Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego

13.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50086

⸱

13 listopada 2012

 ,  , 
1Program in Molecular Medicine and Department of Cancer Biology, University of Massachusetts Medical School, 2Departments of Surgery and Medicine, Weill Cornell Medical College , 3Departments of Surgery and Medicine, New York Presbyterian Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono szybki sposób na badanie modyfikatorów czerniaka za pomocą autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego. Wykorzystuje wektor miniCoopR, który pozwala na ekspresję genów kandydujących na czerniaka w melanocytach. Opisano metodę uzyskiwania krzywych przeżycia wolnych od czerniaka, test inwazji, protokół barwienia przeciwciałami melanocytów łuskowych oraz test przeszczepiania czerniaka.

Streszczenie

Badania genomiczne ludzkich nowotworów dostarczyły wielu informacji na temat genów, które są zmienione w nowotworach1,2,3. Wyzwaniem wynikającym z tych badań jest to, że wiele genów jest zmienionych i może być trudno odróżnić zmiany genetyczne, które napędzały nowotworzenie od tych, które powstały przypadkowo podczas transformacji. Aby dokonać tego rozróżnienia, korzystne jest posiadanie testu, który może ilościowo zmierzyć wpływ zmienionego genu na inicjację guza i inne procesy, które umożliwiają przetrwanie i rozprzestrzenianie się guzów. W tym miejscu przedstawiamy szybki sposób badania przesiewowego dużej liczby potencjalnych modyfikatorów czerniaka u danio pręgowanego przy użyciu autochtonicznego modeluguza 4, który obejmuje etapy wymagane do inicjacji i utrzymania czerniaka. Kluczowym odczynnikiem w tym teście jest wektor miniCoopR, który łączy dziką kopię czynnika specyfikacji melanocytów mitfa z kasetą rekombinacji Gateway, do której można rekombinować geny kandydujące na czerniaka5. Wektor miniCoopR ma minigen ratujący mitfa, który zawiera promotor, otwartą ramkę odczytu i nieulegający translacji region 3' genu mitfa typu dzikiego. Pozwala nam to na tworzenie konstruktów przy użyciu pełnowymiarowych otwartych ramek odczytu potencjalnych modyfikatorów czerniaka. Te indywidualne klony można następnie wstrzyknąć do pojedynczej komórki Tg (mitfa: BRAFV600E); P53(LF); Mitfa(LF)Zarodki danio pręgowanego. Wektor miniCoopR zostaje zintegrowany przez transgenezęza pośrednictwem Tol2 6 i ratuje melanocyty. Ponieważ są one fizycznie sprzężone z minigenem ratującym mitfa, geny kandydujące ulegają ekspresji w uratowanych melanocytach, z których niektóre przekształcą się i rozwiną w guzy. Wpływ genu kandydującego na inicjację czerniaka i właściwości komórek czerniaka można zmierzyć za pomocą krzywych przeżycia wolnych od czerniaka, testów inwazji, barwienia przeciwciałami i testów transplantacyjnych.

