Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

DOI:

10.3791/50141

⸱

6 marca 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Structural Biology Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 2The University of Melbourne

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofizyczne i biochemiczne badania interakcji między domenami białek osadzonych w błonie napotykają wiele wyzwań technicznych, z których pierwszym jest uzyskanie odpowiedniego materiału do badań. W artykule opisano protokół wytwarzania i oczyszczania stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych, które nadają się do analizy strukturalnej za pomocą roztworu magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i innych zastosowań analitycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fizyczne interakcje między zatopionymi w lipidach domenami alfa-helisowymi białek błonowych odgrywają kluczową rolę w fałdowaniu i składaniu kompleksów białek błonowych oraz w dynamicznych procesach, takich jak sygnalizacja transbłonowa (TM) i regulacja poziomów białek na powierzchni komórki. Zrozumienie cech strukturalnych napędzających asocjację poszczególnych sekwencji wymaga zaawansowanych analiz biofizycznych i biochemicznych kompleksów peptydowych TM. Jednak ekstremalna hydrofobowość domen TM sprawia, że bardzo trudno jest nimi manipulować przy użyciu standardowych technik chemicznych peptydów, a produkcja odpowiedniego materiału do badań często okazuje się zbyt trudna. Zidentyfikowanie warunków, w których peptydy mogą przyjmować stabilne konformacje spiralne i spontanicznie tworzyć kompleksy, zwiększa poziom trudności. W tym miejscu przedstawiamy procedurę wytwarzania homo- lub hetero-dimerycznych kompleksów peptydowych TM z materiałów, które ulegają ekspresji w E. coli, umożliwiając w ten sposób stosunkowo niedrogie włączenie stabilnych znaczników izotopowych do magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) lub aminokwasów nienaturalnych do innych zastosowań. Kluczową innowacją w tej metodzie jest to, że kompleksy TM są wytwarzane i oczyszczane jako kowalencyjnie powiązane (usieciowane dwusiarczkowo-krzyżowe) zespoły, które mogą tworzyć stabilne, stechiometryczne i jednorodne struktury po rozpuszczeniu w detergentach, lipidach lub innych materiałach błono-mimetycznych. Przedstawiamy również starannie zoptymalizowane procedury ekspresji i oczyszczania, które są równie przydatne, niezależnie od tego, czy wytwarza się pojedyncze domeny TM, czy usieciowane kompleksy, a także udzielamy porad dotyczących dostosowania tych metod do nowych sekwencji TM.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę, którą opracowaliśmy do produkcji stabilizowanych dwusiarczkowymi kompleksów peptydów transbłonowych (TM) do badań strukturalnych przy użyciu roztworu NMR. Procedura wykorzystuje solidną ekspresję zapewnianą przez system fuzji ΔtrpLE1413 (patrz poniżej) i umożliwia generowanie kompleksów peptydowych TM o określonym składzie przy użyciu zaawansowanych technik znakowania stabilnymi izotopami dla nowoczesnych wielowymiarowych eksperymentów NMR. Zastosowaliśmy te techniki do określenia kilku struktur NMR, które ujawniły ważne nowe informacje na temat tego, w jaki sposób immunoreceptory aktywujące limfocyty są składane z wielu podjednostek białek błonowych poprzez interakcje między ich domenami TM (ostatnio przeglądane w 1). Techniki te mają zastosowanie do wielu innych błonowych systemów białkowych, a także do szerokiego zakresu dalszych metod analitycznych oprócz NMR roztworu. Podczas gdy podany tutaj przykład wykorzystuje natywne reszty cysteiny do stworzenia kompleksu, który naśladuje naturalnie wiązane białko dwusiarczkowe, projekt równie dobrze nadaje się do tworzenia zmodyfikowanych wiązań dwusiarczkowych w celu stabilizacji kompleksów, które normalnie są utrzymywane razem przez słabsze, niekowalencyjne oddziaływania, takie jak homo- i heterodimeryczne kompleksy TM białek z rodziny receptorów naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR)2-4 lub heterodimeryczne kompleksy integryny αβ5,6.

