Pułapkowanie genów za pomocą Gal4 u danio pręgowanego

Summary

Ten protokół opisuje metodę mutagenezy insercyjnej pułapki genowej przy użyciu Gal4-VP16 jako głównego reportera i GFP/RFP jako wtórnego reportera u danio pręgowanego. Około jedna na dziesięć ryb o wysokiej ekspresji F0 daje potomstwo pułapki genowej koeksprymujące GFP i RFP. Procedurę przesiewową można łatwo przeskalować, aby dostosować ją do wielkości laboratorium wykonującego badanie przesiewowe mutagenezy insercyjnej.

Abstract

Duży rozmiar lęgu i zewnętrzny rozwój optycznie przezroczystych zarodków sprawiają, że danio pręgowany jest wyjątkowym modelem kręgowców do mutagenezy insercyjnej in vivo, wykorzystującej fluorescencyjne reportery do oznaczania ekspresji zmutowanych genów. Kilka laboratoriów skonstruowało i przetestowało wektory pułapek wzmacniających i genowych u zebry pręgowanego, wykorzystując białka fluorescencyjne, aktywatory transkrypcji oparte na Gal4 i lexA jako reportery ^1-7. Wektory te miały dwie potencjalne wady: nieoptymalną rygorystyczność (np. brak zdolności do różnicowania zdarzeń wzmacniających i pułapek genowych) oraz niską mutagenność (np. integracje z genami rzadko wytwarzały allele zerowe). Transpozon łamiący geny (GBT) został opracowany w celu wyeliminowania tych wad ^8-10. Zmodyfikowaliśmy jeden z pierwszych wektorów GBT, GBT-R15, do użytku z Gal4-VP16 jako główny reporter pułapki genowej i dodaliśmy UAS:eGFP jako drugorzędny reporter do bezpośredniego wykrywania zdarzeń pułapki genowej. Zastosowanie Gal4-VP16 jako głównego reportera pułapki genowej ma dwie główne zalety. Po pierwsze, zwiększa wrażliwość na geny ulegające ekspresji przy niskich poziomach ekspresji. Po drugie, umożliwia naukowcom wykorzystanie linii pułapek genowych jako czynników napędzających Gal4 do kierowania ekspresją innych transgenów w bardzo specyficznych tkankach. Jest to szczególnie istotne w przypadku genów o nieistotnych lub nadmiarowych funkcjach, w przypadku których integracja pułapki genowej może nie prowadzić do jawnych fenotypów. Wadą stosowania Gal4-VP16 jako głównego reportera pułapki genowej jest to, że geny kodujące białka z N-końcowymi sekwencjami sygnałowymi nie są podatne na pułapkowanie, ponieważ powstałe białka fuzyjne Gal4-VP16 prawdopodobnie nie będą w stanie dostać się do jądra i aktywować transkrypcji. Co ważne, zastosowanie Gal4-VP16 nie powoduje wstępnej selekcji białek jądrowych: odzyskaliśmy mutacje pułapek genowych w genach kodujących białka, które funkcjonują w jądrze, cytoplazmie i błonie komórkowej.

Introduction

Mutageneza insercyjna okazała się skutecznym podejściem do analizowania funkcji genów w różnych systemach modelowych, od organizmów jednokomórkowych, takich jak bakterie i drożdże, po organizmy wielokomórkowe, takie jak myszy i rośliny. Każde egzogenne DNA (wirus, transpozon lub plazmid) może służyć jako mutagen poprzez przerywanie istotnych elementów genów, takich jak eksony lub promotory. Efektywny cel takich prostych podejść jest niezwykle mały w przypadku dużych złożonych genomów, ponieważ eksony stanowią tylko 1-3% typowego genomu kręgowców. Mały efektywny rozmiar celu można przezwyciężyć dzięki bardzo wysokim wskaźnikom integracji wektorów, czego przykładem jest ogromny sukces retrowirusowej mutagenezy insercyjnej u danio pręgowanego ^11,12. Natomiast introny stanowią około 20-30% genomów kręgowców. U danio pręgowanego wektory mutagenezy insercyjnej oparte na transpozonach, które skutecznie wprowadzają zerowe lub ciężkie mutacje hipomorficzne po integracji z intronami, zostały nazwane "transpozonami łamiącymi geny" (GBT) ^8-10. Aby zapewnić efektywną integrację pułapek genowych, używają minimalnego transpozonu Tol2 ^13,14. Mutagenność GBT opiera się na pochodzącym z ryb akceptorze splicingu i sekwencjach terminacji/poliadenylacji transkrypcji. Elementy odpowiedzialne za mutagenność GBT są otoczone bezpośrednimi miejscami loxP do wycięcia przez rekombinazę Cre. Tak więc wstrzyknięcie mRNA Cre prowadzi do skutecznego odwrócenia mutacji indukowanych przez GBT, mimo że niektóre sekwencje transpozonów pozostają w locus ^{integracji 9,10}.