Protokół

1. Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów początku czerniaka

  1. Tworzenie klonów środkowego wejścia Gateway metodą PCR amplifikuje pełnowymiarową otwartą ramkę odczytu genów będących przedmiotem zainteresowania (GOI) i rekombinuje do pDONR 221 przy użyciu klonazy BP II (Invitrogen). Użyj technologii Multisite Gateway (Invitrogen) do rekombinacji p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit #302 p3E_SV40polyA6 i miniCoopR5, aby umieścić interesujące geny pod promotorem mitfa w wektorze miniCoopR (Figura 1A).
  2. Wstrzyknij 25 pikogramów każdego klonu wraz z 25 pikogramami mRNA transpozazy Tol2 do jednokomórkowego Tg (mitfa: BRAFV600E); P53(LF); Mitfa(lf)potrójnie homozygotyczne zarodki danio pręgowanego, jak opisano wcześniej7. Inkubować wstrzyknięte zarodki w temperaturze 28,5 °C. Usunąć wszelkie martwe zarodki w temperaturze 24 hpf.
  3. Wybierz transgeniczne zwierzęta z uratowanymi melanocytami w temperaturze 72 hpf, umieszczając szalkę Petriego zawierającą wstrzyknięte zarodki na mikroskopie preparacyjnym pod padającym światłem na białym tle (ryc. 1A).
  4. Przenieść zwierzęta do zbiorników o pojemności 3 litrów w odchowalni danio pręgowanego przy 4 dpf, jak opisano wcześniej8.
  5. W wieku 2 miesięcy wybierz zwierzęta, u których co najmniej jeden obszar ratowania melanocytów jest większy niż 4mm2 (ryc. 1A). Istnieje silna korelacja między stopniem uratowania melanocytów przy 72 hpf a stopniem uratowania melanocytów po 2 miesiącach. Kiedy zarodki z uratowanymi melanocytami zostaną wybrane przy 72 hpf, większość z nich (~ 80%) będzie miała co najmniej jeden obszar ratowania melanocytów większy niż 4 mm2 po 2 miesiącach.
  6. Co tydzień badaj wybrane zwierzęta pod kątem obecności guzów (ryc. 1B). Istnieje silna korelacja między zmianami histopatologicznymi i morfologicznymi. Przejście od łagodnego do złośliwego jest rozpoznawane jako zmiana morfologiczna, gdy zmiany unoszą się nad powierzchnię zwierzęcia. Wyizoluj zwierzęta z nowotworem do badań.
  7. Narysuj krzywe przeżycia wolnego od czerniaka wraz z wiekiem w tygodniach na odciętej i procentem przeżycia wolnego od czerniaka na rzędnej. Zwierzęta z melanocytami, które wyrażają interesujący gen, są porównywane ze zwierzętami kontrolnymi, które wyrażają EGFP (wzmocnione białko zielonej fluorescencji) w melanocytach (ryc. 1C). Mediana początku występowania nowotworu u zwierząt, którym wstrzyknięto miniCoopR-EGFP, wynosi około 18 tygodni. Określ, czy te dwie krzywe różnią się statystycznie, korzystając z testu logarytmicznej.

2. Test inwazji nowotworu

  1. Wybierz izolowanego danio pręgowanego, u którego guzy rozwijają się grzbietowo, w regionie między tylną granicą tyłomózgowia a przednią granicą płetwy grzbietowej (ryc. 2A).
  2. Dwa tygodnie po wystąpieniu czerniaka należy poddać ryby eutanazji zgodnie z wytycznymi określonymi przez Panel ds. Eutanazji Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych i zatwierdzonymi przez University of Massachusetts Medical School, Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). W szczególności rybę umieszcza się w naczyniu z 0,6 mg/ml tricainy, aż do ustania ruchu skrzeli.
  3. Wykonać nacięcie w jamie otrzewnej ryby za pomocą skalpela, a następnie umieścić rybę w 4% paraformaldehydzie (PFA) na noc w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia.
  4. Traktować 0,5 M EDTA przez noc w temperaturze 4 °C w celu odwapnienia.
  5. Utrwalić formaliną w kasecie przez noc, odwodnić przez 1 godzinę, oczyścić ksylenem 3 razy przez 1 godzinę, a następnie potraktować parafiną 2 razy przez 2 godziny w temperaturze 60 °C.
  6. Zanurz tkankę w parafinie w formie i pozwól jej zastygnąć przez 30 minut do 1 godziny.
  7. Wykonaj 5 μm sekcji, po jednej co 50 μm. Odcinki powinny być poprzeczne i przechodzące przez całą zmianę, aby można było zidentyfikować punkt najgłębszej inwazji. Następnie wykonaj barwienie hematoksyliną i eozyną.
  8. Oceń inwazję guza, mierząc, czy komórki nowotworowe pozostają poza warstwą zbitą kolagenu, atakują mięśnie grzbietowe, czy też atakują dalej w kręgosłupie (ryc. 2B, C). Określ różnicę statystyczną między dwoma zestawami próbek.

