Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Summary

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Abstract

Wykrywanie i interpretacja sygnałów węchowych są kluczowe dla przetrwania wielu organizmów. Co ciekawe, gatunki z różnych typów mają uderzająco podobne systemy węchowe, co sugeruje, że biologiczne podejście do wykrywania chemicznego zostało zoptymalizowane w czasie ewolucji¹. W układzie węchowym owadów substancje zapachowe są przenoszone przez neurony receptora węchowego (ORN) w antenie, które przekształcają bodźce chemiczne w ciągi potencjałów czynnościowych. Dane sensoryczne z ORN są następnie przekazywane do płata antenowego (AL; struktura analogiczna do opuszki węchowej kręgowców). W AL neuronalne reprezentacje zapachów przyjmują formę czasoprzestrzennych wzorców wypalania rozmieszczonych w zespołach głównych neuronów (PN; określanych również jako neurony projekcyjne)^2,3. Wyjście AL jest następnie przetwarzane przez komórki Kenyona (KC) w dalszym ciele grzyba (MB), strukturze związanej z pamięcią węchową i uczeniem się^4,5. W tym miejscu przedstawiamy techniki rejestracji elektrofizjologicznej w celu monitorowania reakcji neuronalnych wywołanych zapachem w tych obwodach węchowych.

Po pierwsze, prezentujemy metodę pojedynczego rejestrowania sensillum do badania reakcji wywołanych zapachem na poziomie populacji ORNs^6,7. Omawiamy zastosowanie zaostrzonych szklanych pipet wypełnionych solą fizjologiczną jako elektrod do zewnątrzkomórkowego monitorowania odpowiedzi ORN. Następnie przedstawiamy metodę zewnątrzkomórkowego monitorowania odpowiedzi PN przy użyciu komercyjnej 16-kanałowej elektrody³. Podobne podejście przy użyciu wykonanej na zamówienie 8-kanałowej tetrody ze skrętu drutowego zostało zademonstrowane dla nagrań z ogniw Kenyon⁸. Podajemy szczegóły naszej eksperymentalnej konfiguracji i przedstawiamy reprezentatywne ślady nagrań dla każdej z tych technik.

Protocol

1. Przygotowanie i dostarczanie zapachu

1. Rozcieńczyć objętościowo roztwory zapachowe w oleju mineralnym, aby osiągnąć pożądany poziom stężenia. Przechowuj 20 ml mieszaniny oleju mineralnego i środka zapachowego w szklanej butelce o pojemności 60 ml. Włożyć dwie igły strzykawki do gumowego korka (rys. 19), jedną od dołu, a drugą od góry, aby zapewnić przewód wlotowy i wylotowy. Uszczelnij szklaną butelkę tym gumowym korkiem i przymocuj specjalnie zaprojektowany filtr z węglem aktywnym do przewodu dolotowego (Rysunek 1A).
2. Filtr węglowy wykonany jest za pomocą dwóch strzykawek o pojemności 6 ml. Przeciąć strzykawki na pół i wyrzucić ....

Results

Wywołane zapachem reakcje pojedynczego ORN na dwa różne alkohole są pokazane na rysunku 3D. W zależności od miejsca nagrywania (typ czujnika, umiejscowienie elektrody) można uzyskać zapisy wielojednostkowe.

Surowy przebieg zewnątrzkomórkowy z nagrania AL jest pokazany na rysunku 6A. W tym śladzie napięcia można zaobserwować potencjały czynnościowe lub skoki o różnych amplitudach pochodzące z różnych PN. Chociaż płat czułka szarańczy ma pobudzające neurony proj.......