Ostatnio opublikowane wektory GBT używają mRFP jako reportera pułapek genowych ^9,10, co prowadzi do dwóch potencjalnych niedociągnięć. Po pierwsze, nie wiadomo, jaka część genów danio pręgowanego ulega ekspresji na wystarczająco wysokim poziomie, aby można ją było wykryć za pomocą bezpośrednich fluorescencyjnych białek reporterowych. Po drugie, oczekuje się, że tylko niewielki podzbiór genów będzie pełnił podstawowe funkcje. Szacuje się, że do rozwoju danio pręgowanego potrzebnych jest tylko 1400-2400 genów. Oczekuje się, że większość mutantów pułapek genowych nie będzie wykazywać jawnych fenotypów i dlatego będzie miała ograniczoną użyteczność. Aby przezwyciężyć te dwa ograniczenia, zmodyfikowaliśmy GBT-R15 ^9,10 do stosowania z Gal4-VP16 jako głównym reporterem pułapki genowej (Balciuniene i wsp. w przygotowaniu). Podobnie jak w przypadku mRFP bez AUG w GBT-R15, strona startowa tłumaczenia została usunięta z Gal4-VP16. W celu bezpośredniego wykrywania zdarzeń pułapek genowych, nasze wektory zawierają reporter eGFP pod kontrolą 14x Gal4 UAS ^17,18.

Kilka dodatkowych funkcji zostało zaprojektowanych w naszym dwudzielnym wektorze pułapki genowej. Kaseta UAS:eGFP jest otoczona bezpośrednimi miejscami FRT (szare szewrony na rysunku 1). Wstrzyknięcie mRNA rekombinazy Flp prowadzi do wycięcia kasety UAS:eGFP, pozostawiając mutację pułapki genowej nieoznaczoną fluorescencją eGFP. Następnie może być stosowany w liniach transgenicznych, które oznaczają określone tkanki lub zdarzenia rozwojowe za pomocą fluorescencji GFP. Podobnie jak w innych GBT, cała kaseta pułapki genowej jest otoczona bezpośrednimi miejscami loxP (otwarte pięciokąty na rysunku 1). To sprawia, że zdarzenia pułapki genowej są odwracalne przez ekspresję rekombinazy Cre, co łatwo ustanawia dowód związku przyczynowego między określoną integracją pułapki genowej a obserwowanym fenotypem (Figura 2). Wreszcie, kaseta pułapki genowej jest otoczona odwróconymi miejscami meganukleazy I-SceI (czarne trójkąty na rycinie 1). U Drosophila integracje transpozonów są często przekształcane w delecje (niedobory) przez nieprecyzyjne wycięcie elementu P. Nie ma dowodów na to, że wycięcie transpozonu Tol2 (lub jakiegokolwiek innego transpozonu aktywnego u kręgowców, takiego jak Sleeping Beauty, PiggyBac lub Ac/Ds) może prowadzić do delecji. W związku z tym włączyliśmy miejsca I-SceI jako potencjalną zastępczą metodę indukcji delecji, mimo że nie ma dowodów na to, że I-SceI może indukować delecje u danio pręgowanego. Należy zauważyć, że podczas gdy meganukleaza I-SceI może być stosowana do ułatwiania transgenezy u danio pręgowanego, rozszczepianie DNA przez meganukleazę I-SceI służy do badania mechanizmów naprawy DNA, w tym podatnego na błędy niehomologicznego łączenia końców, w komórkach drożdży i ssaków ^19-22.

