In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych

Podsumowanie

Zależne od doświadczenia zmiany molekularne w neuronach są niezbędne dla zdolności mózgu do adaptacji w odpowiedzi na wyzwania behawioralne. Opisano tutaj metodę obrazowania dwufotonowego in vivo, która umożliwia śledzenie takich zmian molekularnych w poszczególnych neuronach korowych za pomocą genetycznie kodowanych reporterów.

Streszczenie

Zdolność mózgu do zmian w odpowiedzi na doświadczenie jest niezbędna dla zdrowego funkcjonowania mózgu, a nieprawidłowości w tym procesie przyczyniają się do różnych zaburzeń mózgu^1,2. Lepsze zrozumienie mechanizmów, za pomocą których obwody mózgowe reagują na doświadczenia zwierzęcia, wymaga możliwości monitorowania zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w danym zestawie neuronów, przez dłuższy czas, u żywego zwierzęcia. Podczas gdy doświadczenie i związana z nim aktywność neuronalna są znane z wywoływania zmian ekspresji genów w neuronach^1,2, większość metod wykrywania takich zmian nie pozwala na wielokrotną obserwację tych samych neuronów przez wiele dni lub nie ma wystarczającej rozdzielczości, aby obserwować pojedyncze neurony^3,4. W tym miejscu opisujemy metodę, która łączy mikroskopię dwufotonową in vivo z genetycznie kodowanym reporterem fluorescencyjnym w celu śledzenia zależnych od doświadczenia zmian ekspresji genów w poszczególnych neuronach korowych w trakcie codziennego doświadczenia.

Jednym z dobrze znanych genów zależnych od doświadczenia jest białko związane z cytoszkieletem (Arc) o regulowanej ^{aktywności5,6}. Transkrypcja Arc jest szybko i silnie indukowana przez wzmożoną aktywność neuronalną^3, a jego produkt białkowy reguluje endocytozę receptorów glutaminianu i długoterminową plastyczność synaptyczną⁷. Ekspresja łuku jest szeroko stosowana jako marker molekularny do mapowania obwodów neuronalnych zaangażowanych w określone zachowania³. W większości tych badań ekspresję łuku wykryto za pomocą hybrydyzacji in situ lub immunohistochemii w nieruchomych odcinkach mózgu. Chociaż metody te ujawniły, że ekspresja Arc była zlokalizowana w podzbiorze neuronów pobudzających po doświadczeniu behawioralnym, nie zbadano, w jaki sposób wzorce komórkowe ekspresji Arc mogą się zmieniać z wieloma epizodami powtarzających się lub charakterystycznych doświadczeń w ciągu kilku dni.

Mikroskopia dwufotonowa in vivo oferuje potężny sposób badania zależnych od doświadczenia zmian komórkowych w żywym mózgu^8,9. Aby umożliwić badanie ekspresji łuku w żywych neuronach za pomocą mikroskopii dwufotonowej, wcześniej wygenerowaliśmy linię myszy knock-in, w której reporter GFP jest umieszczony pod kontrolą endogennego promotora łuku¹⁰. Protokół ten opisuje przygotowania chirurgiczne i procedury obrazowania do śledzenia zależnych od doświadczenia wzorców ekspresji Arc-GFP w zespołach neuronalnych u żywego zwierzęcia. W tej metodzie przewlekłe okna czaszki zostały najpierw wszczepione myszom Arc-GFP w obszarach kory mózgowej. Zwierzęta te były następnie wielokrotnie obrazowane za pomocą mikroskopii dwufotonowej według pożądanych paradygmatów behawioralnych w ciągu kilku dni. Metoda ta może być ogólnie stosowana do zwierząt będących nosicielami innych fluorescencyjnych reporterów zmian molekularnych zależnych od doświadczenia⁴.

