Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

Podsumowanie

Prezentujemy technikę oznaczania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zarodków Drosophila, która pozwala na analizę morfologii neuronów za pomocą światła przechodzącego lub mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

W tym artykule opisujemy, jak indywidualnie oznaczyć neurony w embrionalnym OUN Drosophila melanogaster poprzez zestawienie komórkowe lipofilowego markera fluorescencyjnego DiI. Metoda ta pozwala na bardzo szczegółową wizualizację morfologii komórek neuronalnych. Możliwe jest oznaczenie dowolnej komórki w OUN: ciała komórkowe docelowych neuronów są wizualizowane pod optyką DIC lub przez ekspresję fluorescencyjnego markera genetycznego, takiego jak GFP. Po znakowaniu DiI można przekształcić w trwałą brązową plamę przez fotokonwersję, aby umożliwić wizualizację morfologii komórki za pomocą światła przechodzącego i optyki DIC. Alternatywnie, komórki znakowane DiI można obserwować bezpośrednio za pomocą mikroskopii konfokalnej, co umożliwia kolokalizację genetycznie wprowadzonych fluorescencyjnych białek reporterowych. Technika ta może być stosowana u każdego zwierzęcia, niezależnie od genotypu, umożliwiając analizę zmutowanych fenotypów w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Wprowadzenie

Znajomość morfologii neuronów na poziomie pojedynczych komórek jest kluczowym warunkiem wstępnym do zrozumienia połączeń neuronalnych i funkcji OUN. Tak więc od najwcześniejszych dni neuronauki naukowcy starali się opracować techniki znakowania pojedynczych komórek (patrz ⁷, aby zapoznać się z historycznym omówieniem tego problemu). Klasyczne metody, takie jak barwienie Golgiego, zapewniają doskonałą rozdzielczość morfologii neuronów, ale nie są odpowiednie, jeśli ktoś stara się oznaczyć określony typ neuronu w ukierunkowany sposób, ponieważ barwienie zachodzi w sposób losowy. Opracowanie metod barwienia pojedynczych komórek poprzez wewnątrzkomórkowe lub zbliżeniowokomórkowe wstrzykiwanie barwników z mikroelektrody było odpowiedzią na wymóg specyficznego znakowania.

Zastosowanie iniekcji barwnika z pojedynczym neuronem do Drosophila stanowiło duże wyzwanie, ze względu na mały rozmiar zarówno organizmu, jak i jego neuronów. Niemniej jednak, barwienie pojedynczych neuronów embrionalnych Drosophila zostało osiągnięte w połowie lat 80. w laboratorium Coreya ^Goodmana. Chociaż metoda ta okazała się niezwykle przydatna i dostarczyła kilku kluczowych informacji na temat mechanizmów rozwoju neuronów u Drosophila w ciągu ostatnich 20-30 lat (np. ^{2, 10}), wielu pracowników unikało jej, głównie ze względu na jej wymagania techniczne.

Dostępność w ostatnich latach technik genetycznych do znakowania neuronów u Drosophila również przyczyniła się do niepopularności iniekcji barwnika z pojedynczym neuronem. Ukierunkowana na GAL4 ekspresja konstruktów GFP ukierunkowanych na błonę może zapewnić doskonałą rozdzielczość morfologii neuronalnej ^{1, 20}. Jednak ta metoda ma pewne ograniczenia: często nieunikniona ekspresja GFP w wielu komórkach może przesłaniać strukturę poszczególnych neuronów, a linia sterująca GAL4 może nie być dostępna, aby sterować ekspresją w konkretnym neuronie będącym przedmiotem zainteresowania. Metoda MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker) ⁸ może zapewnić znakowanie zasadniczo każdego neuronu na poziomie pojedynczej komórki, ale nie może być z powodzeniem stosowana w zarodku i wczesnej larwie ze względu na powolny obrót białka GAL80.

