Opisano model kontuzji ciężkiego uszkodzenia rdzenia kręgowego. Opisano szczegółowe etapy przedoperacyjne, operacyjne i pooperacyjne w celu uzyskania spójnego modelu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model stłuczenia ciężkiego uszkodzenia rdzenia kręgowego u szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Potencjał translacyjny nowych metod leczenia powinien być badany w modelach kontuzji ciężkiego rdzenia kręgowego (SCI). Opisano szczegółową metodologię w celu uzyskania spójnego modelu ciężkiego SCI. Zastosowanie stereotaktycznego szkieletu i sterowanego komputerowo impaktora pozwala na stworzenie powtarzalnego urazu. Hipotermia i zakażenie dróg moczowych stanowią poważne wyzwanie w okresie pooperacyjnym. Dokładne monitorowanie zwierząt z dziennym rejestrem masy ciała i odciągania pęcherza moczowego pozwala na wczesne wykrycie powikłań pooperacyjnych. Wyniki funkcjonalne tego modelu kontuzji są równoważne modelom transsekcji. Model kontuzji może być wykorzystany do oceny skuteczności zarówno podejść neuroprotekcyjnych, jak i neuroregeneracyjnych.
Wprowadzenie
Wybór odpowiedniego modelu urazu jest kluczowy dla przedklinicznej oceny nowych metod leczenia urazów rdzenia kręgowego (SCI). 1,2,13 W niedawnym badaniu przeprowadzonym wśród lekarzy i naukowców w dziedzinie modelu kontuzji neurourazowych, w przeciwieństwie do modeli hemisekcji lub pełnej transsekcji, powszechnie uznano za klinicznie istotny. 8 Opinia ta opiera się na spostrzeżeniu, że większość urazów rdzenia kręgowego u ludzi ma charakter stłuczeń. 10 Biologia stłuczenia również wydaje się być odmienna od modeli hemisekcji lub przecięcia. 11 Iseda i wsp. porównali wpływ dordzeniowego wstrzyknięcia ABC chondroitynazy ABC na neuroregenerację oddzielnie w modelach hemisekcji i stłuczeń. 4 Regenerację aksonów zaobserwowano w mostku neuronalnym w hemisekcji, ale nie w grupie stłuczenia SCI. Modele hemisekcji lub całkowitej transsekcji również tworzą warunki, o których wiadomo, że istnieją tylko w bardzo małym podzbiorze okoliczności klinicznych. Na przykład kilku badaczy zastosowało interwencje oparte na rusztowaniach do implantacji w jamie zmiany po hemisekcji lub całkowitej transsekcji w celu przyspieszenia regeneracji. 6 Takie podejście staje się klinicznie nieistotne, ponieważ tworzenie ubytku w uszkodzonym rdzeniu kręgowym jest niepraktyczne i prawdopodobnie nieetyczne.
Zmienność w odzyskiwaniu funkcjonalnym pozostaje głównym wyzwaniem dla modeli kontuzji. 5,12 Zmienność tę można zminimalizować poprzez zastosowanie sterowanego komputerowo impaktora i stabilizację kręgosłupa przed uderzeniem w celu równomiernego dostarczania siły przez objętość rdzenia kręgowego, zwłaszcza brzusznie zlokalizowane drogi motoryczne. Należy zauważyć, że plastyczność i uboczny wkład ocalałych aksonów jest dominującym mechanizmem rekonwalescencji po urazie rdzenia kręgowego. 1 Dlatego nawet niewielkie różnice w technice leczenia stłuczeń mogą prowadzić do znacząco odmiennych wyników. W tym celu opracowaliśmy model ciężkiego uszkodzenia rdzenia kręgowego, który zapewnia stałą objętość stłuczenia i funkcjonalną regenerację porównywalną z modelami transsekcji. Model ten może być wykorzystany do badania zarówno strategii neuroprotekcji, jak i neuroregeneracji jako dowód słuszności koncepcji skuteczności leczenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie przed urazem rdzenia kręgowego
Narzędzia chirurgiczne wymagane do tej procedury to skalpel, chwytaki z zębami i bez, hemostatyki, samozabezpieczające się retraktory, końcówki z cienką końcówką, wkrętak igłowy, wchłanialne szwy i aplikatory do przycinania skóry. Inne wymagane materiały chirurgiczne to serwety chirurgiczne, sterylne prześcieradła do pola operacyjnego, gąbki z gazy, aplikatory z bawełnianymi końcówkami i folia metalowa. Autoklawuj narzędzia i materiały chirurgiczne przed operacją. Korzystaj z indywidualnego zestawu instrumentów i materiałów dla jednego zwierzęcia. Oczyść obszar operacyjny i aparaturę (impaktor, źródło światła, ramkę stereotaktyczną, sterylizatory z kulkami szklanymi i poduszki grzewcze) chusteczkami nasączonymi alkoholem.