Ekstremalnie hydrofobowe sekwencje peptydowe, takie jak te pochodzące z dwuwarstwowych części białek TM obejmujących dwie warstwy lipidowe, są niezwykle trudnym tematem do badań biochemicznych i biofizycznych. Oprócz tego, że są bardzo trudne do manipulowania przy użyciu standardowych technik chemicznych białek i peptydów, często są dość toksyczne dla komórek i dlatego trudno je wyprodukować rekombinacyjnie. My7,8 i inni9-11 odnieśliśmy znaczący sukces w ekspresji tak trudnych sekwencji peptydowych u bakterii, jak fuzje karboksylowo-końcowe w ramce ze zmodyfikowaną wersją sekwencji ΔtrpLE1413 pochodzącej z operonu 12 E. coli trp. Polipeptyd trpLE o masie ~13 kDa kodowany przez tę sekwencję może być wytwarzany na wysokich poziomach pod promotorem T7 i jest całkowicie zlokalizowany w ciałach inkluzyjnych, w których unika się problemów związanych z toksycznością i / lub niestabilnością. Modyfikacja sekwencji poprzez dodanie aminokońcowego znacznika 9-histydyny13 i eliminacja wewnętrznych reszt metioniny i cysteiny z sekwencji14 trpLE pozwoliła na oczyszczenie fuzji trpLE-peptyd za pomocą chromatografii powinowactwa metal-jon i trawienie przy użyciu bromku cyjanu (CNBr) w celu uwolnienia pożądanej sekwencji peptydowej. Z powodzeniem wykorzystaliśmy ten system do ekspresji kilkunastu różnych sekwencji jako fuzji trpLE reprezentujących fragmenty białek błonowych, które zawierają aż cztery domeny TM (7,8 i niepublikowane wyniki; patrz również sekcja DYSKUSJA).

Kluczową innowacją w tym protokole jest identyfikacja warunków, w których nieustrukturyzowane i bardzo słabo rozpuszczalne fuzje trpLE-TM mogą być efektywnie sieciowane dwusiarczkowo w kontekście usprawnionego przepływu pracy. Kilka aspektów wysokowydajnej ekspresji, obsługi i oczyszczania produktów peptydowych zostało również dokładnie zoptymalizowanych, a przedstawione tutaj zalecenia są równie istotne dla produkcji produktów peptydowych TM bez usieciowania dwusiarczkowego (monomerycznego).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Klonowanie i projektowanie konstrukcji

Sklonuj interesujące sekwencje do wektora peptydowego pMM (który może być dostarczony na żądanie) przy użyciu miejsc restrykcyjnych HindIII i BamHI (patrz Rysunek 1). Dwuniciowa wstawka DNA powinna zawierać, w następującej kolejności: miejsce HindIII; pojedynczy kodon metioniny do rozszczepienia CNBr; sekwencja kodująca peptydy zoptymalizowana pod kątem kodonu E. coli; kodon stop; strona BamHI. Wszystkie inne metioniny w peptydzie należy wyeliminować i należy unikać sekwencji dipeptydowej ASP-PRO, ponieważ będzie ona również rozszczepiana w warunkach kwaśnych.

Do każdej sekwencji peptydowej powinna zostać wprowadzona unikalna reszta cysteiny, zgodnie z pożądanym umiejscowieniem wiązania dwusiarczkowego w końcowym kompleksie, a wszystkie inne cysteiny powinny zostać zmutowane do seryny. Plazmid zawiera kasetę oporności na kanamycynę do selekcji.