Biorąc pod uwagę te ograniczenia genetycznego znakowania, uważamy, że wstrzyknięcie pojedynczego barwnika z neuronu do zarodka Drosophila pozostaje wartościową techniką i zasługuje na szersze zastosowanie. Aby promować ten cel, podajemy tutaj szczegółowy opis metody. Ilustracją jego mocy jest nasze niedawne badanie morfologii kompletnego zestawu interneuronów w neuromerach brzusznych późnego zarodka Drosophila ¹⁴. To badanie, które ujawniło zarówno zmienność morfologiczną poszczególnych typów komórek nerwowych, jak i zasady organizacji neuromerów w OUN zarodka, nie byłoby możliwe przy użyciu żadnej innej obecnie dostępnej metody znakowania.

Protokół

W naszych laboratoriach użyliśmy dwóch nieco różniących się wariantów metody znakowania pojedynczych neuronów. Różnice dotyczą etapów pobierania zarodków, dechorionizacji, dewitalinizacji i filetowania zarodków. Rysunek 1 przedstawia przegląd wspólnych i rozbieżnych etapów wariantów.

1. Przygotowanie mikroigieł do rozwarstwiania zarodków i mikropipet do wstrzykiwania barwnika

1. Szklane igły do preparowania zarodków są pobierane ze szklanych naczyń włosowatych (o średnicy 1 mm i grubości ścianki 0,1 mm) za pomocą ściągacza Sutter (Science Instruments) lub porównywalnego sprzętu. Alternatywnie do preparacji stosuje się elektrolitycznie zaostrzony drut wolframowy o średnicy 0,15 mm zamontowany w uchwycie na igłę. (Instrukcje dotyczące ostrzenia elektrolitycznego znajdują się w ⁹).
2. Mikropipety do iniekcji barwnika są pobierane z cienkościennych szklanych kapilar z wewnętrznymi włóknami (Science Products; GB 100 TF 8P) ze ściągaczem Sutter (Science Instruments) lub porównywalnym sprzętem. Końcówka mikropipety musi być ostra, ze stopniowym, równomiernym zwężeniem trzonka, aby ułatwić przejście przez tkanki zarodka. Pożądaną mikropipetą jest odmiana "Mikroelektroda o wysokiej rezystancji, ostra i długa", opisana na str. 20 podręcznika Sutter Instrument Pipette Cookbook (http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf). Ogólnie rzecz biorąc, mikropipety są pobierane na krótko przed wykonaniem iniekcji, aby zapewnić, że ich końcówki pozostają ostre i czyste.

2. Pobieranie, montowanie i sekcja zarodków

1. Pobieranie zarodków. Z powodzeniem zastosowaliśmy opisaną tutaj metodę iniekcji neuronów w zarodkach od 12 do 17 ³ wieku. Zarodki stopniowo rozwijają naskórek w stadium 17 i stają się coraz trudniejsze do wycięcia. Dostępne są dwa alternatywne podejścia do pozyskiwania zarodków na określonym etapie rozwoju.
   1. Pozwól muchom złożyć jaja przez noc na talerzach z sokiem jabłkowym pokrytych pastą drożdżową. Dostosuj temperaturę pobierania komórek jajowych do planowanej pory wstrzyknięcia następnego dnia. Następnego dnia zbierz wszystkie jaja i wybierz zarodki na pożądanym etapie, stosując kryteria morfologiczne ³.
   2. Pozwolić muchom ułożyć się na płytkach agarowych, jak powyżej, ale co 1,5 godziny w temperaturze 25 °C wymieniać muchy na nową. Inkubować każdą płytkę przez określony okres czasu, aż zarodki osiągną wymagane stadium rozwoju.
2. 1. Dechorionacja chemiczna. Za pomocą metalowej szpatułki zeskrobać zarodki z agaru i przenieść je do szklanego naczynia (np. szalki Petriego lub bloku jamowego) zawierającego około 10 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) Drosophila Ringera lub roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodaj kilka kropli skoncentrowanego wybielacza i mieszaj przez kilka minut na platformie obrotowej, aż kosmówka złuszczy się z zarodków. Umyj zarodki w kilku zmianach Ringera/PBS, aż nie będzie zapachu resztkowego wybielacza. Podczas tych płukań upewnij się, że zarodki nie stykają się z powierzchnią płynu. W przeciwnym razie będą unosić się na wodzie i staną się trudne do zanurzenia w celu późniejszej manipulacji. Alternatywnie, dechorionację chemiczną można przeprowadzić przy użyciu techniki koszowej opisanej w ^{punkcie 4}.
   2. Dechorionacja mechaniczna (patrz rysunek 2, kroki 1-4). Przenieś zarodki z płytki agarowej na szkiełko pokryte dwustronną taśmą klejącą. Unikaj przenoszenia agaru z zarodkami, ponieważ zakłóci to ich przyleganie do taśmy. Pozostaw zarodki do wyschnięcia na 5 do 10 minut, aż kosmówka stanie się lekko krucha. (W oczekiwaniu posmaruj klejem szkiełko nakrywkowe potrzebne do późniejszej dewitalinizacji - patrz 2.3B poniżej). Delikatnie dotknij każdego zarodka igłą. Kosmówka pęknie, a zarodek przyklei się do igły. Natychmiast przenieś zarodki do bloku agarowego, aby zapobiec wysuszeniu i wyrównaj około 10 z nich w rzędzie, ich brzusznymi stronami do góry.

