Opisano metodę analizy dostępności rozpuszczalnika grupy tiolowej reszt cysteinowych wirusa Maize rayado fino virus (MRFV) - wirusopodobnych cząstek (VLP), po których następuje reakcja sieciowania peptydów. Metoda wykorzystuje dostępność kilku grup chemicznych na powierzchni VLP, które mogą być celami dla określonych reakcji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza dostępności rozpuszczalników reszt cysteiny na cząstkach wirusopodobnych wirusa rayado fino kukurydzy wytwarzanych w roślinach Nicotiana benthamiana i sieciowanie peptydów z VLP
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Naśladowanie i wykorzystywanie właściwości wirusów oraz cech fizykochemicznych i fizycznych daje nadzieję na rozwiązanie niektórych z najpilniejszych wyzwań na świecie. Sam zakres i rodzaje wirusów w połączeniu z ich intrygującymi właściwościami potencjalnie dają nieskończone możliwości zastosowań w technologiach opartych na wirusach. Wirusy mają zdolność samoorganizowania się w cząsteczki o dyskretnym kształcie i wielkości, specyficzności symetrii, poliwalencji i stabilnych właściwościach w szerokim zakresie temperatur i pH. Nic dziwnego, że przy tak niezwykłym zakresie właściwości, wirusy są proponowane do stosowania w biomateriałach 9, szczepionkach 14, 15, materiałach elektronicznych, narzędziach chemicznych i molekularnych pojemnikach elektronicznych4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
Aby wykorzystać wirusy w nanotechnologii, muszą one zostać zmodyfikowane z ich naturalnych form, aby nadać im nowe funkcje. Ten trudny proces można przeprowadzić za pomocą kilku mechanizmów, w tym genetycznej modyfikacji genomu wirusa i chemicznego przyłączania obcych lub pożądanych cząsteczek do grup reaktywnych cząstek wirusa 8. Zdolność do modyfikowania wirusa zależy przede wszystkim od właściwości fizykochemicznych i fizycznych wirusa. Ponadto modyfikacje genetyczne lub fizykochemiczne muszą być przeprowadzane bez negatywnego wpływu na natywną strukturę i funkcję wirusa. Białka płaszcza wirusa kukurydzy rayado fino (MRFV) samoorganizują się w Escherichia coli, wytwarzając stabilne i puste VLP, które są stabilizowane przez interakcje białko-białko i które mogą być wykorzystywane w technologiach opartych na wirusach 8. VLP wytwarzane w roślinach tytoniu badano jako rusztowanie, na którym można kowalencyjnie eksponować różne peptydy 13. W tym miejscu opisujemy kroki, które należy wykonać: 1) określić, które z dostępnych dla rozpuszczalnika cystein w kapsydzie wirusa są dostępne do modyfikacji, oraz 2) biosprzężonych peptydów ze zmodyfikowanymi kapsydami. Dzięki zastosowaniu natywnych lub mutacyjnie wstawionych reszt aminokwasowych i standardowych technologii sprzęgania, na powierzchni wirusów roślinnych pojawiła się szeroka gama materiałów, takich jak wirus mozaiki bromu 3, wirus pstrości goździka 12, wirus pstrości chlorotycznej wspięgi chińskiej 6, wirus mozaiki tytoniu 17, wirus żółtej mozaiki rzepy 1 i MRFV 13.
Protokół
1. Inokulacja wirusa i oczyszczanie VLP z roślin Nicotiana benthamiana
- Wyprodukuj zakryte transkrypty T7-RNA z plazmidów wektorowych opartych na wirusie ziemniaka X (PVX) zawierających geny MRFV typu dzikiego (wt) i białka płaszcza (CP) z mutacją Cys 12, używając zestawu T7-mMessage mMachine firmy Ambion.
- Dla każdej reakcji transkryptu T7 zaszczepić dwa w pełni rozwinięte liście N. benthamiana reakcjami 10 μl i inkubować rośliny przez 10 dni w szklarni, przy wilgotności 60% przez 16 godzin w świetle (25 000-30 000 luksów) w temperaturze 25 °C i 8 godzin w ciemności w temperaturze 20 °C.
- Liście zakażone wirusemHarves t N. benthamiana 10 dni po zaszczepieniu (dpi), zważyć tkankę roślinną (50 gramów) i umieścić na lodzie.
- Homogenizować materiał roślinny w mieszarce w obecności 100 ml schłodzonego roztworu 0,5 M buforu cytrynianu na, pH 5,5 (użyć 2 ml buforu na gram tkanki roślinnej).
