Transgeniczne myszy lub wektory wirusowe zostały użyte do zwiększenia ekspresji białka w płucach. Jednak techniki te są czasochłonne, trudne technicznie i mają niezamierzone skutki, które mogą zakłócić wyniki. Nasz protokół transfekcji białek wykorzystuje odczynnik do transfekcji na bazie lipidów i ultradrobny mikrorozpylacz, aby równomiernie dostarczyć aktywne białko do komórek płuc.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zwiększenie ekspresji białka pozwala naukowcom lepiej zrozumieć funkcjonalną rolę tego białka w regulacji kluczowych procesów biologicznych1. W płucach udało się to osiągnąć zazwyczaj dzięki podejściach genetycznych, które wykorzystują transgeniczne myszy2,3 lub wektory wirusowe lub niewirusowe, które podnoszą poziom białka poprzez zwiększoną ekspresję genów4. Myszy transgeniczne są kosztowne i czasochłonne w generacji, a losowe wprowadzenie transgenu lub przewlekła ekspresja genu może zmienić normalny rozwój płuc, a tym samym ograniczyć użyteczność modelu5. Podczas gdy transgeniki warunkowe zapobiegają problemom związanym z przewlekłą ekspresją genów6, myszy z odwróconym transaktywatorem sterowanym tetracykliną (rtTA), które są używane do generowania ekspresji warunkowej, rozwijają spontaniczne powiększenie przestrzeni powietrznej7. Podobnie jak w przypadku transgeników, stosowanie wektorów wirusowych i niewirusowych jest kosztowne8 i może wywołać zależne od dawki reakcje zapalne, które zakłócają wyniki9 i utrudniają ekspresję10. Co więcej, skuteczność powtarzanych dawek jest ograniczona przez wzmocnioną odpowiedź immunologiczną na wektor11,12. Naukowcy opracowują wektory wirusowe związane z adenowirusem (AAV), które wywołują mniej stanów zapalnych i mają dłuższą ekspresję w płucach13.
Korzystając z β-galaktozydazy, prezentujemy metodę szybkiego i skutecznego zwiększania ekspresji białka w płucach za pomocą techniki bezpośredniej transfekcji białek. Protokół ten polega na zmieszaniu ustalonej ilości oczyszczonego białka z 20 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów (Pro-Ject, Pierce Bio), aby umożliwić przenikanie do samej tkanki płucnej. Liposomalna mieszanina białek jest następnie wstrzykiwana do płuc myszy przez tchawicę za pomocą mikrorozpylacza (Penn Century, Philadelphia, PA). Mikrorozpylacz wytwarza drobny pióropusz ciekłego aerozolu w płucach. Korzystając z tej techniki, wykazaliśmy równomierne osadzanie wstrzykniętego białka w drogach oddechowych i pęcherzykach płucnychmyszy 14. Technika transfekcji lipidów pozwala na użycie niewielkiej ilości białka w celu uzyskania efektu. Ogranicza to reakcję zapalną, która w przeciwnym razie zostałaby wywołana przez podawanie dużej ilości białka. Rzeczywiście, korzystając z tej techniki, opublikowaliśmy, że byliśmy w stanie znacznie zwiększyć aktywność PP2A w płucach bez wpływu na komórkowość płukania płuc15. Komórkowość płukania płuc pobrana 24 godziny po prowokacji była porównywalna z grupą kontrolną (27±4 kontrola vs. 31±5 albuminy transfekowanej; N=6 na grupę). Co więcej, zwiększa poziom białka bez wywoływania zmian rozwojowych płuc lub zmian architektonicznych, które mogą wystąpić w modelach transgenicznych. Jednak konieczność wielokrotnego podawania może sprawić, że technika ta będzie mniej korzystna dla badań oceniających skutki długoterminowego wzrostu ekspresji białek. Byłoby to szczególnie prawdziwe w przypadku białek o krótkim okresie półtrwania.
Protokół
1. Przygotowanie odczynnika do transfekcji białek
- Rozpuścić odczynnik Pro-Ject przez dodanie 250 μl metanolu lub chloroformu do probówki zawierającej suchą folię.
- Wiruj przez 10-20 sekund z maksymalną prędkością.
- Odpipetować 20 μl odczynnika Pro-Ject do oddzielnych probówek do mikrowirówek.
- Odparować rozpuszczalnik, umieszczając probówki do mikrowirówek zawierające odczynnik Pro-Ject pod okapem z przepływem laminarnym na co najmniej 6 godzin w temperaturze pokojowej. Musi być całkowicie suchy. Alternatywnie, wysuszyć odczynnik Pro-Ject za pomocą eksykatora próżniowego.
- Przechowywać probówki w temperaturze -20 °C. W tej temperaturze są dobre przez rok.
2. Dodawanie białka do odczynnika Pro-Ject
- Odpipetować 50 μl PBS, zawierającego 2,0 μg białka będącego przedmiotem zainteresowania, do probówki zawierającej 20 μl wysuszonego odczynnika do transfekcji Pro-Ject.