2. Ekspresja fuzji trpLE-peptide

  1. Filtr uzupełniający i sterylny M9/Kan minimalny wzrost pożywki (0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4, 3 g/L KH2PO4, 7,5 g/L Na2HPO4·2H2O, 0,5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 4 g/L glukozy, 50 mg/L siarczan kanamycyny). Suplement z Centrum Complete A to Zinc w celu dostarczenia witamin z grupy B i metali śladowych: rozpuścić 1 tabletkę w 40 ml H2O mieszając przez 30 min, odwirować w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału i sterylnie przefiltrować pomarańczowy supernatant. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 2 tygodni i użyć 4 ml/l w M9.
    UWAGA: W razie potrzeby do pożywki M9 można dodać 15N-wzbogaconych NH4Cl, 13C wzbogaconych glukozą lub inne prekursory znakowane stabilnymi izotopami na tym etapie.
  2. Zaszczepić 100 ml kultury starterowej ze świeżo przekształconego szczepu BL21(DE3) E. coli w pożywce M9/Kan. Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
  3. Następnego ranka sprawdź OD600 kultury starterowej - powinna ona mieścić się w zakresie 2 lub większym. Rozcieńczyć 100 ml kultury starterowej na 1 l całkowitej objętości pożywki M9 uzupełnionej Centrum. Podzielić na dwie kolby o pojemności 2 l z przegrodami (po 500 ml kultury w każdej kolbie) i rosnąć w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 140 obr./min, aż OD600 osiągnie 0,6.
  4. Ustaw temperaturę wytrząsarki na 18 °C i kontynuuj wytrząsanie przez 1 godzinę, pozwalając kulturom całkowicie ostygnąć przed indukcją.
  5. Pobrać próbkę przed indukcją do analizy SDS-PAGE (odpowiednik 50 μl z hodowli w OD600 = 1), a następnie dodać IPTG do końcowego stężenia 0,1 mM, aby wywołać ekspresję fuzji trpLE-peptyd. Kontynuuj wzrost w temperaturze 18 °C/140 obr./min przez noc (16-20 godzin) pod indukcją IPTG.

3. Przygotowanie ciała inkluzyjnego i wiązanie matrycy niklowej

  1. Końcowa wartośćOD 600 kultur ekspresyjnych z dnia na dzień w minimalnej pożywce jest zmienna i powinna wynosić od 2,5 do 5,0. Pobrać próbkę do analizy SDS-PAGE (odpowiednik 50 μl z hodowli o średnicyzewnętrznej 600 = 1) i zbierać komórki przez odwirowywanie przez 20 minut przy 5 000 x g.
  2. Zawiesić osad komórkowy z 1 l kultury w 50 ml buforze do lizy (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Zawiesiny komórkowe mogą być przechowywane w stanie zamrożonym do późniejszego przetworzenia.
  3. Lizować komórki przez sonikację na lodzie z maksymalną wydajnością przez 1 minutę i odpoczywać na lodzie przez 5 minut. Używamy Misonix Sonicator 3000 (maksymalna moc wyjściowa 600 watów) z wymienną końcówką 1/2 cala o wysokiej intensywności. Powtórz sonikację/chłodzenie przez trzy cykle.
  4. Zebrać materiał z nierozpuszczalnymi ciałami inkluzyjnymi (IB) przez wirowanie przez 15 minut przy 20 000 x g i wyrzucić supernatant. Luźna, cienka warstwa jaśniejszych szczątków komórek może być widoczna na wierzchu gęstej pastylki IB; Można go zmyć wodą lub buforem z delikatnym mieszaniem. Kroki 3.3 i 3.4 można powtórzyć w celu poprawy czystości frakcji IB, jeśli jest to pożądane. Próbki osadu i materiału sklarowanego nad osadem należy pobrać do analizy SDS-PAGE w celu potwierdzenia lokalizacji fuzji trpLE-TM do ciał inkluzyjnych.
  5. Rozpuść granulki IB w roztworze guanidyny (6 M chlorowodorku guanidyny, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), używając 25-50 ml na litr przetworzonej kultury. Ten krok będzie wymagał kilku godzin z mieszaniem i okazjonalnie łagodną sonikacją.
  6. Oczyścić lizat IB przez odwirowywanie przez 1 godzinę w temperaturze 75 000-100 000 x g i temperaturze 20 °C. Zdekantować supernatant i przefiltrować przez membranę 0,2 μm.
  7. Połączyć oczyszczony lizat IB w stożkowej probówce o pojemności 50 ml lub w większym naczyniu, które można bezpiecznie zamknąć, z żywicą o powinowactwie do niklu, którą przemyto wodą i zrównoważono z roztworem guanidyny. Użyj 3-4 ml osiadłej żywicy na litr przetworzonej kultury, aby uzyskać fuzje, które wyrażają się w podobnym stopniu, jak trpLE-DAP12TM pokazany tutaj (Rysunek 3, tor 2). Wiązanie wsadowe przez inkubację przez noc w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.