Dewitellinizacja i filetowanie są wykonywane ręcznie przy użyciu jednej z dwóch metod opisanych w 2.3A i 2.3B.

3. 1. Przenieść pojedynczy zarodek z odkorówką w odpowiednim stadium rozwojowym z naczynia z roztworem Ringera do kilku kropli Ringera w koferdamie silikonowej na wcześniej przygotowanym szkiełku mikroskopowym. (Wykonaj koferdam o średnicy 3 cm, rozsmarowując cienką warstwę szczeliwa silikonowego na szkiełku mikroskopowym, a następnie dodaj kroplę 0,01% roztworu poli-L-lizyny do środka zapory. Pozostaw silikon do utwardzenia przez 24 godziny.) Przenieść zarodek za pomocą szklanej pipety Pasteura, upewniając się, że zarodek pozostaje pod powierzchnią Ringera podczas transferu.
      Usztywnij tylny koniec zarodka parą cienkich kleszczy, delikatnie ściskając zarodek cienkimi nożyczkami do irydektomii, około jednej czwartej drogi do tyłu od jego przedniego końca. Nie przecinaj zarodka. Celem jest po prostu pęknięcie błony witelinowej, powodując przy tym minimalne uszkodzenie zarodka. Gdy kleszcze są nadal na swoim miejscu, użyj igły wolframowej, aby wyjąć zarodek z otwartej błony i umieść go brzuszną stroną do dołu na szkiełku. Zarodek powinien przykleić się do płaszcza polilizynowego.
      Zarodek należy wyfiletować zaostrzoną igłą wolframową. Delikatnie perforuj, a następnie rozerwij ścianę ciała wzdłuż grzbietowej linii środkowej. Za pomocą igły dociśnij ściankę korpusu tak, aby przykleiła się do szkiełka. Aby zapobiec uszkodzeniu ściany ciała, popchnij ścianę ciała tak, aby jelito umieszczono między nią a igłą. Następnie użyj igły, aby przebić się przez jelito na jego przednim i tylnym końcu i podnieś je. W razie potrzeby dodatkowe zarodki mogą zostać przeniesione na to samo szkiełko, poddane dewitellinizacji i filetowane, uważając, aby nie uszkodzić innych zarodków znajdujących się już na szkiełku.
   2. Szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 x 60 mm pokryć klejem heptanowym (patrz Tabela 1), umieszczając niewielką kroplę kleju na środku szkiełka i rozprowadzając ją za pomocą szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18 x 18 mm na bardzo cienkiej folii. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym i wykonaj ramkę z jednostronnej taśmy klejącej wokół jej krawędzi. Odetnij nadmiar agaru z bloku trzymającego rząd 10 zarodków, delikatnie dotknij zarodków szkiełkiem nakrywkowym z kleju heptanowego nakrywkowego. Powinny teraz przylegać do szkiełka nakrywkowego brzusznymi stronami skierowanymi w dół. Dodać dużą ilość PBS, aby przykryć zarodki (patrz Rycina 2, kroki 4-6).
      Przeniknij przez błonę witelinową szklaną lub wolframową igłą po grzbietowej stronie każdego zarodka w pobliżu jego tylnego końca. Rozerwij błonę wzdłuż grzbietowej linii środkowej i wyciągnij zarodek z błony. Ustawić zarodek brzuszną stroną do dołu w innym miejscu na podłożu z kleju heptanowego i zafiletować go tą samą metodą, którą opisano w ppkt 2.3A) (patrz Rysunek 2, kroki 7-8). Ponieważ kilka zarodków zostanie zafiletowanych na tym samym szkiełku, pomocne jest albo bardzo dokładne określenie ich orientacji, albo wykonanie rysunku ich orientacji na szkiełku.
4. Po filetowaniu zarodki można lekko utrwalać przez 10-15 minut w 7,4% formaldehydzie w PBS, a następnie 4 płukania w PBS. Należy zachować szczególną ostrożność, aby podczas tego procesu nie dopuścić do kontaktu zarodka z powierzchnią roztworu, ponieważ siły napięcia powierzchniowego zniszczą zarodek. Ten etap wstępnej fiksacji nie jest bezwzględnie konieczny, ale jest przydatny, aby zapobiec skurczowi mięśni ściany ciała u zarodków w późnym stadium rozwoju i pomóc ustabilizować tkanki embrionalne w młodych stadiach. Należy pamiętać, że fiksacja sprawia, że tkanki zarodka są bardziej nieprzezroczyste, a więc nieco pogarsza jakość obrazu pod obserwacją DIC.