- Przefiltrować homogenat przez 3 warstwy gazy i sklarować przez odwirowanie przy 27 000 x g przez 30 minut. Przenieść supernatant do schłodzonego cylindra miarowego, zmierzyć objętość, a następnie przenieść do schłodzonej sterylnej zlewki. Wyrzuć granulkę.
- Roztwór supernatantu należy przetworzyć, dodając 10% glikolu polietylenowego 8 000 (PEG 8 000), mieszać przez 15 minut w temperaturze 4 °C i inkubować przez dodatkowe 45 minut w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia matrycy cząstki wirusopodobne (VLP)-PEG.
- Odwirować próbkę o masie 27 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
- Przetwarzać osady, dodając 8 ml 0,05 M buforu cytrynianu Na, pH 5,5 zawierającego 2% Triton X-100. Dobrze zakręć probówkami wirówkowymi, aby uwolnić osad. Przenieść osad i bufor do schłodzonej, sterylnej zlewki. Natychmiast przepłukać probówki 2 ml tego samego buforu i dodać do zlewki. Mieszać zawiesinę w temperaturze 4 °C, aż granulki się rozpuszczą (zwykle 1 godzina).
- Klarować przez odwirowywanie przez 5 minut przy 27 000 x g, odrzucić osad i przetworzyć supernatant przez odwirowanie w 140 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
- Zawiesić osad w 1 ml 0,05 M buforu cytrynianu Na, pH 5,5 i umieścić zawiesinę na 10-40% gradientowym sacharozy utworzonym w 0,05 M buforze cytrynianu Na, pH 5,5.
- Odwirowywać gradient przez 3 godziny przy 140 000 x g w temperaturze 4 °C.
- Oświetlić światłem górną część probówki wirówkowej i zebrać górny pas rozpraszający światło w odległości 4 cm od górnej części probówki, rozcieńczyć 0,05 M buforem cytrynianu na, pH 5,5 i wirować przez 3 godziny w temperaturze 140 000 x g w temperaturze 4 °C.
- Zawiesić osad w 0,5 ml sterylnej wody i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do sześciu miesięcy.
- Określ ilościowo stężenie VLP, wykonując test białka Bradforda. Wydajność VLP wynosi od 1 do 3 μg/g tkanki roślinnej.
2. Znakowanie fluoresceiną-5-maleimidem Reakcje VLP
- Przygotować 1 mM roztwór 5-maleimidu fluoresceiny (427,37 g/mol) w 50 mM buforze fosforanu sodu o pH 7,0; 1 mM EDTA. Wymieszać za pomocą wiru i sprawdzić, czy całkowicie się rozpuścił. Chroń rurkę przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
- Dodaj fluoresceinę-5-maleimid do VLP wytworzonych w kroku 1 i wymieszaj. Użyj 25-krotnego molowego nadmiaru fluoresceiny-5-maleimidu dla molowej ilości sulfhydryli. Ogólnie rzecz biorąc, użycie 30 μl VLP w stężeniu 1 μg/μl i 60 μl roztworu fluoresceiny-5-maleimidu daje akceptowalne wyniki.
- Inkubować reakcję przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
- Zakończyć reakcję przez dodanie ditiotreitolu (DTT) do końcowego stężenia 50 mM.
- Usunąć nieprzereagowaną fluoresceinę za pomocą odsalającej kolumny wirowej (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) i odwirować przez 2 minuty przy 1,500 x g w temperaturze pokojowej.
- Do analizy SDS-PAGE dodać 10 μl 2 x bufor próbki SDS-PAGE Laemmli do 10 μl każdej reakcji. Znakowane białko należy przechowywać w temperaturze 4 °C chronione przed światłem przez okres do jednego miesiąca lub w porcjach jednorazowego użytku w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.
3. Etykietowanie reakcji i oznaczanie inkorporacji biotyny
- Użyj odsalających kolumn wirowych (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) do przeprowadzenia wymiany buforowej z wody na sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pH 7,0 VLP wytworzonych w kroku 1.
- Przygotować 20 mM roztwór podstawowy maleimidu-PEG2-biotyny, dodając 190 μl PBS do maleimidu-PEG2-biotyny No-Weigh i mieszać, pipetując w górę i w dół.
- Dodaj maleimid-PEG2-biotynę do VLP i wymieszaj. Użyć 10-krotnego molowego nadmiaru odczynnika do roztworów VLP ≤ 2 mg/ml.
- Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.