Protokół

Procedury eksperymentalne opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Narodowym Instytucie Zdrowia Psychicznego i były zgodne z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

1. Wyczyść wszystkie narzędzia w gorącym sterylizatorze kulkowym przed zabiegiem aseptycznym, oczyść miejsce operacji 70% etanolem i połóż czyste ściereczki. Nosić sterylne rękawice. Znieczulić zwierzę świeżo przygotowanym 1,2% roztworem awertyny, podawanym dootrzewnowo w dawce 0,02 ml/g. Alternatywnie, znieczulenie gazem izofluranowym przez stożek nosowy, 5% do indukcji, 1,5% do konserwacji, z pasywnym obwodem zmiataczy. Sprawdź poziom znieczulenia za pomocą szczypania ogona lub palców u stóp, aby zapewnić pełną sedację.
2. Zakryj oczy zwierzęcia sterylną maścią okulistyczną i wstrzyknij podskórnie świeżo przygotowany deksametazon (0,2 mg/kg) i karprofen (5 mg/kg), aby zapobiec obrzękowi mózgu i zapaleniu¹¹. Ogol włosy nad czaszką między uszami i wysterylizuj skórę peelingiem betadynowym i trzema naprzemiennymi wacikami z 70% etanolu.
3. Zamontuj zwierzę w stadium operacji stereotaktycznej z nausznikami, z podkładką grzewczą z cyrkulacją wody pod zwierzęciem ustawioną na 37 °C. Regularnie sprawdzaj poziom znieczulenia zwierzęcia i w razie potrzeby uzupełniaj oryginalną dawkę środka znieczulającego.
4. Wstrzyknij 200 μl 0,5% Marcaine pod skórę głowy, aby znieczulić ten obszar. Naciąć skórę i usunąć płat skóry nad czaszką. Usuń okostną i osusz obszar czystymi wacikami.

2. Przewlekła operacja okna czaszkowego

1. Użyj szybkoobrotowej wiertarki dentystycznej z zadziorem 0,5 mm, aby delikatnie obrysować okrąg o średnicy 3-5 mm nad interesującym obszarem mózgu. Okresowo zwilżaj miejsce wiercenia sterylnym 0,9% soli fizjologicznej i usuwaj pył kostny czystymi bawełnianymi wacikami. Jeśli kość krwawi, użyj pianki żelowej nasączonej sterylną solą fizjologiczną, aby osuszyć krwawienie i poczekaj, aż się zatrzyma.
2. Po osiągnięciu ostatniej warstwy kości podnieś i usuń wyspę kostną za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Przyczepy opony twardej do dolnej półki kości można napotkać, jeśli okno przecina szew kostny. Powinny one być delikatnie usuwane w miarę podnoszenia płata kostnego.
3. Delikatnie rozwałkuj zwilżoną piankę żelową na odsłoniętej oponie twardej, aby oczyścić jej powierzchnię i poczekaj, aż krwawienie z opony twardej ustanie. Krytyczny krok: nie kontynuuj, dopóki całe krwawienie z opony twardej nie ustanie. Krew, która zostaje uwięziona w oknie czaszki, zwykle prowadzi do nieprzezroczystego okna.