Otwórz zasłony chirurgiczne i użyj sterylnych rękawiczek, aby ostrożnie ułożyć pole operacyjne, unikając zanieczyszczenia. Otworzyć sterylnie poszczególne narzędzia i ostrożnie umieścić je w polu operacyjnym. Przykryj gałki i uchwyty aparatu, które mogą być potrzebne podczas zabiegu, sterylną metalową folią. Włącz sterylizator z kulkami szklanymi, aby był gotowy do użycia podczas zabiegu.
2. Przygotowanie zwierząt
Przyprowadź szczury do laboratorium na kilka godzin przed właściwym zabiegiem. Leki przeciwbólowe należy podawać co najmniej godzinę przed spodziewanym zabiegiem (zazwyczaj buprynorfina 1,5 ml 0,006 mg/ml podskórnie). Podawać przedoperacyjne antybiotyki (zwykle Baytril 4 mg/kg podskórnie). Znieczulij szczury za pomocą 90 mg/kg ketaminy i poczekaj, aż nie będzie reakcji na szczypanie palców. Badanie palpacyjne najbardziej widocznego wyrostka kolczystego w odcinku piersiowym kręgosłupa. Ten poziom zazwyczaj odpowiada wyrostkowi kolczystemu T10. Zaznacz położenie zamierzonego poziomu w stosunku do T10. W naszym laboratorium wykonujemy kontuzję T10. Poniższa narracja opisuje technikę T10 SCI. Ogol prostokąt o wymiarach 3 cm x 6 cm wzdłuż i wyśrodkowany na poziomie T10. Oczyść skórę trzykrotnie roztworem Betadine. Nałóż lubrykant okulistyczny na każde oko. Przenieś szczura w wygodnej pozycji na pole operacyjne, ostrożnie, unikając zanieczyszczenia. Włóż sondę temperatury doodbytniczą, aby monitorować temperaturę rdzenia i odpowiednio dostosować ogrzewanie, aby utrzymać temperaturę zwierzęcia jak najbardziej zbliżoną do normalnej (~37.5 °C). Przykryj szczura serwetą chirurgiczną z okienkiem nad polem operacyjnym.
3. Zabieg chirurgiczny
Rozpocznij od około 4 cm nacięcia za pomocą ostrza #10 wyśrodkowanego na znaku T10. Przystąp do cierpliwego preparowania powięzi i warstw mięśniowych z dala od wyrostków kolczystych i blaszek T9-T11. Umieść retraktory, aby cofnąć mięśnie i powięź z dala od kości. Podczas stabilizacji wyrostka kolczystego T9 ostro podziel więzadło międzykolcowe między T9 i T10 za pomocą cienkich nożyczek. Podobnie ustabilizuj wyrostek kolczysty T10 i podziel więzadło międzykolcowe między T10-T11. Użyj powiększenia pętlowego, aby zakończyć podział więzadeł na całej długości więzadła flavum (ryc. 1). Worek oponowy jest łatwo widoczny po odłączeniu więzadła żółtego. Użyj rongeurs z cienką końcówką, aby ostrożnie wykonać obustronnie laminektomię w kawałkach w T10. Dołożono wszelkich starań, aby uniknąć ucisku na worek oponowy w dół i niezamierzonego zranienia przez końcówki rongeur. Blaszka i wyrostek kolczysty T10 są całkowicie usunięte.
