Artykuł metodologiczny

Kriosekcja zbiorowisk drożdży w celu zbadania wzorców fluorescencji

DOI:

10.3791/50101

⸱

26 grudnia 2012

 , 
1Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Research Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół zamrażania i kriosekcji społeczności drożdży w celu obserwacji wewnętrznych wzorców komórek fluorescencyjnych. Metoda opiera się na wiązaniu metanolu i osadzaniu OCT w celu zachowania przestrzennego rozmieszczenia komórek bez inaktywacji białek fluorescencyjnych w społeczności.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroby zazwyczaj żyją w społecznościach. Uważa się, że organizacja przestrzenna komórek w społeczności wpływa na przetrwanie i funkcjonowanie społeczności1. Techniki przekroju optycznego, w tym mikroskopia konfokalna i dwufotonowa, okazały się przydatne do obserwacji organizacji przestrzennej zbiorowisk bakteryjnych i archeonów2,3. Połączenie obrazowania konfokalnego i fizycznego podziału kolonii drożdży ujawniło wewnętrzną organizację komórek4. Jednak bezpośrednia sekcja optyczna przy użyciu mikroskopii konfokalnej lub dwufotonowej była w stanie dotrzeć tylko do kilku warstw komórek w głąb kolonii drożdży. To ograniczenie jest prawdopodobnie spowodowane silnym rozpraszaniem światła z komórek drożdży4.

Tutaj prezentujemy metodę opartą na utrwalaniu i kriosekcji w celu uzyskania przestrzennego rozmieszczenia komórek fluorescencyjnych w społecznościach Saccharomyces cerevisiae. Używamy metanolu jako utrwalacza, aby zachować przestrzenne rozmieszczenie komórek. Stałe społeczności są infiltrowane związkiem OCT, zamrażane i kriowycinane w kriostacie. Obrazowanie fluorescencyjne skrawków ujawnia wewnętrzną organizację komórek fluorescencyjnych w społeczności.

Przykłady społeczności drożdży składających się ze szczepów wyrażających czerwone i zielone białka fluorescencyjne pokazują potencjał metody kriosekcji do ujawnienia przestrzennego rozmieszczenia komórek fluorescencyjnych, jak również ekspresji genów w koloniach drożdży2,3. Mimo że skupiliśmy się na zbiorowiskach Saccharomyces cerevisiae, tę samą metodę można potencjalnie zastosować do badania innych zbiorowisk drobnoustrojów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Naprawianie społeczności drożdży

  1. Hoduj zbiorowiska drożdży na filtrze membranowym (np. filtr membranowy Millipore MF; Rysunek 2A). Protokół ten odpowiada typowemu zbiorowisku składającemu się z mniej niż 2x108 komórek na filtrze membranowym o średnicy 6 mm.
  2. Użyj kawałka bibuły filtracyjnej Whatman 541, aby przykryć dno studzienki o średnicy 1 cm (Rysunek 2B). Ten papier Whatman zostanie wykorzystany jako nośnik do przekazania społeczności w późniejszych etapach. Dodać 1 ml 100% metanolu do studzienki i pozostawić studzienkę w temperaturze -20 °C, aby temperatura się wyrównała.
  3. Wlej płyn N2 do dewara. Zamrozić społeczność w ciekłym azocie, zanurzając społeczność na co najmniej 15 sekund w ciekłymN2 za pomocą pęsety (rysunek 2C).
  4. Przenieść zamrożone zbiorowisko do studni metanolu o temperaturze -20 °C (rysunek 2D). Upewnij się, że zbiorowisko jest utrzymywane w pozycji poziomej podczas zanurzania go w metanolu. Odczekaj 20 min. Filtr membranowy MF zaczyna rozpadać się w metanolu.
  5. Przenieść zbiorowisko za pomocą bibuły filtracyjnej Whatman 541 z dołka metanolu na zimną szalkę Petriego utrzymywaną w temperaturze -20 °C w celu odparowania metanolu (rysunek 2E). Podczas przenoszenia trzymaj społeczność na filtrze Whatman i odbierz dodatkowe krople metanolu za pomocą innego kawałka grubego papieru Whatman przed włożeniem do zimnej szalki Petriego. Zapewni to, że czas parowania będzie stały dla każdej próbki.
  6. Poczekaj 4-6 godzin na odparowanie, aż filtr Whatman nośny będzie wyglądał na suchy. Niewystarczające parowanie pozostawia resztki metanolu, który przeszkadza w dzieleniu. Nadmierne przesuszenie powoduje pęknięcia i deformacje w społecznościach.
  7. Pobrać próbkę z zamrażarki o temperaturze -20 °C. Odetnij bibułę filtracyjną Whatman 541, która nie jest objęta przez społeczność.
  8. Wykonać prostokątny sześcienny pojemnik z folii aluminiowej, który jest wystarczająco duży, tak aby próbka miała co najmniej ~2 mm marginesu z każdej strony (rysunek 2F). Umieść społeczność na dolnej powierzchni pojemnika z folii aluminiowej; natychmiast przykryj próbkę OCT do 3 ~ 4 mm powyżej wysokości zbiorowiska. W razie potrzeby orientacja próbki może być dostosowana na tym etapie w odniesieniu do ścianek pojemnika. Odczekaj 10 min.
  9. Umieścić próbkę osadzoną w KTZ na metalowej płytce na suchym lodzie w celu zamrożenia. Zamrożone zgrupowania należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C w zamrażarce.