3. Napełnianie mikropipet iniekcyjnych

Napełnij do połowy 0,5 ml probówki do mikrofug Eppendorf 0,1% roztworem barwnika karbocynaninowego DiI (Molecular Probes, Eugene, OR) w 100% etanolu (upewnij się, że używasz 'suchego' absolutnego EtOH, aby uniknąć wytrącania się DiI). Zrób wąski otwór w wieczku probówki i włóż koniec mikropipety przez otwór w pokrywce. Pozwól DiI wznieść się w górę filamentu przez co najmniej 5 minut (zawsze zakrywaj otwór w pokrywie, gdy nie napełniasz mikropipety, aby uniknąć odparowania etanolu).

Sprzęt wymagany do wstrzykiwania barwnika neuronowego (Rysunek 3).

Mikroskop. Do wstrzykiwania barwnika do neuronów należy użyć mikroskopu stałego stopnia, aby uniknąć pionowego ruchu zarodka podczas ogniskowania. Każdy taki ruch spowodowałby przemieszczenie pipety po jej kontakcie z zarodkiem. Stwierdziliśmy, że zarówno modele Zeiss Axioskop FS, jak i Olympus AX50/BX50 doskonale nadają się do tego celu. Mikroskop powinien być wyposażony w optykę DIC w świetle przechodzącym do wizualizacji neuronów przed barwieniem. Mikroskop powinien być również modelem pionowym, a nie odwróconym. W mikroskopie pionowym końcówka mikropipety znajduje się po tej samej stronie zarodka, co obiektyw obserwacji, podczas gdy w mikroskopie odwróconym obie znajdują się po przeciwnych stronach zarodka. Ten ostatni układ pogarsza jakość optyki DIC. Mikroskop powinien być przystosowany do mikroskopii fluorescencyjnej, z odpowiednim zestawem filtrów do obserwacji DiI. Ponieważ DiI ma porównywalnie szerokie spektrum z maksimami wzbudzenia i emisji przy 549 i 565 nm, sprawdzi się wiele zestawów filtrów w tym zakresie, np. te dla Alexa 568, Cy3, Rhodamine, Texas Red czy TRITC. Chociaż wygodnie jest zamontować elektronicznie sterowaną migawkę na drodze fluorescencji źródła światła, aby umożliwić obsługę migawki bez kontaktu dłoni z mikroskopem, skutecznie oznaczyliśmy również konfigurację, która była wyposażona tylko w ręczną migawkę. Wreszcie, do obserwacji podczas iniekcji wymagany jest obiektyw zanurzeniowy w wodzie o dużym powiększeniu i dużej aperturze numerycznej. Obiektyw ten powinien być przeznaczony do stosowania bez szkiełka nakrywkowego. Z powodzeniem korzystaliśmy z obiektywów Zeiss Achroplan 100x/1.0W, Olympus LUMPlan FL 100x/1.0W oraz Olympus LUMPlan FL/IR 60x/0.9 W.