Ustaw zwierzę na pozycji na platformie stabilizującej. Użyj zacisków stabilizujących, aby unieruchomić kręgosłup, zaciskając boczne aspekty trzonu kręgu T11, a następnie boczne aspekty trzonu kręgu T9. Uważaj, aby nie wcisnąć szczura na platformę za pomocą zacisków stabilizujących, ponieważ ograniczyłoby to przestrzeń do ruchów oddechowych i zwiększyłoby niepożądany stres zwierzęcia. Po zabezpieczeniu kręgosłupa sprawdzane są ustawienia na impaktorze sterowanym komputerowo. Zazwyczaj używamy końcówki udaru o średnicy 3,0 mm z prędkością 4 cm/s o głębokości 2 mm i czasie przebywania 0,3 sekundy. Wysuń końcówkę impaktora i opuść ją, aż dotknie powierzchni sznurka. Wycofaj końcówkę i opuść urządzenie o 2 mm w kierunku powierzchni rdzenia kręgowego. Zwolnij tłok z prędkością 4 cm/s, aby spowodować poważne stłuczenie rdzenia kręgowego. Osiągnij hemostazę, używając tylko takiego nacisku, aby utrzymać aplikator z bawełnianą końcówką na miejscu, uważając, aby nie wywierać niepotrzebnego nacisku na sznurek. Zszyj warstwy mięśni i powięzi ściegiem w kształcie cyfry 8, uważając, aby nie naciągnąć zbyt mocno za pomocą szwów wchłanialnych. Zamknij skórę za pomocą co najmniej 2 małych zszywek; Można użyć do 4 lub 5 zszywek, jeśli części nacięcia pozostają otwarte po pierwszych 2 lub 3 zszywkach.
3. Opieka pozabiegowa
Umieść szczury w ciepłym otoczeniu o temperaturze około 33-35 °C przez 24 godziny po operacji. Wiąże się to z inkubatorem (gdy dziecko jest nieprzytomne) i ogrzewaną przestrzenią w klatce, gdy zaczną się poruszać. Gdy szczury są w pełni przytomne, podaj podskórnie 5 ml soli fizjologicznej, 1,5 ml (0,006 mg / ml) buprynorfiny i 0,1 ml Baytrilu. Kontynuuj podawanie buprynorfiny podskórnie dwa razy dziennie przez pierwsze 24-48 godzin i Baytrilu raz dziennie przez 7 dni. Pęcherz moczowy powinien być odciągany ręcznie trzy razy na dobę, aż do powrotu funkcji pęcherza (<2 ml moczu w odciąganiu wcześnie rano przez 3 kolejne dni). W tym czasie zwierzęta powinny być również badane pod kątem infekcji (krew w moczu, białawy kolor lub nieprzyjemny zapach), zmniejszonej aktywności fizycznej lub problemów z gojeniem się ran. Występowaniu zakażenia należy przeciwdziałać poprzez zwiększenie dawki (lub ponowne rozpoczęcie leczenia) antybiotyków w porozumieniu z lokalnymi lekarzami weterynarii. Waż szczury codziennie, począwszy od następnego dnia po operacji, aby ocenić ich powrót do zdrowia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Objętość zmiany
Stosując opisaną powyżej technikę, uzyskaliśmy duże i powtarzalne objętości zmian. Przy zastosowaniu barwienia Luxol fast blue uzyskano średnią objętość zmiany wynoszącą 2,04 mm3 (95% CI 1,9-2,18) (n = 5 zwierząt). Rysunek 2 przedstawia średnią objętość zmiany wraz z reprezentatywnym barwieniem Luxol fast blue w obrębie centrum zmiany.
