Izolacja i zapisy kanału Kv w kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych myszy

Podsumowanie

Dysfunkcja kanału Kv jest związana z zaburzeniami rytmu serca. W celu zbadania mechanizmów molekularnych, które prowadzą do takich arytmii, stosujemy systematyczny protokół izolacji kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych od myszy z nokautem podjednostki pomocniczej kanału Kv. Wyizolowane kardiomiocyty można następnie natychmiast wykorzystać do komórkowych badań elektrofizjologicznych, testów biochemicznych lub immunofluorescencyjnych (IF).

Streszczenie

Geny KCNE kodują małą rodzinę podjednostek pomocniczych kanału Kv, które tworzą heteromeryczne kompleksy z podjednostkami kanału alfa kanału Kv, aby modyfikować ich właściwości funkcjonalne. Mutacje w genach KCNE stwierdzono u pacjentów z zaburzeniami rytmu serca, takimi jak zespół wydłużonego odstępu QT i (lub) migotanie przedsionków. Jednak dokładna patofizjologia molekularna, która prowadzi do tych chorób, pozostaje nieuchwytna. W poprzednich badaniach właściwości elektrofizjologiczne choroby powodującej mutacje w tych genach były badane głównie w heterologicznych systemach ekspresji i nie możemy być pewni, czy zgłoszone efekty można bezpośrednio przełożyć na natywne kardiomiocyty. Dlatego w naszym laboratorium stosujemy inne podejście. Bezpośrednio badamy efekty delecji genu KCNE w izolowanych kardiomiocytach od myszy z nokautem za pomocą elektrofizjologii komórkowej - unikalnej techniki, którą opisujemy w tym wydaniu Journal of Visualized Experiments. Serca genetycznie modyfikowanych myszy KCNE są szybko wycinane i montowane w aparacie Langendorffa za pomocą kaniulacji aorty. Wolny Ca^{2 +} w mięśniu sercowym jest wiązany przez EGTA, a dysocjacja miocytów serca jest następnie osiągana przez wsteczną perfuzję tętnic wieńcowych z wyspecjalizowanym buforem o niskiej zawartości Ca^{2 +} zawierającym kolagenazę. Przedsionki, wolna ściana prawej komory i lewa komora mogą być następnie oddzielone za pomocą technik mikrochirurgicznych. Wapń jest następnie powoli dodawany z powrotem do izolowanych kardiomiocytów w wielu etapach obejmujących procedurę mycia. Kardiomiocyty przedsionkowe i komorowe o zdrowym wyglądzie bez spontanicznych skurczów są następnie natychmiast poddawane analizom elektrofizjologicznym techniką patch clamp lub innym analizom biochemicznym w ciągu pierwszych 6 godzin po izolacji.

Protokół

1. Znieczulenie zwierząt i grabież organów

1. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie ketaminy (200 mg/kg m.c.) i ksylazyny (20 mg/kg m.c.).
2. Aby przeciwzakrzepowo wstrzyknąć 250 j.m. heparyny i.p., aby uniknąć krzepnięcia krwi i tworzenia się skrzepliny.
3. Poczekaj, aż zostanie osiągnięta głęboka narkoza, która charakteryzuje się arefleksją. Aby sprawdzić, czy nie ma arefleksji, przetestuj odruch rogówkowy, delikatnie dotykając rogówki lub przetestuj odruch lotu, szczypiąc ogon.
4. Przenieś mysz na stół operacyjny i zamocuj ją w pozycji leżącej.
5. Naciąć skórę i ścianę brzucha poniżej mieczykowatej i wykonać torakotomię z klapką: Rozciągnij cięcie na obie strony wzdłuż łuku żebrowego, a następnie przeciąć żebra w przyśrodkowej linii pachowej, odchyl klatkę piersiową do góry.
6. Otwórz osierdzie, zlokalizuj wielkie naczynia. Delikatnie naciśnij ogon serca, aby lepiej wyświetlić aortę. Zacisnąć aortę za pomocą kleszczy.
7. Umieść serce we wklęsłości nożyczek i wypreparuj wszystkie łączące się naczynia jednym cięciem. Upewnij się, że zachowałeś wystarczająco dużą część aorty wstępującej do kaniulacji Langendorffa.
8. Natychmiast przenieść wycięte serce na szalkę Petriego wypełnioną lodowatym i wstępnie natlenionym roztworem 1 (dla roztworów, patrz Tabela 1).

