Prosta i skuteczna technika przygotowania zawiesin komórek jąder

Summary

Opisano nowy protokół mechanicznego przygotowania zawiesin komórek jąder z materiału gryzoni, unikając enzymów i detergentów. Metoda jest bardzo prosta, szybka, powtarzalna i pozwala uzyskać dobrej jakości zawiesiny komórek, które nadają się do sortowania przepływowego i ekstrakcji RNA.

Abstract

Jądra ssaków to bardzo złożone organy, które zawierają ponad 30 różnych typów komórek, w tym somatyczne komórki jąder i różne stadia rozwoju komórek linii rozrodczej. Ta heterogeniczność jest istotną wadą w badaniu podstaw spermatogenezy ssaków, ponieważ do większości analiz molekularnych potrzebne są czyste lub wzbogacone populacje komórek w określonych stadiach rozwoju plemników1.

Różne strategie, takie jak Staput^2,3, elutriacja odśrodkowa¹ i cytometria przepływowa (FC)^4,5 zostały zastosowane w celu uzyskania wzbogaconych lub oczyszczonych populacji komórek jąder, aby umożliwić badania różnicowej ekspresji genów.

Wymagane jest, aby komórki były zawieszone dla większości podejść do wzbogacania/oczyszczania. Idealnie, zawiesina komórkowa będzie reprezentatywna dla pierwotnej tkanki, będzie miała wysoki odsetek żywotnych komórek i niewiele wielojądrowych - które mają tendencję do tworzenia się ze względu na syncytialny charakter nabłonka nasiennego^6,7 - i nie będzie miała grudek komórkowych¹ . Wcześniejsze doniesienia dowiodły, że zawiesiny komórek jąder przygotowane wyłącznie metodą mechaniczną łatwiej się zbrylały niż trypsynizowane¹ . Z drugiej strony, leczenie enzymatyczne RNA i/lub enzymy dezagregujące, takie jak trypsyna i kolagenaza, prowadzi do degradacji określonych makrocząsteczek, co jest niepożądane w przypadku niektórych dalszych zastosowań. Idealny proces powinien być jak najkrótszy i obejmować minimalną manipulację, aby osiągnąć dobre zachowanie interesujących makrocząsteczek, takich jak mRNA. Obecne protokoły przygotowania zawiesin komórkowych z tkanek stałych są zwykle czasochłonne, w dużym stopniu zależne od operatora i mogą selektywnie uszkadzać niektóre typy komórek^1,8 .

Przedstawiony tutaj protokół łączy zalety wysoce powtarzalnej i niezwykle krótkiej mechanicznej dezagregacji z brakiem leczenia enzymatycznego, co prowadzi do dobrej jakości zawiesin komórkowych, które mogą być używane do analizy cytometrycznej przepływowej i sortowania⁴ oraz dalszych badań ekspresji genów⁹ .

Protocol

1. Przygotowanie zawiesin komórkowych

1. Ofiarować próbkę do użycia zgodnie z zaleceniami wyspecjalizowanych komitetów, takich jak IACUC lub równoważny (w Urugwaju Narodowa Komisja ds. Doświadczeń na Zwierzętach [CNEA]). W naszym przypadku podano przedawkowanie pentobarbitalu.
2. Wyciąć jądra zgodnie ze standardowymi zatwierdzonymi procedurami i umieścić je na szklanej szalce Petriego o średnicy 96 mm na lodzie, zawierającej 10 ml lodowatego DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą cielęcą.
3. Usuń osłonkę białawą i pokrój zdekapsulowane jądra na kwadratowe kawałki o boku 2 - 3 mm.
4. Kawałki te są następnie przetwarzane w Medimachine, zautomatyzowanym młynku mechanicznym, w którym tkanka jest dezagregowana wewnątrz jednorazowego urządzenia zawierającego perforowane sito ze stali nierdzewnej i metalowy wirnik. W tym celu umieść 1 ml DMEM uzupełnionego na zimno i 4 - 5 tych kawałków w jednorazowym urządzeniu o wielkości 50 μm, włącz deagregator i przetwarzaj przez 50 sekund, postępując zgodnie z prostymi instrukcjami producenta.
5. Odzyskać powstałą zawiesinę komórek z jednostki dezagregacji za pomocą strzykawki o pojemności 3 - 5 ml bez igły.
6. Przefiltrować przez nylonową siatkę o grubości 50 μm, uprzednio nasączoną 0,5 ml dodatku.
7. Ponownie przefiltrować zawiesinę za pomocą nasączonej siatki nylonowej o grubości 25 μm i umieścić na lodzie.
8. Policz w komorze Neubauera i dostosuj stężenie komórkowe do 1 - 2 x 10⁷ komórek/ml z uzupełnionym DMEM. Zwykle uzyskuje się co najmniej 4 x 10⁷ komórek/gram materiału jądra.
9. Na koniec dodaj NDA (kwas 2-naftol-6,8-disulfonowy, sól dipotasowa) do końcowego stężenia 0,2%, aby zapobiec zlepianiu się komórek.
10. Opcjonalnie: sprawdzić żywotność zawiesin komórek jądra za pomocą dostępnego w handlu zestawu do pomiaru żywotności komórek zwierzęcych, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Analiza cytometryczna przepływowa