Integracja naszego wektora pułapki genowej może prowadzić do ekspresji eGFP za pomocą dwóch różnych mechanizmów. Pierwszym z nich jest prawdziwa pułapka genowa (ryc. 1C): wektor integruje się z genem (IMG dla genu zmutowanego insercyjnie), transkrypt fuzyjny między 5' endogennego transkryptu IMG a Gal4-VP16 jest wytwarzany i translowany do białka fuzyjnego zawierającego N-koniec białka kodowanego przez IMG i Gal4-VP16. To białko fuzyjne wiąże się z 14x UAS i aktywuje transkrypcję eGFP. Drugim, mniej pożądanym zdarzeniem jest pułapka wzmacniacza (ryc. 1D): minimalny promotor przed eGFP wpada pod kontrolę wzmacniacza w pobliżu miejsca integracji, co prowadzi do produkcji eGFP przy braku produkcji Gal4-VP16. W naszych szacunkach 30-50% zdarzeń związanych z ekspresją eGFP jest spowodowanych pułapką wzmacniającą, a 50-70% jest spowodowanych pułapką genową ²³ (Balciuniene i wsp. w przygotowaniu). Aby rozróżnić te dwie klasy zdarzeń, stworzyliśmy linię transgeniczną 14xUAS:mRFP (Rysunek 1B), dla wygody oznaczoną specyficznym dla soczewki γCry:GFP (Balciuniene i in. w przygotowaniu). Zdarzenia pułapki genowej są weryfikowane przez koekspresję GFP i RFP (porównaj C i D na rysunku 2).

Na naszym ekranie pilotażowym odzyskaliśmy ponad 40 przypadków pułapek genowych po przebadaniu 270 ryb F0, którym wstrzyknięto mieszaninę transpozonu DNA i transpozazy mRNA. Dwie z naszych integracji pułapek genowych nastąpiły w genach z wcześniej opublikowanymi mutantami indukowanymi chemicznie: nsf i flr. Fenotypy naszych mutantów insercyjnych nsf^tpl6 i flr^tpl24 są powierzchownie nie do odróżnienia od fenotypów odpowiednich mutantów indukowanych chemicznie. Zauważyliśmy również, że zdarzenia pułapki genowej wydają się być stronnicze w kierunku intronów w pobliżu końca 5' genów, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo wystąpienia alleli zerowych. Obserwujemy pewien stopień wyciszenia (zmienności) UAS we wszystkich naszych liniach pułapek genowych, a niektóre loci są wyraźnie bardziej podatne na różnorodność niż inne. Nie uważamy, że wyciszanie UAS stanowi istotny problem dla rozmnażania linii pułapek genowych, ponieważ byliśmy w stanie łatwo rozmnażać wszystkie nasze linie pułapek genowych przez co najmniej pięć pokoleń, selekcjonując je wyłącznie pod kątem ekspresji GFP.

Protocol

1. Produkcja pokolenia F0 przez mikrointrykcję pułapki genowej.

Odkryliśmy, że zarodki o różnym pochodzeniu genetycznym wykazują różną tolerancję na tę procedurę, przy czym najbardziej tolerancyjne są szczepy dzikie ze sklepów zoologicznych i Tuebingen - Long Fin (TLF), podczas gdy szczepy AB i Tuebingen mają gorszą przeżywalność.