2. Przygotowanie serca i perfuzji Langendorffa

1. Kanniuluj aortę za pomocą kaniuli stalowej 1,8F. Upewnij się, że unikasz zatoru powietrznego.
2. Unieruchomić aortę na kaniuli za pomocą szwu chirurgicznego i przepłukać naczynia wieńcowe 1 ml roztworu 1.
3. Połącz kaniulę z aparatem Langendorffa.
4. Upewnij się, że czas od torakotomii do kaniulacji Langendorffa nie przekracza 120 sekund, aby uniknąć przedłużonego niedokrwienia/uszkodzenia reperfuzyjnego mięśnia sercowego.
5. Wypełnić serce za pomocą 10 ml roztworu wolnego od^Ca2+ 2 (4 ml/min).
6. Perfekować serce roztworem kolagenazy 3 przez 8 min (4 ml/min).

3. Mikrochirurgiczne dysocjacje komór serca

1. Przenieść serce do wstępnie podgrzanej 100-milimetrowej szalki Petriego zawierającej roztwór o niskiej zawartości^Ca2+ 4.
2. Ostrożnie usuń nożyczkami tkankę aorty i inną tkankę niesercową i wyrzuć ją.
3. Oddziel przedsionki i komory i kontynuuj z każdą komorą osobno. Utrzymuj komórki zanurzone w roztworze 4. Używaj małych objętości (mniej niż 5 ml).

4. Dalsza dysocjacja kardiomiocytów

1. Kardiomiocyty przedsionkowe:
   1. Aby zindywidualizować kardiomiocyty przedsionkowe, przenieś przedsionki do oddzielnego, wstępnie ogrzanego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm i rozdziel tkankę poprzez delikatne rozsunięcie jej cienkimi kleszkami. Zapewnić prawie całkowitą dysocjację tkanki.
   2. Użyj pipety o pojemności 1 ml z powiększoną, polerowaną ogniowo plastikową końcówką do pipety, aby zawiesić komórki w 1 ml roztworu 5 na 5 minut.
   3. Oddziel komórki od zanieczyszczeń za pomocą filtra komórkowego (rozmiar oczek 200 μm).
   4. Dodać 5 ml roztworu 5 do zawiesiny komórek i wirować przez 2 minuty przy 16 x g w temperaturze pokojowej.
   5. Poniższe kroki są wykonywane pod kapturem do hodowli komórkowej. Odrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić osad w 5 ml roztworu 6.
   6. Po sedymentacji grawitacyjnej przez 10 minut w probówce o pojemności 15 ml, wirować przez 1 minutę przy 16 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w zależności od ich ilości w 1-5 ml roztworu 6.
2. Kardiomiocyty komorowe:
   1. Wyciąć interesujący obszar lewej komory za pomocą drobnych kleszczy w 5 ml roztworu 4.
   2. Zawiesić komórki, delikatnie pipetując, aż większość komórek zostanie oddzielona. Przenieść roztwór komórkowy po przefiltrowaniu (rozmiar oczek 200 μm) do probówki o pojemności 50 ml, dodać objętość 25 ml.
   3. Wirować przez 2 minuty przy 16 x g w temperaturze pokojowej.
   4. Poniższe kroki są wykonywane pod kapturem do hodowli komórkowej. Usunąć supernatant, zawiesić osad w 25 ml roztworu 6 i pozostawić do sedymentacji komórek przez 10 minut.
   5. Policz komórki i usuń supernatant, dodaj 25 - 50 ml roztworu 6 na komórki.

5. Przygotowanie kardiomiocytów do badań elektrofizjologii komórkowej, biochemicznej lub IF

1. W przypadku badań elektrofizjologicznych należy przechowywać miocyty w roztworze 6 w probówce o pojemności 50 ml i hamować sedymentację.
2. Do badań biochemicznych, np. obrazowania wapnia, miocyty płytkowe na szalce do hodowli komórkowej pokrytej lamininą (końcowe stężenie 20 μg/ml lamininy w PBS).
3. Do barwienia immunofluorescencyjnego przygotować płytkę do hodowli komórkowych ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi i pokryć roztworem lamininy (końcowe stężenie 50 μg/ml lamininy w PBS).
   1. Usuń roztwór przed posiewem miocytów. Płytki komórek i kontroluj gęstość komórek za pomocą mikroskopu.
   2. Pozostawić miocyty do szkiełka nakrywkowego przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w 2 % CO₂ , usunąć roztwór i natychmiast rozpocząć standardowy protokół procedury barwienia.
   3. Inkubować z utrwalaczem, np. 4% PFA w PBS (pH 7,5) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wykonać trzy etapy płukania PBS przez 5 minut każdy.
   4. Aby przeniknąć do komórek i zahamować niespecyficzne wiązanie przeciwciał, należy inkubować miocyty z 10% surowicą, 0,3% Tritonem, 0,2% BSA w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i przemyć w sposób opisany powyżej.
   6. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Aby przeciwdziałać barwieniu jąder i α-aktyninie, należy użyć DAPI i falloidyny sprzężonej z fluorochromem (Alexa Fluor 488, Invitrogen).
   7. Po umyciu ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe na szkiełka mikroskopowe nasączone silanem i zanurz komórki w fluorescencyjnym podłożu montażowym.

