Ciągła obserwacja mikroskopowa w wysokiej rozdzielczości starzenia replikacyjnego u pączkujących drożdży

Summary

Opisujemy tutaj działanie urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia ciągłe i wysokorozdzielcze obrazowanie mikroskopowe pojedynczych pączkujących komórek drożdży podczas ich pełnego okresu replikacji i/lub chronologicznego życia.

Abstract

Pokazujemy użycie prostego układu mikroprzepływowego, w którym pojedyncze kiełkujące komórki drożdży mogą być śledzone przez cały okres ich życia. Chip mikroprzepływowy wykorzystuje różnicę wielkości między komórkami macierzystymi i potomnymi za pomocą szeregu mikropadów. Po załadowaniu komórki są uwięzione pod tymi mikropadami, ponieważ odległość między mikropodkładką a szkłem nakrywkowym jest podobna do średnicy komórki drożdży (3-4 μm). Po procedurze ładowania, pożywka hodowlana jest w sposób ciągły przepłukiwana przez chip, co nie tylko tworzy stałe i zdefiniowane środowisko przez cały eksperyment, ale także wypłukuje pojawiające się komórki potomne, które nie są zatrzymywane pod elektrodami ze względu na ich mniejszy rozmiar. Układ utrzymuje komórki macierzyste tak skutecznie, że w jednym eksperymencie można monitorować do 50 pojedynczych komórek w sposób w pełni zautomatyzowany przez 5 dni lub, jeśli to konieczne, dłużej. Ponadto doskonałe właściwości optyczne chipa pozwalają na obrazowanie komórek w wysokiej rozdzielczości podczas całego procesu starzenia.

Introduction

Pączkujące drożdże są ważnym organizmem modelowym do badań nad starzeniem^{się 1}. Do niedawna badanie starzenia replikacyjnego w komórkach drożdży było pracochłonnym procesem wymagającym metody preparacji, w której każdy pączek był ręcznie usuwany z komórki macierzystej^2,3. Aby rozwiązać ten problem, niedawno zaprezentowaliśmy nowatorską konfigurację mikroprzepływową, która jest w stanie śledzić poszczególne komórki macierzyste przez cały okres ich życia⁴.

W naszym chipie mikroprzepływowym, komórki drożdży są uwięzione pod miękkimi mikropadami na bazie elastomeru (patrz Rysunek 1). Ciągły prze....

Protocol

1. Produkcja i przygotowanie formy do wafli krzemowych

Mikroprzepływowe układy scalone są tworzone z formy wafla krzemowego wyprodukowanej metodą miękkiej litografii. Wafle te mogą być wielokrotnie wykorzystywane do produkcji chipów mikroprzepływowych. Wskazane jest, aby produkcja odpowiedniej płytki była wykonywana przez grupę specjalizującą się w mikrofluidyce⁶.

Wafel jest wykonany w dwuetapowym procesie fotolitografii przy użyciu dwóch różnych warstw negatywnego fotorezystu, SU-8⁷. Dolna warstwa służy do generowania obszaru pułapki komórek (SU-8 2002; wysokość 3-4 μm), natomiast kanały są w....

Results

W tym protokole, komórki są ładowane do mikroprzepływowego chipa bezpośrednio z hodowli średniej wykładniczej. Aby upewnić się, czy rozkład wieku komórek uwięzionych w chipie mikroprzepływowym jest podobny do rozkładu hodowli przed załadowaniem, komórki wybarwiono aglutyniną pszenną sprzężoną z FITC (WGA-FITC) w celu uwidocznienia blizn po pąkach. Jak widać na rysunku 3, uwięzienie komórek pod mikropadami chipa mikroprzepływowego nie jest stronnicze w stosunku do komórek w pewnym wieku.

Discussion

Opisana tutaj metoda mikroprzepływowa jest ważnym, nowatorskim narzędziem w badaniach nad starzeniem się, ponieważ umożliwia proste i zautomatyzowane generowanie danych dotyczących żywotności replikacji drożdży w połączeniu z ciągłym obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości. Atrybuty te stanowią znaczne ulepszenie w stosunku do możliwości eksperymentalnych klasycznej metody preparacji, jednak istnieje kilka ograniczeń tej metody, które należy wziąć pod uwagę.

Należy zauważyć, że na wyznaczoną dł.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ODCZYNNIKI
DC Sylgard 184 elastomer	Mavom bv	1060040	Ten pakiet zawiera bazę PDMS i utwardzacz PDMS.
Szklane szalki Petriego 120/20 mm	VWR International	391-2850
Szkła nakrywkowe 22x40 mm	CBN Labsuppliers BV	190002240
Tough-Tags	Sigma-Aldrich	Z359106
Folia aluminiowa
Plastikowy kubek
Pipeta serologiczna 5 ml	VWR International	612-1245
Taśma klejąca	VWR International	819-1460
Pasta Baysilone (silikony GE Bayer)	Sigma-Aldrich	85403-1EA
Rurka z mikrootworem PTFE, 0,012"ID x 0,030"OD	Cole Parmer	EW-06417-11	Określana jako cienka rurka
Tygon Microbore, 0,030"ID x 0,090"OD	Cole Parmer	EW-06418-03	Określany jako grube rurki
Skalpel	VWR International	233-5334
Strzykawki Luer-Lok 50 ml	Strzykawki BD	300137
5 ml, końcówka Luer	VWR International	613-1599
Pęseta	VWR International	232-2132
Końcówki Luer o rozmiarze 20	Instech Solomon	LS20
Filtry strzykawkowe (wielkość porów 0,20 μ m)	Sigma-Aldrich	16534K
Zatyczka cewnika ze stali nierdzewnej, 20 ga x12 mm	Instech Solomon	SP20/12
Szalki Petriego	VWR International	391-0892
Stacjonarny środek do czyszczenia ozonu UV	NOVA Scan	PSD-UVT
Pompa Harvard 11 Elitarny	aparat Harvard	70-4505
SU-8 silikonowa forma wzorcowa (wafel)			Własnej roboty; W celu uzyskania szczegółowych informacji skontaktuj się z autorem korespondencyjnym
Balance	Sartorius corporation	ED4202S
Pompa próżniowa	KNF Neuberger	N022 AN.18
Eksykator	VWR International	467-2115
Płyta grzejna	VWR International	460-3267
Opcjonalnie: Metalowy uchwyt na szkło nakrywkowe (22x40 mm)			Wykonane samodzielnie; W celu uzyskania szczegółowych informacji skontaktuj się z autorem korespondencyjnym
(fluorescencja) Mikroskop z obiektywem 60x, autofokusem, możliwością nagrywania poklatkowego i najlepiej zautomatyzowanym (zmotoryzowanym sterowaniem XY) stolikiem	Nikon	Eclipse Ti-E