1. Przygotowanie transpozonu DNA. Przygotuj plazmidowe DNA GBT-B1 (pDB783, Balciuniene i wsp. w przygotowaniu) za pomocą standardowego zestawu miniprep QIAprep (Qiagen 27106). Konieczne jest uwzględnienie etapu płukania PB (który jest opcjonalny w procedurze QIAprep), w przeciwnym razie DNA miniprep zostanie zanieczyszczone przez RNazę, co doprowadzi do degradacji mRNA transpozazy. Przed wstrzyknięciem należy rozcieńczyć DNA w wodzie wolnej od RNaz (Ambion AM9937) do 10 ng/μl.
2. Przygotowanie mRNA transpozazy. Linearyzuj pT3TS/Tol2 (pDB600) ¹³ za pomocą XbaI i transkrybuj zlinearyzowane DNA za pomocą zestawu do transkrypcji in vitro mMessage Machine T3 (Ambion AM1348). Zmodyfikowaliśmy reakcję transkrypcji in vitro, dodając 0,5 μl inhibitora RNazy RiboLock (ThermoFisher Fermentas EO0381). Po etapie leczenia DNazą oczyść mRNA za pomocą zestawu RNeasy MinElute (Qiagen 74204). Oceń jakość transkrybowanego mRNA in vitro za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Rozcieńczyć mRNA w wodzie wolnej od RNaz do 40 ng/μl i przechowywać jako 2 μl podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
3. Przygotowanie mieszanki do mikroiniekcji. Przed wstrzyknięciem dodać 8 μl rozcieńczonego transpozonu DNA do 2 μl podwielokrotności mRNA transpozazy.
4. Mikroiniekcja. Wstrzyknąć 3 nl mieszaniny DNA/RNA do żółtka 1-komórkowego zarodka danio pręgowanego przy użyciu standardowych technik mikroiniekcji, dążąc do granicy żółtka/blastomeru. Pobieraj zarodki co 20 minut, aby zapewnić wstrzyknięcie w fazie 1 komórki. Z naszego doświadczenia wynika, że wprawna osoba może z łatwością wstrzyknąć 1000 zarodków w ciągu 1-1,5 godziny.
5. Po wstrzyknięciu przelej 5 μl pozostałego roztworu do wstrzykiwań na 1% żelu agarozowym w celu kontroli jakości, aby upewnić się, że mRNA transpozazy nie uległo degradacji.
6. Pielęgnacja zarodków iniekcyjnych. Późnym popołudniem należy usunąć niezapłodnione i nieprawidłowe zarodki i rozprowadzić je do 60-80 na 100 mm szalki Petriego. Nieprawidłowe i martwe zarodki są usuwane po 1 dniu od zapłodnienia (dpf), 2 dpf i 3 dpf.
7. Badania przesiewowe w kierunku ekspresji GFP. Badania przesiewowe zarodków bez jawnych wad pod kątem fluorescencji GFP przy 3 dpf (ryc. 3). Badania przesiewowe można wykonać zarówno na mikroskopie stereoskopowym wyposażonym w fluorescencję (używamy SMZ1500 Nikona), jak i na mikroskopie pionowym (używamy Zeiss AxioImager z obiektywem 5X Fluar). Niska ekspresja GFP wskazuje na nieudane wstrzyknięcie lub degradację transpozazy RNA z powodu zanieczyszczenia RNazą (Figura 3A). Wybierz około 30% najjaśniejszych zarodków, które mają ekspresję GFP w wielu tkankach lub w dużym odsetku komórek określonej tkanki (porównaj ryciny 3B i 3C). Z wstrzyknięcia 1000 zarodków zwykle otrzymujemy do 100 normalnych rozwojowo zarodków o wysokiej ekspresji GFP.
8. Hoduj wybrane zarodki F0 przy użyciu standardowych procedur hodowli danio pręgowanego. Rozsądne jest oczekiwanie, że 20-30% wstrzykniętych zarodków wybranych do hodowli przetrwa do dorosłości.

2. Konserwacja linii testera UAS:mRFP.

Wygenerowano linię 14xUAS:mRFP oznaczoną specyficznym dla obiektywu γCry:GFP. Ponieważ UAS jest wyciszany poprzez metylację DNA, ważne jest, aby wybierać ryby o niskim poziomie wyciszenia do rozmnażania stada.

1. Skonfiguruj indywidualne homozygoty UAS:mRFP do kojarzenia z jedną z naszych najbardziej niezawodnych linii pułapek genowych Gal4, nsf^tpl6 (Balciuniene i wsp. w przygotowaniu).
2. Następnego dnia przenieś rybę UAS:mRFP, która oddała zarodki, do poszczególnych zbiorników statycznych, podczas gdy zarodki są zbierane i czyszczone.
3. Badania przesiewowe zarodków pod kątem fluorescencji GFP i RFP przy 1 dpf i 3 dpf.
4. Krzyżowanie ryb, które dały zarodki o wysokiej ekspresji mRFP, aby ustanowić następną generację linii UAS: mRFP.