3. Barwienie przeciwciałami melanocytów łuskowych

  1. Uzupełnić bufor PO4 80 ml 0,1 M Na2HPO4 i 20 ml 0,1 M NaH2PO4. Upewnij się, że pH wynosi 7,3. Uzupełnić 2 razy utrwalony bufor zawierający 8,0 g sacharozy, 0,15 ml 0,2 M CaCl2 i 90 ml 0,2 M buforu PO4 o pH 7,3. W razie potrzeby dostosować pH do 7,3 za pomocą NaOH lub HCl, a następnie uzupełnić do 100 ml buforem PO4
    2. .
  2. Odważyć do 300 mg stałego PFA i dodać do probówki do mikrowirówki. Dodać 5 mM NaOH do objętości równej 4,5 x masie PFA w mg (np. 450 ul 5 mM NaOH do 100 mg PFA). Ogrzewać w temperaturze 60-70 °C, od czasu do czasu wstrząsając, aż do rozpuszczenia PFA. Odkręć pozostałe cząstki i odzyskaj 20% supernatantu PFA. Zrób świeże za każdym razem.
  3. Przygotować roztwór utrwalający zawierający 1x bufor utrwalający i 4% PFA.
  4. Znieczulić ryby w 0,17 mg/ml tricainy.
  5. Używając padającego światła pod mikroskopem preparacyjnym, wyrwij łuski grzbietowe za pomocą ostrych kleszczy z cienką końcówką, uważając, aby nie uszkodzić połowy skali zawierającej melanocyty (ryc. 3A). Umieść łuski bezpośrednio z kleszczyków w 1 ml roztworu utrwalającego i inkubuj w temperaturze pokojowej, obracając przez ≥ 2 godziny. Przenieś rybę do wody dla ryb i monitoruj ryby, aby potwierdzić pomyślne wyzdrowienie.
  6. Aby wybielić pigmentowane melanocyty, umyj ustalone łuski w PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% Triton X-100) 2 razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 1 ml świeżo przygotowanego roztworu wybielacza zawierającego 0,4 ml 10% KOH i 0,15 ml 30% H2O2 w 5 ml z dH2O. Załóż parafilm lub zamki nasadkowe, aby zapobiec rozerwaniu probówek przez gaz. Kontynuuj wybielanie, aż pigment zniknie (zazwyczaj 10 minut) (ryc. 3B,C). Prać w PBST cztery razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Blokować przez co najmniej 30 minut w roztworze blokowym składającym się z 1x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 mg/ml BSA, 1% DMSO, 0,02% NaN3 i 2% surowicy jagnięcej. Pomiń NaN3, jeśli rozwija się z reakcją HRP.
  8. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w roztworze blokowym przez noc w temperaturze pokojowej. Musisz mieć co najmniej 400 μl roztworu na próbkach, aby były zanurzone.
  9. Umyj wagę 3 razy przez 30 minut w PBST w temperaturze pokojowej.
  10. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 2 godziny do nocy w roztworze blokowym w temperaturze pokojowej.
  11. Barwienie przez 10 minut za pomocą PBST+ 0,1 μM DAPI.
  12. Umyć 3 razy przez 5 minut za pomocą PBST.
  13. Zamontuj wagę na szkiełku podstawowym w kropli vectashield tak, aby wklęsła strona wagi była skierowana w dół w kierunku szkiełka i umieść na nich szkiełko zakrywające. Uszczelnij krawędzie szkiełka przezroczystym lakierem do paznokci i obserwuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym (rysunek 3D, E, F, G).