4. Jeśli obszar zainteresowania znajduje się pod miejscem, w którym opona twarda jest szczególnie gruba, może być konieczne usunięcie opony twardej powyżej niej. W takim przypadku delikatnie oddziel oponę twardą od opony twardej poniżej za pomocą bardzo cienkich kleszczy, wykonaj małe nacięcie w uniesionej oponie twardej za pomocą kolejnej pary cienkich kleszczy, a następnie chwyć przycięte krawędzie i delikatnie rozłup oponę twardą. Opona twarda jest cienka, ale mocna, więc uważaj, aby nie przeciąć mózgu nienaruszonymi krawędziami opony twardej.
5. Spłucz obszar sterylnym ACSF lub sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
6. Połóż sterylne szklane szkiełko nakrywkowe (3-5 mm) na oponie twardej lub pia. Krok krytyczny: Jeśli otaczająca czaszka znacznie się zakrzywia, użyj kleju Kwiksil¹², aby wypełnić przestrzenie, w których opona twarda lub pia nie miałyby bliskiego kontaktu ze szkiełkiem nakrywkowym w obszarach, które nie zostaną zobrazowane.
7. Użyj żelu cyjanoakrylowego, aby pokryć klej elastomerowy i krawędzie szkiełka nakrywkowego. Przykryj całą odsłoniętą czaszkę żelem cyjanoakrylowym lub mieszanką krazyglue i cementu dentystycznego. Krok krytyczny: Nie pozwól, aby żel cyjanoakrylowy dotykał powierzchni mózgu.
8. Umieść wykonany na zamówienie metalowy pręt mocujący głowę na przeciwległym końcu czaszki.
9. Zwierzę należy umieścić w ciepłej komorze rekonwalescencji, po dootrzewnowym wstrzyknięciu ketoprofenu w dawce 5 mg/kg mc. w celu leczenia bólu. Kontynuuj działanie przeciwbólowe jeszcze przez dwa dni po operacji.
10. Po dwóch tygodniach rekonwalescencji pooperacyjnej znieczulij zwierzę izofluranem (5% do indukcji, 1,5% do konserwacji), zamontuj go w specjalnie wykonanym stoliku mikroskopowym z ramką do mocowania głowy i sprawdź okienko czaszki pod kątem przejrzystości optycznej przy oświetleniu niebieskim światłem. Przejrzystość naczyń krwionośnych na powierzchni mózgu jest wysoce wskaźnikiem jakości okna czaszkowego. Jeśli krawędzie naczyń krwionośnych są ostro zarysowane, okienko prawdopodobnie będzie nadawało się do użytku. Zalecany jest dwutygodniowy czas rekonwalescencji po operacji, aby zapewnić zwierzęciu wystarczającą ilość czasu na powrót do zdrowia po operacji. Okna czaszki zazwyczaj oczyszczają się i poprawiają w tym czasie i pozostają optycznie przezroczyste przez dodatkowe tygodnie do miesięcy, aż odrost czaszki lub pogrubienie opony twardej pogorszy jakość okna.