4. Sieciowanie oksydacyjne na kolumnie

  1. Załaduj zawiesinę lizatu / żywicy niklowej IB do pustej kolumny przepływowej grawitacyjnej z porowatym podparciem złoża, dodając w sposób ciągły, aż przepłynie przez nią cała objętość. Zebrać i odłożyć na bok przepływ, który może nadal zawierać niezwiązane białko fuzyjne.
  2. Przepłukać żywicę niklową przepływem grawitacyjnym 5 objętościami roztworu mocznika (8 M mocznika, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl) zawierającego 5 mM β-ME.
  3. Ponownie przemyć żywicę niklową 5 objętościami roztworu mocznika bez β-ME.
  4. Umyć żywicę niklową po raz trzeci 5 objętościami złoża roztworu mocznika, który został uzupełniony o 20 μM CuSO4 i 2 mM utlenionego glutationu. Po tym przemyciu zamknąć wylot kolumny i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić maksymalne utworzenie wiązania dwusiarczkowego.

5. Elucja i kwantyfikacja TFA

UWAGA: Kwas trifluorooctowy (TFA) powoduje poważne oparzenia przy kontakcie ze skórą, a opary są bardzo drażniące. Skoncentrowany TFA powinien być stosowany wyłącznie w zatwierdzonym dygestorium chemicznym z ochroną oczu i rękawicami nielateksowymi. Sprawdź kompatybilność chemiczną wszystkich użytych materiałów; Polipropylen jest kompatybilny ze wszystkimi etapami tego protokołu.

  1. Przepłukać utleniający roztwór mocznika 10 objętościami wody w złożu i wysuszyć łoże kolumny, przykładając przewód próżniowy do wylotu kolumny.
  2. Zamknij wylot kolumny i dodaj 1,5 objętości złoża czystego (99-100%) TFA. Wymieszaj żywicę niklową małą szpatułką, aby zapewnić równomierne wystawienie na działanie kwasu i inkubuj przez 5 minut. Otwórz wylot kolumny i zbierz eluat kwasu, delikatnie zwiększając ciśnienie za pomocą strzykawki lub przewodu sprężonego powietrza, jeśli to konieczne, aby wypchnąć całą ciecz.
  3. Powtórz etap elucji kwasowej z kolejnymi 1,5 objętości złoża czystego TFA. Na tym etapie pracuj szybko, aby uniknąć całkowitego rozpuszczenia perełkowej matrycy agarozowej. Wydajność białka można w tym momencie określić zgodnie z równaniem Beera-Lamberta i teoretycznym współczynnikiem ekstynkcji molowej sekwencji trpLE-peptyd. Rozcieńczyć próbkę eluatu TFA (1:20 do 1:50) w trifluoroetanolu (TFE) i zmierzyć absorbancję przy 280 nm, stosując TFA/TFE w tym samym rozcieńczeniu co ślepa próba.

6. Trawienie CNBr

UWAGA: Bromek cyjanu (CNBr) jest bardzo toksyczny i powinien być używany tylko w zatwierdzonym dygestoriach chemicznych. Bezwzględnie wymagane są środki ochrony osobistej, w tym okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i rękawice nielateksowe. CNBr reaguje na wilgoć i przed otwarciem należy go doprowadzić do temperatury pokojowej. Skontaktuj się z instytucjonalnym biurem ds. bezpieczeństwa, aby uzyskać instrukcje dotyczące neutralizacji/utylizacji roztworów i materiałów zanieczyszczonych CNBr.