Mikromanipulator jest wymagany do ustawienia i przesuwania mikropipety podczas wstrzykiwania barwnika do neuronów. Użyliśmy zarówno mikromanipulatora Leica, jak i 3-osiowego mikromanipulatora hydraulicznego Narashige montowanego na stoliku.

Wewnątrzkomórkowy wzmacniacz prądu stałego, z możliwością wstrzykiwania prądu, jest wymagany do jonoforetycznego wstrzykiwania DiI z mikropipety.

4. Procedura wstrzykiwania barwnika

1. Umieścić szkiełko z zamontowanymi zarodkami (zarodkami) na stoliku mikroskopu iniekcyjnego (ryc. 3). Użyj obiektywu 10x, aby zlokalizować zarodek i umieścić go w środku pola widzenia.
2. Przesuń obiektyw o dużej mocy do pozycji viewview i ustaw ostrość na zarodku. Zlokalizuj interesującą komórkę pod optyką DIC (lub za pomocą fluorescencji, jeśli komórka docelowa wykazuje ekspresję GFP) i umieść ją w środku pola widzenia. Upewnij się, że przysłona polowa mikroskopu jest otwarta tylko do krawędzi pola widzenia, a nie poza nią. Wąska wiązka oświetlenia pomoże w ustawieniu mikropipety (patrz krok 4.4 poniżej). Podnieś obiektyw tak długo, aż znajdzie się jak najwyżej nad zarodkiem, pozostając w kontakcie z roztworem Ringera/PBS.
3. Umieścić elektrodę kąpielową wzmacniacza prądu stałego w studzience PBS, z dala od zarodka i ścieżki mikropipety.
4. Włożyć mikropipetę iniekcyjną do uchwytu, który został wypełniony roztworem 0,1 M LiCl. Przymocuj uchwyt mikropipety do mikromanipulatora. Za pomocą zgrubnych elementów sterujących mikromanipulatora umieść mikropipetę w przestrzeni między końcówką obiektywu a zarodkiem. Upewnij się, że znajduje się znacznie powyżej poziomu zarodka. Ze względu na niewielką odległość roboczą obiektywu o dużej mocy, mikropipeta będzie musiała być trzymana pod płytkim kątem, aby ustawić ostrość (patrz rysunek 3). W pierwszej kolejności będziesz musiał ustalić odpowiedni kąt metodą prób i błędów. Jeśli kąt jest zbyt duży, nie będzie można ustawić ostrości końcówki mikropipety. Jeśli jest zbyt płytka, trzon mikropipety będzie ocierał się o ścianę zapory, która utrzymuje roztwór do kąpieli na miejscu.
5. Wyśrodkuj końcówkę mikropipety w polu view. Aby to osiągnąć, przyłóż wzrok do poziomu zarodka i przesuwaj mikropipetę do przodu i do tyłu w osi Y stolika mikroskopu. Kiedy jego końcówka przetnie ścieżkę światła, zobaczysz jasne odbicie promieni świetlnych od niej. Przesuń końcówkę mikropipety do przodu w osi X, tak aby wystrzeliła poza wiązkę światła. Łatwiej będzie zlokalizować mikropipetę w małym polu widzenia obiektywu o dużej mocy, jeśli szukasz jej trzonu, a nie końcówki. Teraz spójrz przez okulary mikroskopu i stopniowo obniżaj obiektyw o dużej mocy, aż trzon mikropipety znajdzie się w ostrości. Przesuwanie mikropipety do przodu i do tyłu w osi Y za pomocą elementów sterujących mikromanipulatora pomaga ją zlokalizować, gdy stopniowo nabiera ostrości. Gdy trzon jest ustawiony na ostrości, przesuń mikropipetę w osi X, aż jej końcówka znajdzie się w środku pola widzenia. Na tym etapie końcówka mikropipety powinna znajdować się znacznie powyżej poziomu zarodka. Przełącz się na oświetlenie fluorescencyjne i sprawdź końcówkę, aby sprawdzić, czy nie ma wycieku DiI. Dostosuj prąd stały, aby zapobiec tworzeniu się kryształu DiI na końcówce.
