Canon		primo vert; Wirówka PowerShot A650 IS
	Eppendorf	5805000.017	Wirówka5804R
Wytrząsarka orbitalna	Thermo Scientific	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
Łaźnia wodna	Julabo		SW20; 37 ° Z