  1. Rozcieńczyć eluat kwasu do 80% końcowego stężenia TFA, dodając kroplami wodę, delikatnie mieszając. Jeśli utworzy się osad, dodaj z powrotem niewielką objętość (0,5 do 1 ml) czystego TFA, aż roztwór się klaruje, a następnie ponownie skoryguj do 80% wodą. Pobrać 5 μl próbki do wstępnego trawienia do analizy SDS-PAGE, zamrażając w ciekłym azocie i natychmiast liofilizując próbkę.
  2. Dodaj kryształy CNBr do około 0,2 g/ml, uważając, aby bezpiecznie zważyć toksyczną substancję chemiczną w zamkniętych, wstępnie zważonych probówkach lub używając wagi wewnątrz okapu oparów chemicznych. Delikatnie mieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia. Przepłukać i uszczelnić naczynie reakcyjne w gazie obojętnym (strumień azotu lub argonu) i inkubować przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  3. Pobrać 5 μl próbki po strawieniu do analizy SDS-PAGE, a następnie natychmiast zamrozić i poddać liofilizacji. Przenieść reakcję trawienia do kasety lub rurki do dializy z regenerowanej celulozy (octan celulozy rozpuści się w stężonym kwasie) o masie cząsteczkowej odcięcia 3,5 kDa lub mniejszej, w zależności od wielkości oczekiwanego kompleksu peptydowego. Dializować przez noc do 4 l wody w dygestoriach chemicznych w celu zmniejszenia stężenia TFA i rozkładu nieprzereagowanego CNBr. Pozostawić miejsce w kasecie lub rurce do dializy na znaczne zwiększenie objętości (nawet dwu- lub trzykrotnie) podczas dializy w nocy.
  4. Usunąć dializowany roztwór reakcyjny z zawieszonym osadem z kasety dializacyjnej lub rurki do dializy (większość białka wytrąca się po zmniejszeniu stężenia TFA) i przenieść zawiesinę do probówek stożkowych o pojemności 50 ml. Zamrażać i liofilizować w celu usunięcia wody i śladów CNBr/TFA. Ten krok prawdopodobnie zajmie kilka dni.
    ostrożność: Zarówno dializowana reakcja trawienia, jak i woda dializowana powinny być nadal traktowane jako toksyczne i traktowane/usuwane z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności.
  5. Próbki kultur z etapów pre-indukcji i zbioru, supernatant i osad inkluzyjny, eluat TFA i materiał trawiony CNBr mogą być analizowane za pomocą SDS-PAGE. Przygotować próbki przez podgrzanie do temperatury 95 °C w buforze do próbek Invitrogen NuPAGE LDS. Próbki eluatu i trawienia tłuszczów trans powinny być przygotowywane zarówno w warunkach redukujących, jak i nieredukujących, aby ułatwić identyfikację produktu i ocenę sieciowania oksydacyjnego.
  6. Oddziel próbki na 12% prefabrykowanym żelu akrylowym NuPAGE bis-tris za pomocą buforu roboczego MES-SDS w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości najmniejszych produktów trawiennych.