4. Test transplantacyjny

  1. Przygotować biorcę 2-3 miesięcznej rybki casper9 poprzez napromieniowanie promieniowaniem gamma 25 Gy na dzień przed przeszczepem10. Pozwól rybie zregenerować się w wodzie dla ryb.
  2. Poddaj eutanazji rybę z nowotworem, jak opisano wcześniej (sekcja 2.2).
  3. Odetnij guz i umieść go na szalce Petriego z około 5 ml filtrem wysterylizowanym 0,9x PBS z 5% FBS. Pokrój guz w kostkę brzytwą w roztworze.
  4. Pracując w temperaturze pokojowej, rozcieraj pipetą P1000, aby uzyskać pojedyncze komórki. Uzupełnić objętość do 25 ml za pomocą filtra wysterylizowanego 0,9x PBS z 5% FBS.
  5. Przefiltruj przez filtr siatkowy 40 μM.
  6. Wirować w wirówce stołowej Eppendorf 5810R z prędkością 1 500 obr./min (453 obr./min) przez 10 minut.
  7. Usunąć supernatant i wykonać zawiesinę komórek do mniej więcej pożądanego stężenia (załóżmy, że 10 7 komórek na guz o średnicy 100 mm3).
  8. Obliczyć dokładną liczbę komórek za pomocą hemocytometru i rozcieńczyć zawiesinę komórek tak, aby końcowa objętość wstrzyknięcia wynosiła około 5 μl. Na przykład, jeśli ma zostać wstrzykniętych 50 000 komórek, zawiesinę komórek należy rozcieńczyć do końcowego stężenia 10 000 komórek/μl. Przesuwaj probówkę zawierającą zawiesinę komórek co kilka minut, aby zapobiec zlepianiu się komórek.
  9. Umyj strzykawkę Hamilton 26s gauge (końcówka skośna) 701 N 10 μl 2-3 razy 100% etanolem i 0,9x PBS. Umieścić w strzykawce 5 μl zawiesiny komórek.
  10. Napromieniowaną rybę biorcę znieczulić 0,17 mg/ml trikainy. Umieść rybę na boku na wilgotnej chusteczce Kimwipe (Rysunek 4A).
  11. Ustabilizować rybę jedną ręką i wprowadzić igłę skosem skierowanym do góry pod kątem 45° w bok ryby powyżej jamy otrzewnej, mniej więcej w połowie odległości między tylną granicą tyłomózgowia a przednią granicą płetwy grzbietowej. Delikatnie wciśnij tłok (Rysunek 4B).
  12. Pozwól rybom zregenerować się w słodkiej wodzie dla ryb i codziennie obserwuj ryby pod kątem wszczepienia guza (ryc. 4C). Jeśli doszło do wszczepienia, można również zaobserwować ciągły wzrost i rozwój choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jednokomórkowe embriony zebrafish Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf) zostały wstrzyknięte wektorem miniCoopR zawierającym onkogen czerniaka SETDB15 lub EGFP, każdy pod kontrolą promotora mitfa. Wyselekcjonowano embriony z uratowaniem melanocytów i pozostawiono je do dojrzewania. W wieku 2 miesięcy wybrano zwierzęta z uratowaniem melanocytów o powierzchni większej niż 4 mm2. Zwierzęta były badane co tydzień pod kątem występowania czerniaków. Krzywe zapa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda miniCoopR umożliwia ekspresję interesujących genów w melanocytach danio pręgowanego. Takie podejście wykorzystuje fakt, że gen mitfa danio pręgowanego działa autonomicznie komórkowo. Z tego powodu melanocyty uratowane przez wektor miniCoopR z pewnością zawierają minigen i każdy gen będący przedmiotem zainteresowania, z którym jest on fizycznie sprzężony. Uratowane melanocyty są wyraźnie widoczne i można je uzyskać u zwierząt, którym wstrzyknięto zarodki jednokomórkowe. Wybierany jest określony stopień chi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Leonardowi I. Zonowi, w którego laboratorium te techniki zostały początkowo opracowane; Kristen Kwan i nieżyjącej już Chi-Bin Chien za dary w postaci plazmidów użytych w tej pracy; Jamesowi Listerowi i Davidowi Raible'owi za pomoc w barwieniu przeciwciał; oraz Jamesowi Neiswenderowi za film o mikroiniekcji. Ta praca została sfinansowana z grantu NIH R00AR056899-03 dla CJC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki do rekombinacji bramyInvitrogen
miniCoopRNr referencyjny5
Mitfa przeciwciałoreferencyjne5FITC
kozie przeciwciało anty-królicze IgGInvitrogen
VectashieldVector LabsH-1000
casper Danio pręgowanyReferencje9
701N 10 μ l StrzykawkaHamilton/Fisher14-824
40 μ M filtrBD Falcon/Fisher352340
FBSInvitrogen26140079

Bibliografia

  1. Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
  2. Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
  3. Lin, W. M., et al. Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma. Cancer Res. 68, 664-673 (2008).
  4. Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).
  5. Ceol, C. J., et al. The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset. Nature. 471, 513-517 (2011).
  6. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
  7. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).
  8. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4, University of Oregon Press. (2000).
  9. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  10. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model nowotworowy u rybek zebrafishwektor MiniCoopRpromotor MitfaBRAF V600Etest inwazji nowotworowejprze ywalno wolna od czerniakatest transplantacjitransgeneza Tol2ryby Casper

Powiązane artykuły