6. Za pomocą elementów sterujących mikromanipulatora opuść mikropipetę w osi Z. Przywróć ostrość za pomocą regulatora ostrości mikroskopu. W ten sposób stopniowo opuszczaj mikropipetę w dół w kierunku zarodka. Początkowo można to zrobić za pomocą zgrubnych elementów sterujących osią Z mikromanipulatora i mikroskopu. Jednak, gdy zarodek staje się ostry, należy przełączyć się na precyzyjne pokrętła sterujące.
7. Gdy powierzchnia zarodka znajdzie się w ostrości, przesuń końcówkę mikropipety w kierunku krawędzi pola widzenia, w kierunku mikromanipulatora. Skoncentruj się na komórce, która ma zostać wstrzyknięta, i sprawdź, czy znajduje się w środku pola widzenia. Ponownie ustaw ostrość na końcówce mikropipety i przesuwaj ją w osi Y, aż znajdzie się na tym samym poziomie w osi Y co kuweta. Przesuń końcówkę mikropipety w kierunku kuwety w osi X, opuszczając ją w osi Z. Jeśli używasz mikromanipulatora Leica, prawdopodobnie przekonasz się, że elementy sterujące stolikiem mikroskopu zapewniają dokładniejszą kontrolę ruchu w osi X niż elementy sterujące mikromanipulatora, więc przełącz się na sterowanie stolikiem, gdy końcówka zbliży się do komórki.
8. Doprowadź końcówkę mikropipety do kontaktu z ogniwem i wykonaj wgłębienie na jej powierzchni. Przepuść kilka nanoamperów prądu depolaryzującego przez kilka sekund. Powinieneś zobaczyć mały kryształ DiI tworzący się na komórce. Aby potwierdzić, że komórka została oznaczona, otwórz na krótko migawkę, aby oświetlić zarodek światłem fluorescencyjnym, a następnie przełącz się z powrotem na DIC. Jeśli treść komórki będącej przedmiotem zainteresowania wykazuje oznaki etykietowania, zastosuj prąd jeszcze przez kilka sekund. Wyłącz prąd i szybko odciągnij zarodek od mikropipety w osi X za pomocą kontroli stolika mikroskopu. Następnie wyjąć mikropipetę z roztworu. Jeśli nie ma widocznego oznaczenia DiI, mikropipeta może być zablokowana i będzie wymagała wymiany na nową mikropipetę. Może się okazać, że końcówka mikropipety zaczepiła się o inne tkanki w drodze do komórki będącej przedmiotem zainteresowania i to tkanka jest przebarwiona, a nie komórka. W takim przypadku spróbuj nieznacznie wyjąć mikropipetę i ponownie zbliżyć się do celi. Może być konieczna wymiana mikropipety i ponowienie próby.

9. W razie potrzeby wiele komórek może być indywidualnie znakowanych w tym samym zarodku.
10. Usunąć większość roztworu z komory iniekcyjnej, a następnie utrwalić zarodki, dodając 7,4% formaldehydu/PBS przez 10 minut, a następnie przepłukać 4 płuczkami PBS. Zarodek pozostawia się następnie w temperaturze pokojowej na co najmniej 4 godziny (lub na noc w temperaturze 4 °C) w ciemnej, wilgotnej komorze (aby uniknąć bielenia lub opadania na sucho), aby umożliwić dyfuzję DiI w procesach neuronalnych. Na tym etapie komórki znakowane DiI mogą być fotokonwertowane lub oglądane bezpośrednio w mikroskopie konfokalnym.