7. Oczyszczanie HPLC z odwróconymi fazami usieciowanych dwusiarczkowo-usieciowanych kompleksów peptydowych

  1. Rozpuść do 100 mg liofilizowanych produktów trawiennych w 2-3 ml czystego kwasu mrówkowego i załaduj na wagę preparatywną (21,2 x 150 mm) kolumnę Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT w rozpuszczalniku A (zwykle 10-20% acetonitrylu lub 5-10% izopropanolu w wodzie z 0,1% TFA).
  2. Eluować produkty trawienia w gradiencie rozpuszczalnika B (acetonitryl lub izopropanol z 0,1% TFA) przez co najmniej 5 objętości kolumn. Zobacz DYSKUSJĘ, aby uzyskać sugestie dotyczące wyboru optymalnych warunków gradientu dla różnych sekwencji peptydowych.
  3. Pobrać 50-100 μl próbek z każdej frakcji HPLC do analizy SDS-PAGE i natychmiast zamrozić i poddać liofilizacji. Usuwanie rozpuszczalników HPLC jest szybkie i powinno zakończyć się w ciągu 1-2 godzin.
  4. Przygotować liofilizowane próbki HPLC do SDS-PAGE przez podgrzanie do 95 °C w buforze do próbek Invitrogen NuPAGE LDS bez środka redukującego. Schłodzić i podzielić każdą próbkę równomiernie na 2 probówki mikrowirówkowe, dodając 100 mM DTT do jednej z nich i krótko podgrzewając.
  5. Oddzielić zredukowane i niezredukowane próbki HPLC na 12% prefabrykowanym żelu akrylowym NuPAGE bis-tris z buforem roboczym MES-SDS, jak powyżej. Małe, hydrofobowe peptydy często nie wchłaniają dobrze barwnika Coomassie i mogą nie działać przy oczekiwanej masie cząsteczkowej. Jednakże porównanie próbek zredukowanych i niezredukowanych powinno ułatwić identyfikację produktów peptydów usieciowanych i ocenę czystości.
  6. Przeanalizuj kandydujące frakcje zawierające peptydy za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą desorpcją laserową i jonizacją czasu przelotu (MALDI-TOF) (patrz DYSKUSJA) w celu zidentyfikowania interesujących gatunków i potwierdzenia ich oczekiwanej masy.
  7. Połączyć, zamrozić i liofilizować frakcje HPLC zawierające czysty, usieciowany kompleks peptydowy TM i pobrać suchą masę produktu końcowego w celu określenia wydajności. Frakcje o wysokiej zawartości izopropanolu nie mogą pozostać zamrożone. Jeśli frakcje peptydowe wyschną do filmu, a nie do puszystego liofilizowanego produktu, należy ponownie całkowicie rozpuścić film w małej objętości czystego heksafluoroizopropanolu (HFIP), zamrozić i ponownie liofilizować. Produkt poddany działaniu HFIP powinien być małym, białym stożkiem, który można łatwo wychylić i zważyć.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poziom ekspresji osiągnięty dla fuzji trpLE jest zmienny i silnie zależny od sekwencji aminokwasów dołączonego peptydu. Rysunek 3 przedstawia analizę SDS-PAGE próbek przed indukcją (tor 1) i czasu zbioru (linia 2) z hodowli, w której uzyskano około 120 mg czystej, nienaruszonej fuzji trpLE-DAP12TM z 1 litra kultury i 4 ml matrycy niklowej. Cała fuzja trpLE-DAP12TM była zlokalizowana w osadzie ciała inkluzyjnego (tor 4), w przeciwieństwie do supernatantu (tor 3).