2. Dzielenie zamrożonych społeczności do obrazowania fluorescencyjnego

  1. Ustawić temperaturę komory kriosekcji na -25 °C i pozostawić próbki w komorze do momentu, aż jej temperatura osiągnie temperaturę komory.
  2. Zamontuj próbkę na uchwycie kriogenicznym po nałożeniu kropli OCT na uchwyt. Rozprowadzić OCT równomiernie po stronie próbki za pomocą odsłoniętej bibuły filtracyjnej Whatman (dno pojemnika) tak, aby grubość OCT wynosiła 2-3 mm. Pozwól OCT zamarznąć w komorze kriostatu przed podziałem. Zapewnienie marginesu OCT wynoszącego 2-3 mm ze wszystkich stron próbki pomaga zachować integralność sekcji.
  3. Boki bloku próbki OCT mogą być używane do wyrównania próbki. Jeśli próbka nie jest wyrównana w stosunku do ostrza, cięcie rozpocznie się od rogu lub boku próbki. Wyreguluj mocowanie, aby upewnić się, że ostrze tnie idealnie pionową (lub poziomą) powierzchnię bloku próbki.
  4. Typowe przekroje dla zbiorowisk drożdży mają grubość ~14 μm. Po wycięciu przekroju użyj szkiełka mikroskopowego utrzymywanego w temperaturze pokojowej, aby zebrać wycinek, powoli zbliżając szkiełko do wyciętego odcinka. Przekrój stopi się i zostanie przeniesiony na szkiełko mikroskopowe. Na jedną prowadnicę można przenieść do 18 sekcji.
  5. Szkiełka należy przechowywać w niskich temperaturach, najlepiej -20 °C, przed obrazowaniem. Utrata sygnału jest minimalna w przypadku przechowywania przez tydzień w temperaturze 4 °C. Aby uzyskać maksymalny sygnał fluorescencji, obrazowanie najlepiej wykonywać natychmiast po przekroju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescencyjne obrazy pionowych przekrojów poprzecznych społeczności drożdży zawierających oznaczone na czerwono i zielono konkurencyjne populacje6 są pokazane na rysunku 3. Zbiorowiska te składają się z dwóch prototroficznych szczepów drożdży, a ich rywalizacja o wspólne zasoby, w tym przestrzeń, prowadzi do powstania wzorów kolumnowych7, co widać w ich pionowych przekrojach. Rozdzielczości do pojedynczej komórki mogą być rozwiązywane w przekrojach. Rysunek 3 por...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj procedura umożliwia zbadanie wewnętrznej struktury zbiorowisk drożdży. Etap wiązania metanolu sprawia, że kolonia drożdży jest sztywna8 i zachowuje integralność kolonii; Powoduje to jednak również skurcz8 , który należy wziąć pod uwagę przy interpretacji wyników. Zazwyczaj obserwujemy około 30% spadek wysokości kolonii drożdży, w porównaniu z koloniami bezpośrednio osadzonymi w OCT bez wiązania9.

Aby uniknąć kurczenia się, alternatywnym pod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Laboratorium Jonathana Coopera w Fred Hutchinson Cancer Research Center za zgodę na korzystanie z ich kriostatu. Praca ta była wspierana przez NIH i Fundację W.M. Kecka. BM jest stypendystką Gordon and Betty Moore w Life Science Research Foundation. Jesteśmy wdzięczni Danielowi Gottschlingowi za podzielenie się z nami swoim protokołem naprawczym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100% metanolJ.T. Baker9070-01
Tissue-Tek O.C.T. CompoundAndwin Scientific4583
Whatman Grade No. 541 Ilościowa bibuła filtracyjnaWhatman1541-047
Filtr membranowy Millipore-MFMilliporeHAWP04700
CryostatLeicaCM 1510 S

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
  2. Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
  3. Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
  4. Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
  5. Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
  6. Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
  7. Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , Submitted (2012).
  8. Kiernan, J. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4(2008).
  9. Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cryosectioning Yeast CommunitiesFluorescence ImagingSpatial DistributionMethanol FixingOCT EmbeddingFluorescent ProteinsYeast ColoniesFluorescence MicroscopyCommunity SectioningFluorescent Signal

Powiązane artykuły