3. Badanie przesiewowe ryb F0.

1. Skrzyżuj osobnik F0 z homozygotyczną rybą UAS:mRFP (ryc. 4). Zwykle wstrzykujemy nasze GBT do linii z wzorami pigmentacji typu dzikiego lub lamparta, a nasza homozygotyczna linia UAS:mRFP jest na mosiężnym tle. W związku z tym ryby F0 z wstrzyknięciem GBT można łatwo odróżnić od ryb UAS:mRFP, eliminując potrzebę rejestrowania, czy badany F0 był samcem czy samicą, a także potencjalne błędy wynikające z błędów w rejestrowaniu i/lub określaniu płci każdej ryby. Personel o bardzo ograniczonym doświadczeniu, taki jak studenci studiów licencjackich, jest więc w stanie ustawić i rozłożyć krycia ryb. Podejście to ma tę wadę, że wykorzystuje się dwa różne tła genetyczne, co potencjalnie komplikuje interpretację fenotypów utraty funkcji.
2. Następnego dnia zwróć mosiężne ryby UAS:mRFP do ich zbiornika. Umieść rybę F0, która dała zarodki, w indywidualnych zbiornikach statycznych (używamy Hagen Exo Terra Faunarium Small, ale do tego celu można użyć dowolnego małego zbiornika), podczas gdy zarodki są zbierane i badane.
3. Oczyść i przenieś pobrane zarodki na nowe szalki Petriego (<100 na szalkę) po południu dnia 0.
4. Badania przesiewowe zarodków pod kątem fluorescencji GFP i RFP przy 1 dpf, 2 dpf i 3 dpf. Wyciągnij zarodki dodatnie zarówno dla GFP, jak i RFP, posortuj je według wzorca ekspresji GFP/RFP (jeśli w lęgu obserwuje się więcej niż jeden wzorzec) i podnieś je, aby ustalić pokolenie F1.
5. Poddaj eutanazji ryby F0, które wydały tylko ujemne zarodki (z całkowitej liczby 50-100 zarodków).
6. Ponownie skrzyżuj ryby F0, które wyprodukowały potomstwo z dodatnim wynikiem GFP/RFP, aby uzyskać drugą partię dodatnich.

4. Badanie przesiewowe ryb F1.

Ryby F1 są badane w celu ustalenia rodzin F2, udokumentowania wzorca ekspresji pułapki genowej i zamrożenia partii zarodków w celu molekularnej identyfikacji loci pułapki genowej za pomocą 5' RACE i odwrotnego PCR.

1. Skrzyżowanie poszczególnych ryb F1 z homozygotyczną rybą UAS:mRFP (ryc. 4).
2. Następnego dnia umieść ryby F1, które dały zarodki, w indywidualnych zbiornikach statycznych, podczas gdy zarodki są zbierane i poddawane badaniom przesiewowym.
3. Badania przesiewowe zarodków pod kątem fluorescencji GFP i RFP przy 1 dpf, 2 dpf i 3 dpf. Oddziel i sfotografuj zarodki z pozytywnym wynikiem zarówno dla GFP, jak i RFP ²⁴.
4. W 5 dpf zamrozić partie 20 zarodków GFP/RFP-dodatnich i 20 GFP/RFP-ujemnych w celu identyfikacji genów zmutowanych insercyjnie metodą odwrotnego PCR i 5' RACE ^9,10. Hodować pozostałe zarodki z dodatnim wynikiem GFP/RFP, aby ustanowić pokolenie F2.

Results

W udanym wstrzyknięciu, co najmniej 80% zarodków, którym wstrzyknięto DNA z pułapką genową / mieszanką mRNA transpozazy Tol2, wykazuje pewien stopień fluorescencji GFP (Rysunek 3). Kiedy najjaśniejsze zarodki GFP-dodatnie (Figura 3C) zostaną wybrane do utworzenia puli F0, około jedna na 10 przebadanych ryb F0 wyda potomstwo pułapki genowej. Wśród ryb F0, od których odzyskuje się zdarzenia pułapki genowej, większość przenosi pojedyncze zdarzenie pułapki genowej oprócz kilku nieeksprymujących integracji transpozonów. Ustaliliśmy jednak do czterech linii pułapek genowych od jednego osobnika F0. Wzorce ekspresji GFP/RFP w liniach pułapek genowych wahają się od skrajnie specyficznych dla tkanek (na przykład w opuszkach węchowych) do dość wszechobecnych.