3. Protokół behawioralny i skaning laserowy Mikroskopia dwufotonowa

1. Zwierzęta z przezroczystymi oknami czaszkowymi zostaną wystawione na bodziec środowiskowy lub poddane sesji treningu behawioralnego, a następnie zobrazowane w momencie maksymalnej ekspresji Arc-GFP. Przed rozpoczęciem protokołu behawioralnego zwierzę powinno być trzymane w spójnym środowisku klatki domowej, aby zminimalizować codzienne wahania w wyjściowych poziomach ekspresji Arc-GFP.
2. Rozpocznij trening behawioralny lub paradygmaty stymulacji środowiskowej, w zależności od obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład, zwierzęta mogą być wystawione na działanie różnych środowisk wizualnych przez kolejne dni i obrazowane każdego dnia po stymulacji wzrokowej w celu zidentyfikowania reakcji specyficznych dla bodźca w korze wzrokowej¹⁰.
3. Fluorescencja Arc-GFP w neuronach zwykle osiąga swój szczytowy poziom dwie godziny po stymulacji. Eksperymentalna oś czasu może zostać zoptymalizowana, aby ułatwić wykrywanie ekspresji Arc-GFP w neuronach przy ich szczytowych poziomach fluorescencji.
4. Po zakończeniu treningu behawioralnego lub stymulacji środowiskowej znieczulij zwierzę izofluranem (5% do indukcji, 1,5% do konserwacji) i zamontuj zwierzę w specjalnie wykonanym stoliku mikroskopowym z ramką do mocowania głowy pod mikroskopem dwufotonowym.
5. Pozycja głowy zwierzęcia jest przymocowana do ramy mocującej głowę, która łączy się bezpośrednio ze sceną, za pomocą wszczepionego metalowego pręta na czaszce. Izofluran i tlen są w sposób ciągły dostarczane do myszy przez stożek nosowy. Temperatura ciała jest utrzymywana za pomocą poduszki grzewczej.
6. Upewnij się, że detektory mikroskopowe są chronione przed światłem otoczenia, przeprowadzając dwufotonowe skanowanie laserowe w ciemnym pomieszczeniu. Do obrazowania należy używać obiektywu zanurzeniowego 20x lub 25x (apertura numeryczna 1.05). Najpierw, w oświetleniu epi-fluorescencyjnym, uzyskaj obraz wzorów naczyń krwionośnych na powierzchni mózgu za pomocą kamery CCD w celu przyszłego wyrównania obrazu.
7. Rozpocznij dwufotonowe skanowanie laserowe, aby uzyskać stos obrazów 3D. W naszej konfiguracji używany jest mikroskop wielofotonowy Olympus FV1000MPE. Długość fali wzbudzenia lasera dwufotonowego jest ustawiona na 920 nm, a moc lasera emitowanego z obiektywu jest ustawiona na około 50 mW. Emitowana fluorescencja jest jednocześnie wykrywana w kanałach zielonym i czerwonym (zwierciadło dichroiczne przy 570 nm, filtry barierowe przy 495-540 nm i 570-625 nm), za pomocą zewnętrznego dwukanałowego systemu detekcji fotomutelierowej umieszczonego w pobliżu próbki. Fluorescencja Arc-GFP pojawia się tylko w kanale zielonym, podczas gdy autofluorescencja tkankowa pojawia się w obu kanałach^{13, 14}.
8. Typowe stosy obrazów mają wymiary około 320x320x100 μm (szerokość x długość x głębokość), rozdzielczość poziomą 0,5 μm/piksel i rozdzielczość pionową 3 μm/piksel.
9. Po zdobyciu stosu obrazów przywróć zwierzę do jego domowej klatki. Nie przeszkadzaj zwierzęciu do następnej sesji behawioralnej i obrazowej. Powtarzaj procedurę zachowania i obrazowania przez kilka dni zgodnie z potrzebami. Użyj wcześniej uzyskanego obrazu naczynia krwionośnego na powierzchni mózgu, aby zorientować się z powrotem w tym samym miejscu obrazowania.

Wyniki

Ten protokół opisuje metodę śledzenia zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w poszczególnych neuronach korowych u żywych zwierząt. Przewlekłe okno czaszki jest najpierw tworzone nad obszarem kory mózgowej u myszy przenoszącej fluorescencyjny reporter ekspresji genów. Mikroskopia dwufotonowa może być następnie połączona z różnymi paradygmatami behawioralnymi, aby obserwować behawioralnie indukowane zmiany molekularne w poszczególnych neuronach i śledzić takie zmiany w tych samych zestawach neuronów przez wiele ...

Dyskusja

Opisana tutaj metoda obrazowania in vivo umożliwia wielokrotne badanie zmian ekspresji genu Arc w tych samych zestawach neuronów przez wiele dni u żywego zwierzęcia. Jest to skuteczna i wszechstronna metoda uzyskiwania informacji o dynamice molekularnej związanej z plastycznością neuronalną w poszczególnych neuronach w odpowiedzi na różne doświadczenia behawioralne. Standardowe metody histochemiczne, takie jak hybrydyzacja in situ i barwienie immunologiczne, mogą osiągnąć rozdzielczość^{pojedynczej...}

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wielofotonowy laserowy mikroskop skaningowy FV1000 Mikroskop do	obrazowania	Olympus	FV1000MPE
preparacyjny	Omano	555V107	Chirurgia
Etap operacji stereotaksji dla myszy	Aparat Harvarda	726335	Chirurgia
zanurzeniowy 20X lub 25X			obrazowania
z rama do mocowania głowy	Wykonane na zamówienie	obrazowanie	Nie dotyczy
Drobne kleszcze	Narzędzia do nauki	11251-20	Chirurgia
Frez dentystyczny	Fine Science Tools	19007-05	Chirurgia
Kamera CCD	QImaging	QICAM 12-bitowe	obrazowanie