Wyniki funkcjonalne
Wyniki behawioralne zmierzone według skali Bas...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kilka nowatorskich metod leczenia okazało się ostatnio obiecujących w dziedzinie badań nad SCI. 3 Staranna ocena tych metod leczenia jest niezbędna w klinicznie istotnym modelu SCI w celu wybrania strategii o maksymalnym potencjale translacyjnym. Niedawno opracowano schemat klasyfikacji w celu oceny skuteczności badań przedklinicznych. 9 Schemat ten podkreślał znaczenie wykorzystania modelu stłuczenia ciężkiego SCI. W tym miejscu opisujemy taki model stłuczenia ciężkiego SCI ze stałą objętością zmia...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Ujawnianie informacji finansowych – brak
Ujawnienie finansowania – brak.
Podziękowania
Autorzy są wdzięczni Dr. N. Banikowi i Dr. D. Mitchellowi za ich wskazówki w rozwoju tego modelu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Impaktor sterowany komputerowo | Leica lub Infinite Horizons (dawniej OSU) impaktor | ||
| Instrumenty chirurgiczne | |||
| Nożyczki | Fine Science Tools Inc | 14094-11 lub 14060-09 | |
| Kleszcze | Fine Science Tools Inc | 11006-12 i 11027-12 lub 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retraktory | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Sterownik igłowy | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Rama stereotaktyczna | Leica lub RWD Life Science Co. lub systemy | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamina |
Bibliografia
- Blesch, A., Tuszynski, M. H. Spinal cord injury: plasticity, regeneration and the challenge of translational drug development. Trends Neurosci. 32, 41-47 (2009).
- Dobkin, B. H. Curiosity and cure: translational research strategies for neural repair-mediated rehabilitation. Dev. Neurobiol. 67, 1133-1147 (2007).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J. Neurotrauma. 28, 1329-1333 (2011).
- Iseda, T., Okuda, T., Kane-Goldsmith, N., et al. Single, high-dose intraspinal injection of chondroitinase reduces glycosaminoglycans in injured spinal cord and promotes corticospinal axonal regrowth after hemisection but not contusion. J. Neurotrauma. 25, 334-349 (2008).
- Khan, T., Havey, R. M., Sayers, S. T., et al. Animal models of spinal cord contusion injuries. Laboratory Animal Science. 49, 161-172 (1999).
- Kim, B. G., Kang, Y. M., Phi, J. H., et al. Implantation of polymer scaffolds seeded with neural stem cells in a canine spinal cord injury model. Cytotherapy. 12, 841-845 (2010).
- Kim, J. H., Tu, T. W., Bayly, P. V., et al. Impact speed does not determine severity of spinal cord injury in mice with fixed impact displacement. Journal of Neurotrauma. 26, 1395-1404 (2009).
- Kwon, B. K., Hillyer, J., Tetzlaff, W. Translational research in spinal cord injury: a survey of opinion from the SCI community. J. Neurotrauma. 27, 21-33 (2010).
- Kwon, B. K., Okon, E. B., Tsai, E., et al. A grading system to evaluate objectively the strength of pre-clinical data of acute neuroprotective therapies for clinical translation in spinal cord injury. J. Neurotrauma. 28, 1525-1543 (2011).
- Norenberg, M. D., Smith, J., Marcillo, A. The pathology of human spinal cord injury: defining the problems. J. Neurotrauma. 21, 429-440 (2004).
- Siegenthaler, M. M., Tu, M. K., Keirstead, H. S. The extent of myelin pathology differs following contusion and transection spinal cord injury. J. Neurotrauma. 24, 1631-1646 (2007).
- Talac, R., Friedman, J. A., Moore, M. J., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25, 1505-1510 (2004).
- Tator, C. H. Review of treatment trials in human spinal cord injury: issues, difficulties, and recommendations. Neurosurgery. 59, 957-982 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