- Po dodaniu białka wymieszaj roztwór, wirując z małą prędkością przez 3-5 sekund, a następnie inkubując przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
3. Dotchawicze podawanie białka
- Znieczulenie myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny (100 mg/kg i 10 mg/kg).
- Po osiągnięciu sedacji myszy są zawieszane na górnych siekaczach za pomocą specjalnie zaprojektowanej platformy (ryc. 1).
- Za pomocą kleszczy i spinacza do papieru jako laryngoskopu otwiera się ustno-gardło, aby można było wprowadzić cewnik (ryc. 2). Struny głosowe są wizualizowane poprzez umieszczenie źródła światła na tchawicy myszy.
- Mieszaninę odczynnika białko/ProJect (50 μl) wstrzykuje się przez tchawicę za pomocą rozpylacza Penn Century Microspryskacz.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zademonstrować skuteczność naszej techniki, użyto mikrospryskiwacza (Penn Century) do wstrzyknięcia do tchawki myszy 2 μg albuminy mysiej (Sigma) rozpuszczonej w 50 μl PBS zawierającego 20 μl odczynnika do transfekcji Pro-Ject. Myszy traktowane albuminą porównano z myszami traktowanymi w identyczny sposób 2 μg białka beta-galaktozydazy (Pierce Bio). Po dwudziestu czterech godzinach myszy poddano eutanazji, a płuca przetworzono do analizy histologicznej. Immunohistochemię beta-galaktozydazy przeprowadzono na utrwalony...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przewagą tej techniki nad innymi metodami jest to, że powoduje ona wzrost poziomu białka i aktywności w samej tkance płucnej. Co więcej, przenika do najbardziej dystalnych obszarów płuc, a nie pozostaje tylko w drogach oddechowych. Zmierzyliśmy zwiększoną aktywność białkową naszego zastrzyku nawet po płukaniu dróg oddechowych solą fizjologiczną15. Analizy aktywności tkanek wskazują, że białko wnika do komórek, a nie tylko pozostaje w przestrzeniach powietrznych myszy. Zostało to dodatkowo potwierdzone przez i...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (7R01HL098528-03) oraz FAMRI's Clinical Innovator Award.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Penn Century | FMJ-250 | ||
| Beta-galaktozydaza | Pierce Bio | 89850 | |
| Przeciwciało beta-galaktozydazy | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Albumina surowicy myszy | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamina/ksylazyna | Sigma Aldrich | Zobacz materiał K113 |
Bibliografia
- Glasser, S. W., Korfhagen, T. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Transgenic models for study of pulmonary development and disease. Am. J. Physiol. 267, 489-497 (1994).
- D'Armiento, J., Dalal, S. S., Okada, Y., Berg, R. A., Chada, K. Collagenase expression in the lungs of transgenic mice causes pulmonary emphysema. Cell. 71, 955-961 (1992).
- Foronjy, R. F., et al. Superoxide dismutase expression attenuates cigarette smoke- or elastase-generated emphysema in mice. Am. J. Respir Crit. Care Med. 173, 623-631 (2006).
- Foronjy, R., et al. The divergent roles of secreted frizzled related protein-1 (SFRP1) in lung morphogenesis and emphysema. Am. J. Pathol. 177, 598-607 (2010).
- Costa, R. H., Kalinichenko, V. V., Lim, L. Transcription factors in mouse lung development and function. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280, 823-838 (2001).
- Perl, A. K., Tichelaar, J. W., Whitsett, J. A. Conditional gene expression in the respiratory epithelium of the mouse. Transgenic Research. 11, 21-29 (2002).
- Morimoto, M., Kopan, R. rtTA toxicity limits the usefulness of the SP-C-rtTA transgenic mouse. Dev. Biol. 325, 171-178 (2009).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nature reviews. Genetics. 8, 573-587 (2007).
- Crystal, R. G., et al. Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis. Nat. Genet. 8, 42-51 (1994).
- Merkel, O. M., Zheng, M., Debus, H., Kissel, T. Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors. Bioconjugate Chemistry. 23, 3-20 (2012).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. J. Virol. 69, 2004-2015 (1995).
- Liu, Q., Muruve, D. A. Molecular basis of the inflammatory response to adenovirus vectors. Gene Ther. 10, 935-940 (2003).
- Pfeifer, C., Aneja, M. K., Hasenpusch, G., Rudolph, C. Adeno-associated virus serotype 9-mediated pulmonary transgene expression: effect of mouse strain, animal gender and lung inflammation. Gene Ther. 18, 1034-1042 (2011).
- Wallace, A. M. Protein phosphatase 2A regulates innate immune and proteolytic responses to cigarette smoke exposure in the lung. Toxicol. Sci. 126, 589-599 (2012).
- Wallace, A. M. Protein Phosphatase 2a (Pp2a) Regulates Innate Immune and Proteolytic Responses to Cigarette Smoke Exposure in the Lung. Toxicol. Sci. , (2012).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