6. Elektrofizjologia komórkowa

1. Wykonaj zapisy całokomórkowe na świeżo izolowanych kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych w temperaturze pokojowej.
2. Przenieś zdrowo wyglądające kardiomiocyty do komory perfuzyjnej wypełnionej określoną objętością roztworu do kąpieli zewnątrzkomórkowej. 117 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 4 mM NaHCO₃, 1,7 mM MgCl₂, 3 mM CoCl₂, 10 mM HEPES, 10 mM glukozy i 0,02 mM tetrodotoksyny (TTX) (pH 7,4). Użyj NaOH do regulacji wartości pH.
3. Używaj odpowiedniego sprzętu do zacisków krosowych (tj. mikroskopu odwróconego IX71, wzmacniacza Multiclamp 700B, systemu akwizycji Digidata 1440A i komputera PC z oprogramowaniem pClamp10.3 (urządzenia molekularne)).
4. Stosować pipety krosowe o rezystancji 3-5 MΩ po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym zawierającym 130 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 11 mM HEPES, 11 mM EGTA, 5 mM Na₂ATP, 0,4 mM Na₂GTP, 5 mM Na₂CP i 4,9 mM CaCl₂ (pH 7,2). Użyj KOH do regulacji wartości pH.
5. Wywoływanie zewnętrznych prądów K+ w krokach napięcia 4,5 sekundy w celu przetestowania potencjałów w zakresie od -60 do +50 mV w krokach co 10 mV od potencjału podtrzymania -70 mV po 20-sekundowym impulsie wstępnym do -40 mV.
6. Upewnij się, że prądy upływowe zawsze wynoszą <100 pA.
7. Do analizy różnych prądów K+ należy stosować specyficzne inhibitory, takie jak 4-aminopirydyna (4-AP; ICN Biomedicals, Irvine, Kalifornia, Stany Zjednoczone), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomon) lub tetraetyloamonu (TEA; Sigma). Roztwory podstawowe należy przygotować w roztworze kąpieli zewnątrzkomórkowej i nanieść bezpośrednio w najbliższe możliwe sąsiedztwo komórki za pomocą mikrokońcówki po zapisach "linii bazowej". Równowaga powinna być pozostawiona na 2-3 minuty przed nagraniami "narkotykowymi".
8. Do analizy znormalizuj amplitudy prądu w poszczególnych komórkach do wielkości komórki (pojemność błony całej komórki). Analizuj dane w trybie offline za pomocą oprogramowania pClamp10.3 (Molecular Devices) lub porównywalnego oprogramowania.

Wyniki

Izolacja dorosłych kardiomiocytów myszy z myszy modyfikowanych genetycznie w celu badania funkcji specyficznych genów zainteresowania in vitro stała się potężnym narzędziem do lepszego zrozumienia patofizjologii serca. Metoda ta jest obecnie stosowana przez niewielką, ale stale rosnącą liczbę laboratoriów nauk podstawowych na całym świecie. Jednak izolacja dorosłych komórk mięśniowych serca z komór komór myszy może być trudna i musi być przeprowadzana starannie oraz wielokrotnie przez doświadczonych operatorów. ...

Dyskusja

Wraz z rosnącym rozwojem genetycznie modyfikowanych szczepów myszy do badania funkcji serca i patologii serca związanych z delecją genów, rośnie również zainteresowanie specjalistycznymi metodami badania skutków specyficznej delecji genu in vitro. W naszym laboratorium badamy rolę rodziny podjednostek pomocniczych kanału Kv w repolaryzacji serca. Geny KCNE obejmują rodzinę 5 genów (KCNE1-5), które odgrywają ważną rolę w repolaryzacji komór i przedsionków człowieka ^{11, 15}. KCNE

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tetrodotoksyna	Alomone
4-aminopirydyna	ICN Biomedicals
Heteropodatoxin 2	Alomone
Tetraethyloammonium	Sigma Chemicals Kolagenaza
Typ 2	Worthington