- Usunąć nieprzereagowaną maleimid-PEG2-biotynę za pomocą odsalającej kolumny wirowej (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) i odwirować przez 2 minuty przy 1,500 x g w temperaturze pokojowej.
- Określ mole biotyny na mol VLP za pomocą zestawu do ilościowego określania biotyny Pierce (Thermo Scientific) i postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Sieciowanie Cys 2-VLP i peptydu F
- VLP, które spowodowały udostępnienie reszt cysteiny do sieciowania w kroku 2 (Cys 2-VLPs), są używane w następnym etapie. Przygotować świeży sieciujący roztwór podstawowy (28,63 mM), rozpuszczając 10 mg środka sieciującego NHS-PEG4-maleimid w 680 μl dimetylosulfotlenku.
- Rozpuścić 17 (F)-aminokwasowy peptyd (LLPNMOKDKEACAKAPL) w 50 μl buforu koniugacyjnego (1 x PBS, pH 7,2; 1 mM EDTA) w stężeniu 0,1 mM.
- Dodać 4 μl środka sieciującego do 50 μl rozpuszczonego peptydu (białka-NH2) przy końcowym stężeniu 1 mM (co stanowi 10-krotny nadmiar molowy na 0,1 mM roztworu peptydu).
- Inkubować reakcję przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
- Oczyść usieciowany peptyd za pomocą kolumny odsalającej (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) zrównoważonej buforem koniugacyjnym (1 x PBS, pH 7,2; 1 mM EDTA) przez odwirowanie przy 1,500 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
- Stwórz mieszaninę reakcyjną łączącą VLP (białko-SH) i usieciowany peptyd (białko-NH2) w stosunku molowym określonym przez liczbę tioli i aktywowanych amin biorących udział w reakcji oraz różnicę w masie cząsteczkowej między VLP a peptydem.
- Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
- W przypadku analizy Western blot należy wymieszać otrzymany sprzężony produkt 1:1 z buforem Laemmli, gotować przez 10 minut i kontynuować z SDS-PAGE na wstępnie odlanym 10-20% żelu Tris-Glycine (Invitrogen), a następnie elektroblottować na membranie nitrocelulozowej (Invitrogen). Zablokuj błony 1 x PBS, pH 7,2 zawierającym 0,05% Tween-20 (PBS-Tween) i 5% odtłuszczonego mleka w proszku i sonduj przeciwciałami specyficznymi dla peptydów, a następnie odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fosfatazą.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przejściowa ekspresja genów mutantów białka kapsydu (CP) wirusa MRFV w roślinach N. benthamiana przy użyciu wektora opartego na PVX produkującego VLPs została przedstawiona na Rysunku 1. Zmodyfikowany gen białka kapsydu MRFV jest amplifikowany metodą PCR, a następnie poddany kontroli transkrypcyjnej zduplikowanego subgenomowego promotora CP w wektorze opartym na PVX, pP2C2S 2 (dar od D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, Anglia). Transkrypcja RNA in vitro pozwala na ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona metoda umożliwia bardzo czułą i szybką analizę reaktywnych cystein obecnych na powierzchni VLP wytwarzanych przez rośliny, a także na innych kompleksach białkowych. Maleimidy są odczynnikami specyficznymi dla tioli, które reagują z wolnymi cząsteczkami zawierającymi sulfhydryl, tworząc stabilne wiązania tioeterowe. Metoda ta opiera się na specyficzności maleimidów w zakresie reagowania z grupami sulfhydrylowymi niebiorącymi udziału w interakcjach z innymi aminokwasami. Zachowanie natywnej struktury VLP jest...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wzmianki o nazwach handlowych produktów handlowych w publikacji mają na celu wyłącznie dostarczenie konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cienkościenne, ultraprzezroczyste tuby | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluoresceino-5-maleimidu | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 jest niesprawnym zamiennikiem F150 |
| Zestaw do oznaczania biotyny Pierce | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotyna, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20 % Tris-Glycine Gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Bufor transferowy | Invitrogen | LC3675 | |
| Papier filtracyjny z membraną nitrocelulozową Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Fosfataza oznaczona powinowactwem Oczyszczone przeciwciało do króliczej IgG | Laboratoria Kirkegaarda i Perry'ego | 0751516 | |
| Substrat fosfatazy NBT/BCIP | Laboratoria Kirkegaard i Perry | 508107 |
Bibliografia
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
- Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
- Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
- Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
- Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
- Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
- Hermamson, G. T. Bioconjugate techniques. , Academic Press. San Diego. (1991).
- Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
- Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
- Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
- Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
- Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
- Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
- Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
- Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
