Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykrywanie i interpretacja sygnałów węchowych są kluczowe dla przetrwania wielu organizmów. Co ciekawe, gatunki z różnych typów mają uderzająco podobne systemy węchowe, co sugeruje, że biologiczne podejście do wykrywania chemicznego zostało zoptymalizowane w czasie ewolucji1. W układzie węchowym owadów substancje zapachowe są przenoszone przez neurony receptora węchowego (ORN) w antenie, które przekształcają bodźce chemiczne w ciągi potencjałów czynnościowych. Dane sensoryczne z ORN są następnie przekazywane do płata antenowego (AL; struktura analogiczna do opuszki węchowej kręgowców). W AL neuronalne reprezentacje zapachów przyjmują formę czasoprzestrzennych wzorców wypalania rozmieszczonych w zespołach głównych neuronów (PN; określanych również jako neurony projekcyjne)2,3. Wyjście AL jest następnie przetwarzane przez komórki Kenyona (KC) w dalszym ciele grzyba (MB), strukturze związanej z pamięcią węchową i uczeniem się4,5. W tym miejscu przedstawiamy techniki rejestracji elektrofizjologicznej w celu monitorowania reakcji neuronalnych wywołanych zapachem w tych obwodach węchowych.
Po pierwsze, prezentujemy metodę pojedynczego rejestrowania sensillum do badania reakcji wywołanych zapachem na poziomie populacji ORNs6,7. Omawiamy zastosowanie zaostrzonych szklanych pipet wypełnionych solą fizjologiczną jako elektrod do zewnątrzkomórkowego monitorowania odpowiedzi ORN. Następnie przedstawiamy metodę zewnątrzkomórkowego monitorowania odpowiedzi PN przy użyciu komercyjnej 16-kanałowej elektrody3. Podobne podejście przy użyciu wykonanej na zamówienie 8-kanałowej tetrody ze skrętu drutowego zostało zademonstrowane dla nagrań z ogniw Kenyon8. Podajemy szczegóły naszej eksperymentalnej konfiguracji i przedstawiamy reprezentatywne ślady nagrań dla każdej z tych technik.
Protokół
1. Przygotowanie i dostarczanie zapachu
- Rozcieńczyć objętościowo roztwory zapachowe w oleju mineralnym, aby osiągnąć pożądany poziom stężenia. Przechowuj 20 ml mieszaniny oleju mineralnego i środka zapachowego w szklanej butelce o pojemności 60 ml. Włożyć dwie igły strzykawki do gumowego korka (rys. 19), jedną od dołu, a drugą od góry, aby zapewnić przewód wlotowy i wylotowy. Uszczelnij szklaną butelkę tym gumowym korkiem i przymocuj specjalnie zaprojektowany filtr z węglem aktywnym do przewodu dolotowego (Rysunek 1A).
- Filtr węglowy wykonany jest za pomocą dwóch strzykawek o pojemności 6 ml. Przeciąć strzykawki na pół i wyrzucić ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reakcje pojedynczego ORN wywołane zapachami dwóch różnych alkoholi przedstawiono na Rysunku 3D. W zależności od miejsca rejestracji (typ sensilli, umiejscowienie elektrody) możliwe jest uzyskanie rejestracji wielojednostkowych.
Surowy przebieg fali zewnątrzkomórkowej z rejestracji AL przedstawiono na Ryc. 6A. W tym zapisie napięcia można zaobserwować potencjały czynnościowe lub kolce o różnych amplitudach, pochodzące od różnych PN. Chociaż płat antenny szarańc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Większość bodźców czuciowych wywołuje reakcje kombinatoryczne, które są rozmieszczone w zespołach neuronów. W związku z tym konieczne jest jednoczesne monitorowanie aktywności wielu neuronów, aby zrozumieć, w jaki sposób informacje specyficzne dla bodźca są reprezentowane i przetwarzane przez obwody neuronalne w mózgu. W tym miejscu zademonstrowaliśmy zewnątrzkomórkowe techniki rejestracji wielojednostkowej, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech centrach przetwarzania wzdłuż szlaku węchowego .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować następującym za sfinansowanie tej pracy: hojne fundusze na rozpoczęcie działalności z Wydziału Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu Waszyngtońskiego, grant McDonnell Center for Systems Neuroscience, grant Biura Badań Marynarki Wojennej (Grant#: N000141210089) dla B.R.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sprzęt do elektrofizjologii | |||
| A.C. wzmacniacz | GRASS | Model P55 | do nagrań single sensillum |
| Monitor audio (model 3300) | A-M Systems | 940000 | |
| Wykonany na zamówienie 16-kanałowy przedwzmacniacz i wzmacniacz | Cal. Tech. Biologia Elektronika Sklep | z nagraniami AL i MB | |
| Jednostka akwizycji danych | National Instruments | BNC-2090 | |
| Światłowód WPI | SI-72-8 | ||
| Źródło światła 115 V | WPI | NOVA | |
| Ręczny mikromanipulator | WPI | M3301R | do zapisów mózgu szarańczy |