Rysunek 1. Dwudzielny wektor pułapki genowej GBT-B1 zawierający Gal4 i jego zastosowania. ZA. Składniki wektora pułapki genowej zawierającej Gal4: Tol2 5' i Tol2 3', minimalne końce transpozonu Tol2 ¹³; cSA, akceptor spawów karpiowych β-aktynowych ⁸; ^Gal4-VP16, bez AUG Gal4-VP16; zp(A), danio pręgowany β-aktyna 3' UTR i elementy poli(A) z GBT-R15 ^9,10. 14XUAS, eGFP i SV40 p(A) są elementami składowymi kasety ekspresji UAS:eGFP ^17,18. Strzałka wskazuje aktywację UAS:eGFP przez Gal4-VP16 wytwarzaną przez pułapkę genową. Ur. Transgen 14XUAS:mRFP oznaczony przez specyficzną dla soczewek kasetę γCry:GFP. Strzałka wskazuje aktywację UAS:mRFP przez Gal4-VP16 w trans. C. Zdarzenie pułapki genowej. Niebieskie pola to eksony. Łączenie jest oznaczone linią przerywaną. D. Zdarzenie pułapki wzmacniającej. Integracja wektora w pobliżu wzmacniacza (brązowa skrzynka) może umieścić minimalny promotor eGFP pod kontrolą tego wzmacniacza (brązowa strzałka). Spowodowałoby to specyficzną tkankowo ekspresję eGFP, ale ponieważ Gal4-VP16 nie jest wytwarzany, ekspresja mRFP nie zostałaby aktywowana.

Rysunek 2. Odwrócenie zdarzeń pułapki genowej za pomocą rekombinazy Cre. A, B. Diagram mutacji pułapki genowej (A) i allelu pułapki genowej odwróconej Cre (B). C, D. Koekspresja GFP (C) i RFP (D) w układzie nerwowym linii pułapki genu nsf^tpl6. E, F. Wstrzyknięcie Cre RNA do zarodków nsf^tpl6 prowadzi do utraty ekspresji GFP (E) i RFP (F). Należy pamiętać, że nie ma zmniejszenia ekspresji GFP w soczewce, zgodnie z oczekiwaniami.

Rysunek 3. Zarodki, którym wstrzyknięto pułapkę genu GBT-B1 (pDB783). ZA. Zarodki, którym wstrzyknięto sam pGBT-B1 (pDB783), wykazują niewielką fluorescencję GFP w organizmie. B, C. Zarodki, którym wstrzyknięto mRNA transpozazy pGBT-B1 i Tol2: losowa grupa zarodków (B) i osób o wysokiej ekspresji wybranych do hodowli (C).

Rysunek 4. Zarys doświadczalny dla ustanowienia linii pułapek genowych Gal4. Częściowo nakładające się na siebie czerwono-zielone struktury wskazują na koekspresję GFP i RFP, podczas gdy sama zieleń wskazuje na mozaikowość dla zdarzeń pułapki genowej lub pułapki wzmacniającej.