Użyliśmy cytometru przepływowego Becton-Dickinson FACSVantage wyposażonego w koherentny laser jonowy argonu dostrojony do emisji przy długości fali 488 nm do analizy komórek barwionych wysokimi stężeniami jodku propidyny (PI). (Kwestia wnikania PI do nieutrwalonych komórek pod wpływem stresu została poruszona w innym miejscu^9,10).

1. W przypadku barwienia PI dodać fluorochrom o końcowym stężeniu 50 μg/ml do zawiesiny komórek i inkubować przez 10 minut w temperaturze 0 °C w ciemności.
2. Moc lasera jest ustawiona na 100 mW, a filtr pasmowo-przepustowy 575/26 służy do zbierania fluorescencji emitowanej przez PI w FL2.
3. Pomiary FC wykonujemy dyszą o wielkości 70 μm. Aby posortować populacje spermatocytów, ustaw tryb sortowania na Normal-R lub Normal-C, używając 3 posortowanych kropli jako koperty. Przechowywać probówki do pobierania próbek i pobierania próbek w temperaturze 3–4 °C za pomocą agregatu chłodniczego. Dostosuj różnicę próbek, aby analizować komórki z szybkością od 500 do 1,500 na sekundę.
4. Użyj oprogramowania CellQuest (BD) do analizy następujących parametrów: rozproszenie do przodu (FSC-H), rozproszenie boczne (SSC-H), całkowita emitowana fluorescencja lub obszar impulsu (FL2-A) oraz czas emisji fluorescencji lub szerokość impulsu (FL2-W).

Alternatywnie, użyliśmy kluczowego barwnika Hoechst 33342 do końcowego stężenia 5 μg/ml i inkubowaliśmy przez 10 minut w temperaturze 37 °C w ciemności. Analizę komórek przeprowadzono za pomocą cytometru MoFlo (DakoCytomation) wyposażonego w laser o długości fali wzbudzenia UV o mocy 25 mW i dyszy 70 μm. Manipulacja danymi została wykonana za pomocą oprogramowania Summit v4.3 (DakoCytomation).

Results

Przykład dobrze zdezagregowanej zawiesiny komórek z jąder szczurów, przygotowanej zgodnie z opisanym tutaj protokołem, pokazano na rysunku 1.

W porównaniu do zabiegów enzymatycznych^6,8 i do wcześniej opisanych metod mechanicznej dezagregacji², ta przedstawiona tutaj jest znacznie szybsza, wymaga mniej obsługi, jest łatwo odtwarzalna (nie zależy od operatora) i sprawia, że powstaje niewiele resztek komórkowych (zwłaszcza w porównaniu z innymi metodami mec...

Discussion

Opisana tutaj zoptymalizowana metoda umożliwia przygotowanie zawiesin komórkowych z tkanki jąder gryzoni w bardzo szybki i powtarzalny sposób, unikając obróbki enzymatycznej i detergentowej oraz zachowując dobrą integralność komórek i proporcje typów. Krótkotrwałość procedury (15-minutowy okres obejmuje rozwarstwienie jąder, cięcie tkanek i przetwarzanie), minimalna obsługa i brak zabiegów enzymatycznych to tylko niektóre z głównych zalet. Wszystko to przyczyniłoby się do dobrego zachowania makrocząsteczek o krótkim czas...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
System Medimachine	BD	340587
Jednostka Medicon (50 μ m)	Jednostka BD	340591
Filcon (50 μ m)	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
Surowica cielęca płodu	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
H– chst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Roztwór podstawowy 5 mg/ml; stosowany w końcowym stężeniu 5 μ g/ml
Jodek propidyny	Sigma-Aldrich	287075	roztwór podstawowy 1 mg/ml; stosowany w końcowym stężeniu 50 μn; g/ml