| Mikroskop stereoskopowy1 na stojaku | Leica | M80 | do nagrań mózgu szarańczy |
| Mikroskop stereoskopowy2 | Leica | M205C | do nagrań jednozmysłowych |
| Stół wibroizolacyjny | TMC | 63-500 | |
| Mikromanipulator z napędem | silnikowym Sutter Instruments | Oscyloskop MP285/T | |
| Tektronix | TD2014B | ||
| Elektrody/Narzędzia budowlane | |||
| 16-kanałowa elektroda | NeuroNexus | A2x2-tet-3mm-150-121 | do nagrań krzywkowych antenowych |
| Borokrzemianowe rurki kapilarne z żarnikiem, ID 0,69 mm | Sutter Instruments | BF120-69-10 | do wykonywania elektrod szklanych |
| Ściągacz do mikropipet | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Generator funkcyjny | Multimetr Magazyn | SG1639A | do pozłacania elektrod |
| Roztwór do złocenia (bez cyjanku) | SIFCO Industries | NC SPS 5355 | |
| Tester impedancji | BAK Electronics Inc. | IMP-2 | do elektrod złoconych |
| Przełącznik obrotowy | Elektroprzełącznik | C7D0123N | do pozłacania elektrod |
| Izolator impulsów | WPI | A365 | do elektrod pozłacanych |
| Uchwyt elektrody serii Q | Warner | Instruments 64-1091 | |
| Srebrny drut o średnicy 0,010" | Elektroda | ||
| uziemiająca AM Systems 7825008-pinowe gniazdo DIP IC | Digikey | ED90032-ND | |
| borokrzemianowe rurki kapilarne z żarnikiem, ID 0,58 mm | Warner Instruments | 64-0787 | |
| Opalarka | Weller | 6966C | |
| Rediohm-800 drut | Kanthal Precision Technologies | PF002005 | |
| Wytrząsarka płytkowa Thermo | Scientific | 4625Q | druty |
| skręcaneNożyczki z węglików spiekanych, 4,5" | Biomedical Research Instr | 25-1000 | do cięcia skręconych drutów tetrodowych |
| Pęseta z cienkim czubkiem | HECO | 91-EF5-SA | do rozdzielania |
| Odor Delivery | |||
| 6 ml strzykawka | Kendall | 1180600777 | do specjalnie zaprojektowanego filtra z węglem aktywnym |
| Brązowe butelki zapachowe | Fisher | 08-912-165 | |
| Węgiel drzewny | BuyActivatedCharcoal.com | GAC-48C | |
| Suszarka adsorpcyjna | 23005 | ||
| Suszarka do gazów Drierite | Fischer Scientific | 09-204 | |
| Rurka termokurczliwa | 3M | EPS-200 | przygotowanie filtra zapachów |
| Aluminiowa piasta igły podskórnej, manometr 19 | Kendall | 8881-200136 | do dostarczania przewodów wlotowych i wylotowych do butelek zapachowych |
| Olej mineralny | Mallinckrodt Chemicals | 6357-04 | do rozcieńczania zapachów |
| Rurka z tworzywa sztucznego Nalgene, 890 FEP | Thermo Scientific | 8050-0310 | do dostarczania gazu nośnego |
| Pneumatyczna pompa pikopump | WPI | sys-pv820 | do dostarczania zapachów |
| Rurka polietylenowa ID 0,86 mm | Intramedic | 427421 | do przyłączy wylotowych butelek zapachowych i rurki do obfitości soli fizjologicznej |
| Korki | Lab Pure | 97041 | do uszczelniania butelek zapachowych |
| Taśma czasu | PDC | T-534-RP | |
| Rurka luer | Cole-Parmer | 30600-66 | |
| Rura próżniowa | McMaster-Carr | 5488K66 | |
| Przygotowanie/Rozwarstwienie | |||
| 100 x 15 mm szalka Petriego | VWR International | 89000-304 | |
| 18 AWG drut miedziany | Lapp | 4510013 | |
| 22 AWG linka połączeniowa | AlphaWire | 1551 | platforma |
| mózgowa Wosk batikowy | Żakard | 7946000 | |
| Peryferia dentystyczne Wosk | Henry-Schein Dental | ||
| Electrowaxer | Almore International | 66000 | |
| Epoksyd, 5 min | Permatex | 84101 | |
| Aluminiowa piasta igły podskórnej | Kendall | 8881-200136 | |
| Proteaza z Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | do usuwania pochwy mózgu szarańczy |
| Nić do szwów niesterylna | Fisher | NC9087024 | do wiązania brzucha po usunięciu jelit |
| Vetbond | 3M | 1469SB | do uszczelniania miejsc amputacji |
| Kleszcze Dumont #1 (grube) | Kleszcze tytanowe WPI | 500335 | |
| Dumont #5 (cienkie) | WPI | 14096 | |
| Kleszcze do #5SF Dumont (bardzo cienkie) | 500085 | pochwy do mózgu szarańczy | |
| 10 cm nożyczki preparacyjne | WPI | 14393 | do usuwania nóg i skrzydeł |
| Nożyczki Vannas (cienkie) | WPI | 500086 | do usuwania naskórka, przecinania jelita |
| Saline Profusion | |||
| Zestaw przedłużający z regulatorem przepływu | Moore Medical | 69136 | do regulacji przepływu soli |
| fizjologicznej Zestaw do podawania IV z miejscem wstrzyknięcia Y | Moore Medical | 73190 | do regulacji przepływu soli fizjologicznej |
Bibliografia
- Ache, B. W., Young, J. M. Olfaction: diverse species, conserved principles. Neuron. 48, 417-430 (2005).
- Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. Temporal representations of odors in an olfactory network. Journal of Neuroscience. 16, 3837-3847 (1996).
- Stopfer, M., Jay....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