Discussion

Większość bodźców czuciowych wywołuje reakcje kombinatoryczne, które są rozmieszczone w zespołach neuronów. W związku z tym konieczne jest jednoczesne monitorowanie aktywności wielu neuronów, aby zrozumieć, w jaki sposób informacje specyficzne dla bodźca są reprezentowane i przetwarzane przez obwody neuronalne w mózgu. W tym miejscu zademonstrowaliśmy zewnątrzkomórkowe techniki rejestracji wielojednostkowej, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech centrach przetwarzania wzdłuż szlaku węchowego .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprzęt do elektrofizjologii
A.C. wzmacniacz	GRASS	Model P55	do nagrań single sensillum
Monitor audio (model 3300)	A-M Systems	940000
Wykonany na zamówienie 16-kanałowy przedwzmacniacz i wzmacniacz	Cal. Tech. Biologia Elektronika Sklep		z nagraniami AL i MB
Jednostka akwizycji danych	National Instruments	BNC-2090
Światłowód WPI		SI-72-8
Źródło światła 115 V	WPI	NOVA
Ręczny mikromanipulator	WPI	M3301R	do zapisów mózgu szarańczy
Mikroskop stereoskopowy1 na stojaku	Leica	M80	do nagrań mózgu szarańczy
Mikroskop stereoskopowy2	Leica	M205C	do nagrań jednozmysłowych
Stół wibroizolacyjny		TMC	63-500
Mikromanipulator z napędem	silnikowym Sutter Instruments	Oscyloskop MP285/T
	Tektronix	TD2014B
Elektrody/Narzędzia budowlane
16-kanałowa elektroda	NeuroNexus	A2x2-tet-3mm-150-121	do nagrań krzywkowych antenowych
Borokrzemianowe rurki kapilarne z żarnikiem, ID 0,69 mm	Sutter Instruments	BF120-69-10	do wykonywania elektrod szklanych
Ściągacz do mikropipet	Sutter Instruments	P-1000
Generator funkcyjny	Multimetr Magazyn	SG1639A	do pozłacania elektrod
Roztwór do złocenia (bez cyjanku)	SIFCO Industries	NC SPS 5355
Tester impedancji	BAK Electronics Inc.	IMP-2	do elektrod złoconych
Przełącznik obrotowy	Elektroprzełącznik	C7D0123N	do pozłacania elektrod
Izolator impulsów	WPI	A365	do elektrod pozłacanych
Uchwyt elektrody serii Q	Warner	Instruments 64-1091
Srebrny drut o średnicy 0,010"	Elektroda
uziemiająca AM Systems 7825008-pinowe gniazdo DIP IC	Digikey	ED90032-ND
borokrzemianowe rurki kapilarne z żarnikiem, ID 0,58 mm	Warner Instruments	64-0787
Opalarka	Weller	6966C
Rediohm-800 drut	Kanthal Precision Technologies	PF002005
Wytrząsarka płytkowa Thermo	Scientific	4625Q	druty
skręcaneNożyczki z węglików spiekanych, 4,5"	Biomedical Research Instr	25-1000	do cięcia skręconych drutów tetrodowych
Pęseta z cienkim czubkiem	HECO	91-EF5-SA	do rozdzielania
Odor Delivery
6 ml strzykawka	Kendall	1180600777	do specjalnie zaprojektowanego filtra z węglem aktywnym
Brązowe butelki zapachowe	Fisher	08-912-165
Węgiel drzewny	BuyActivatedCharcoal.com	GAC-48C
Suszarka adsorpcyjna		23005
Suszarka do gazów Drierite	Fischer Scientific	09-204
Rurka termokurczliwa	3M	EPS-200	przygotowanie filtra zapachów
Aluminiowa piasta igły podskórnej, manometr 19	Kendall	8881-200136	do dostarczania przewodów wlotowych i wylotowych do butelek zapachowych
Olej mineralny	Mallinckrodt Chemicals	6357-04	do rozcieńczania zapachów
Rurka z tworzywa sztucznego Nalgene, 890 FEP	Thermo Scientific	8050-0310	do dostarczania gazu nośnego
Pneumatyczna pompa pikopump	WPI	sys-pv820	do dostarczania zapachów
Rurka polietylenowa ID 0,86 mm	Intramedic	427421	do przyłączy wylotowych butelek zapachowych i rurki do obfitości soli fizjologicznej
Korki	Lab Pure	97041	do uszczelniania butelek zapachowych
Taśma czasu	PDC	T-534-RP
Rurka luer	Cole-Parmer	30600-66
Rura próżniowa	McMaster-Carr	5488K66
Przygotowanie/Rozwarstwienie
100 x 15 mm szalka Petriego	VWR International	89000-304
18 AWG drut miedziany	Lapp	4510013
22 AWG linka połączeniowa	AlphaWire	1551	platforma
mózgowa Wosk batikowy	Żakard	7946000
Peryferia dentystyczne Wosk	Henry-Schein Dental
Electrowaxer	Almore International	66000
Epoksyd, 5 min	Permatex	84101
Aluminiowa piasta igły podskórnej	Kendall	8881-200136
Proteaza z Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147	do usuwania pochwy mózgu szarańczy
Nić do szwów niesterylna	Fisher	NC9087024	do wiązania brzucha po usunięciu jelit
Vetbond	3M	1469SB	do uszczelniania miejsc amputacji
Kleszcze Dumont #1 (grube)	Kleszcze tytanowe WPI	500335
Dumont #5 (cienkie)	WPI	14096
Kleszcze do #5SF Dumont (bardzo cienkie)		500085	pochwy do mózgu szarańczy
10 cm nożyczki preparacyjne	WPI	14393	do usuwania nóg i skrzydeł
Nożyczki Vannas (cienkie)	WPI	500086	do usuwania naskórka, przecinania jelita
Saline Profusion
Zestaw przedłużający z regulatorem przepływu	Moore Medical	69136	do regulacji przepływu soli
fizjologicznej Zestaw do podawania IV z miejscem wstrzyknięcia Y	Moore Medical	73190	do regulacji przepływu soli fizjologicznej