Discussion

Opisane tutaj wektory pułapek genowych i metodologia są już wykorzystywane w kilku niezależnych laboratoriach. Z naszego doświadczenia wynika, że proces ten składa się z dwóch kluczowych etapów. Pierwszym krytycznym krokiem jest osiągnięcie wysokich wskaźników integracji pułapek genowych w zarodkach, którym wstrzyknięto F0. Niepowodzenie na tym etapie można często przypisać zanieczyszczeniu odczynników do wstrzykiwań RNazą, zwłaszcza DNA miniprepu. Bardzo ważne jest również wstrzykiwanie zarodków w stadium 1 komórki do eksperymentów z pułapkami genowymi. Z naszego doświadczenia wynika, że transgeneza za pośrednictwem Tol2 jest bardzo wydajna, co umożliwia uzyskanie linii transgenicznych nawet przy wstrzyknięciu później niż w stadium 1 komórki lub z DNA o niższej jakości. Iniekcje niespełniające norm są znacznie bardziej problematyczne podczas przeprowadzania mutagenezy pułapek genowych, ponieważ tylko niewielka część integracji wektorów prowadzi do skutecznych zdarzeń pułapek genowych. Drugim krytycznym krokiem jest ustalenie zdarzeń pułapki genowej poprzez przekroczenie naszej linii UAS:mRFP. Brak wyrażenia mRFP prawie zawsze wskazuje na zdarzenie pułapki wzmacniacza. Czasami jednak brak wyrażenia mRFP może wskazywać na wyciszenie 14x UAS. Dlatego ważne jest, aby utrzymać linię UAS:mRFP w stanie niewyciszonym poprzez propagację następnego pokolenia przy użyciu osobników o wysokiej ekspresji RFP po skrzyżowaniu z nsf^tpl6.

Możemy przewidzieć wprowadzenie kilku ulepszeń do naszych wektorów pułapek genowych i protokołu. Pierwszym z nich jest użycie mniej powtarzalnego UAS w konstrukcji pułapki genowej. Wykazano, że 5-krotny UAS jest wystarczający do osiągnięcia pełnej aktywacji w eksperymentach z hodowlami komórkowymi, a mniej powtarzalne sekwencje UAS są mniej podatne na metylację i wyciszenie ^6,25. Możliwe jest również zaprojektowanie wektorów pułapek genowych dla w pełni warunkowej mutagenezy, analogicznie do wektorów stosowanych przez międzynarodowe konsorcjum pułapek genowych na myszy i ostatnio zaadaptowanych dla danio pręgowanego ^2,26,27. Kolejnym ulepszeniem byłoby użycie innego systemu transpozonów, na przykład Sleeping Beauty ^28, do wygenerowania linii reportera UAS:mRFP. Umożliwiłoby to wstrzyknięcie pułapek genowych opartych na Tol2 bezpośrednio do linii reporterowej i badanie przesiewowe F0 poprzez krzyżowanie. Co więcej, wyeliminowałoby to stosowanie dwóch różnych środowisk genetycznych, co ułatwiłoby interpretację fenotypów utraty funkcji. Nawet przy tych ulepszeniach, ogólny protokół pułapki genowej Gal4 przedstawiony tutaj nadal będzie w pełni możliwy do zastosowania.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw Miniprep	Qiagen	27104	Opcjonalny etap mycia PB jest koniecznością
Enzym ograniczający XbaI	ThermoFisher	ER0681
mMessage Machine T3	Ambion	AM1348
Inhibitor RNazy RiboLock	ThermoFisher	EO0381
RNeasy MinElute	Qiagen	74204	Może być zastąpiony przez ekstrakcję fenolu i opad atmosferyczny. Kiedy nie stosować LiCl!
Woda wolna od nukleaz	Ambion	AM9937	Musi być niepoddana obróbce DEPC
Kapilarki ze szkła borokrzemianowego do igieł do mikroiniekcji	World Precision Instruments	1B100F-4
Mikrokapilarze do kalibracji	Drummond Scientific	1-000-0010
Końcówki do mikroładowarek	Eppendorf	5242 956.003
Ściągacz igieł *	Sutter Instrumenty	P-87
Stereoskop do mikroiniekcji *	Nikon	SMZ1500	Używamy również Wild 5M i Olympus SZ61 ze statywem do światła przechodzącego
Picoinjector *	Harvard Instruments	Pli-90	Używamy również Pli-100
Mikroskop przesiewowy z fluorescencją GFP/RFP *	Obiektyw Zeiss	Zeiss AxioImager	5X Fluar ma wystarczającą odległość roboczą
Mikroskop przesiewowy z fluorescencją GFP/RFP *	Nikon	SMZ1500
* Sugerujemy ten sprzęt tylko dlatego, że z powodzeniem używamy go w naszym laboratorium. W każdej kategorii dostępnych jest kilka porównywalnych opcji od wielu producentów.