Około 70% fuz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja fuzji trpLE-TM. Z naszego doświadczenia wynika, że fuzje trpLE-TM są słabo eksprymowane w bogatej pożywce hodowlanej w temperaturze 37 °C, a opisane tutaj warunki hodowli okazały się skuteczne dla wielu różnych sekwencji zawierających od jednej do czterech domen TM z wydajnością w zakresie od 50 do 150 mg/L czystej, nienaruszonej fuzji. Fuzje kodujące trzy- lub czteroczęściowe fragmenty GPCR TM (odpowiednio ludzkie CCR5 TM1-TM3 i TM4-TM7) lub rdzeń katalityczny fragmentu ludzkiej peptydazy sygnałowej p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie tej pracy jest zapewnione przez Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych Australii (projekt NHMRC grant 1011352 dla M.E.C i M.J.C.; Grant Independent Research Institutes Infrastructure Support Scheme [IRIISS] dla WEHI) oraz rząd stanu Wiktoria (stypendium VESKI Innovation Fellowship dla M.E.C.; Wsparcie dla WEHI przez rząd stanu Wiktoria). M.E.C. jest członkiem Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych im. Królowej Elżbiety II. E.F.X.B dziękuje za wsparcie ze strony Programu Stypendialnego im. Normy Hildy Schuster na Uniwersytecie w Melbourne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bromek cyjanuALDRICHP.No-C91492, CAS-506-68-3< SILNA>SUBSTANCJA NIEBEZPIECZNA. TOWARY NIEBEZPIECZNE. Bardzo toksyczny przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Kontakt z kwasami uwalnia bardzo toksyczne gazy. Bardzo toksyczny dla organizmów wodnych, może powodować długotrwałe niekorzystne skutki w środowisku wodnym.
Kwas trifluorooctowySIGMA-ALDRICHP.CODE-1000984387, numer CAS 76-05-1SUBSTANCJA NIEBEZPIECZNA. TOWARY NIEBEZPIECZNE., Powoduje poważne oparzenia. Działa szkodliwie przez drogi oddechowe. Działa szkodliwie na organizmy wodne, może powodować długotrwałe niekorzystne skutki w środowisku wodnym.
2-Mercapt– tanolSIGMA-ALDRICHP.No M7154, numer CAS 60-24-2< SUBSTANCJA NIEBEZPIECZNA>NIEBEZPIECZNA. TOWARY NIEBEZPIECZNE< MOCNE>. Działa toksycznie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Działa drażniąco na skórę. Ryzyko poważnego uszkodzenia oczu. Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. Bardzo toksyczny dla organizmów wodnych, może powodować długotrwałe niekorzystne skutki w środowisku wodnym.
1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolSIGMA-ALDRICHNumer produktu 52512, nr CAS 920-66-1SUBSTANCJA NIEBEZPIECZNA. TOWARY NIEBEZPIECZNE< MOCNE>. Działa szkodliwie przez drogi oddechowe i po połknięciu. Powoduje oparzenia.
Kwas mrówkowyMerck KGaAK41186564łatwopalna ciecz i pary. Powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu.
MocznikUNIVAR, AJAX FINECHEMNumer produktu, 817, nr CAS 57-13-6Po podgrzaniu rozkłada się na dwutlenek węgla i amoniak; po spaleniu wydziela niewielkie ilości tlenków azotu. Może powodować zaczerwienienie i podrażnienie skóry i oczu.
CHLOROWODOREK GUANIDYNYAmrescoP.No-M110, Numer CAS: 50-01-1Działa szkodliwie po połknięciu, Powoduje poważne podrażnienie oczu, Działa drażniąco na skórę, Toksyczność ostra doustnie, Działa drażniąco na skórę, Działa drażniąco na oczy.
TRITON X-100SIGMANumer produktu- T8532 Nr CAS: 9002-93-1Triton X-100 to niejonowy detergent, w 100% składnik aktywny, który jest często stosowany w zastosowaniach biochemicznych do rozpuszczania białek. Triton X-100 nie ma właściwości przeciwdrobnoustrojowych i jest uważany za stosunkowo łagodny, niedenaturujący
detergent His-Select Żel powinowactwa do nikluSIGMA-ALDRICHNum- P6611IS-Select Nickel Affinity Gel to produkt do chromatografii powinowactwa do jonów metali (IMAC). Żel HIS-Select Nickel Affinity to opatentowany chelat czworonożny na agarozie z perełkami naładowany niklem, który jest przeznaczony do specyficznego wiązania białek zawierających histydynę.
(-)-Glutation, utlenionySIGMA-ALDRICHNumer katalogowy 150568
Dźwiękowiec Misonix S-3000QSONICAS-3000 (wycofany)Maksymalna moc wyjściowa 600 watów. Sonda z wymienną końcówką 1/2 cala przyjmuje końcówki 1/2 cala o wysokiej intensywności i dużej objętości oraz szereg końcówek o wysokiej intensywności i małej objętości. Najbliższe modele dostępne obecnie w ofercie tej firmy to Q500 i Q700.
RP-HPLC: System chromatografii DuoFlow firmy BioLogic, wersja oprogramowania 5.3Bio-Rad Laboratories760-0047, nr konfiguracji: AU500571, numer seryjny: 484BR3705Peptydy wiążą się z kolumnami HPLC z odwróconą fazą w wysokiej wodnej fazie ruchomej i są eluowane z kolumn RP HPLC z wysoką organiczną fazą ruchomą. W RP HPLC peptydy są rozdzielane na podstawie ich hydrofobowego charakteru. Peptydy można rozdzielić, prowadząc liniowy gradient rozpuszczalnika organicznego.
Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analityczna kolumna HPLC, 21,2 x 150 mm, 5 μ m wielkość cząstekAgilentNr produktu: 895150-909Kolumna HPLC z odwróconymi fazami
NuPAGE 12% Bis-Tris GelsLife TechnologiesNP0341BOXWstępnie obsadzone żele do elektroforezy białek
Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer G2, 3,5KMWCO Thermo ScientificNr produktu: 87724Dializa próbki
Numer katalogu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
  2. Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
  3. Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
  4. Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
  5. Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
  6. Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
  7. Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
  8. Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
  9. Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
  10. Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
  11. Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
  12. Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
  13. North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
  14. Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
  15. Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
  16. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
  17. Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
  18. Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
  19. Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sieciowanie dwusiarczkoweekspresja w E colioczyszczanie powinowactwem do nikluci cie cyjanobromkiemHPLC w odwr conej fazieanaliza SDS PAGEspektrometria masrekonstytucja z detergentem

Powiązane artykuły