5. Fotokonwersja do badania za pomocą optyki DIC

Zasada fotokonwersji polega na (foto)utlenianiu DAB przez światło fluorescencyjne emitowane przez zabarwioną komórkę podczas oświetlenia o odpowiedniej długości fali. Oznacza to, że jasne komórki są fotokonwertowane w krótszym czasie w porównaniu ze słabo wybarwionymi komórkami. Jeśli wiele komórek oznaczonych w jednej próbce różni się zbytnio pod względem jasności, może to prowadzić do trudności w fotokonwersji wszystkich z nich w tej samej jakości (patrz Rysunek 4C): w takim przypadku może być konieczne podjęcie decyzji o kompromisie między zaniedbaniem słabszych ogniw (użycie krótkiego oświetlenia) a zaakceptowaniem faktu, że jaśniejsze ogniwa zaczynają pęcznieć (przy użyciu dłuższego oświetlenia). Jeśli wszystkie komórki są zbyt słabo oznakowane (a więc wymagają bardzo długiego oświetlenia), tło spowodowane przez endogenne peroksydazy może stać się problemem. Ponieważ DAB jest toksyczny, należy obchodzić się z nim ostrożnie. Odpady można "dezaktywować" za pomocą 7% wybielania chlorem.

1. Fotokonwersję należy przeprowadzić indywidualnie dla każdego zarodka. W przypadkach, gdy wstrzykuje się tylko jeden zarodek na szkiełko, roztwór PBS pokrywający zarodek zastępuje się roztworem DAB (3 mg DAB/ml buforu Tris), szkiełko umieszcza się pod mikroskopem fluorescencyjnym, a wypełnioną komórkę ogląda się obiektywem 100x. (Używając mikroskopu pionowego, obiektyw zanurza się w roztworze DAB i powinien być kilkakrotnie oczyszczony wodą po zakończeniu procedury fotokonwersji; można tego uniknąć, jeśli używany jest mikroskop odwrócony). Stosuje się zestaw filtrów Cy3 i lampę Hg o mocy 100 W, a komórkę wystawia się na działanie czerwonych długości fal wzbudzenia, aż brązowy produkt reakcji DAB stanie się widoczny w znakowanym neuronie (sprawdzaj okresowo, przełączając się na oświetlenie jasnego pola). Czas potrzebny do optymalnego barwienia DAB jest zmienny, ale wymaga ekspozycji na światło wzbudzające poza etapem, w którym fluorescencja całkowicie zanikła. Po zakończeniu fotokonwersji należy kilkakrotnie przemyć preparat PBS. Zastąp PBS kroplą 70% glicerolu, zeskrob silikon ostrzem skalpela, zastąp pierścieniem wazeliny i dodaj szkiełko nakrywkowe.
2. Gdy wiele zarodków zostało wypełnionych na jednym szkiełku, przenieść każdy zarodek do małej kropli PBS na oddzielnym szkiełku nakrywkowym o wymiarach 24 x 60 mm, tak aby brzuszna strona zarodka była skierowana w stronę szkła. Umieść ramkę taśmy klejącej wokół każdego zarodka, aby utworzyć zagłębienie i przykryj preparat PBS. Przechowuj szkiełka w wilgotnej komorze przed fotokonwersją, aby zapobiec ich wyschnięciu. Wymienić PBS pokrywający zarodek na roztwór DAB. Natychmiast umieść szkiełko na odwróconym mikroskopie wyposażonym w lampę Hg o mocy 100 W i użyj zestawu filtrów Cy3 do wzbudzenia DiI, używając obiektywu x 50. Po fotokonwersji przenieś zarodek na świeże szkiełko w kropli 70% glicerolu, dodaj szkiełko nakrywkowe i zamknij lakierem do paznokci.

6. Badanie za pomocą mikroskopii konfokalnej

1. Po kroku 4.10 przenieść zarodki do małej kropli PBS na świeżym szkiełku nakrywkowym o wymiarach 24 x 60 mm. Optymalna optyka uzyskujemy poprzez montaż spłaszczonych zarodków stroną grzbietową w kierunku szkiełka nakrywkowego (pozostawiając tylko niewielką ilość PBS między szkiełkiem nakrywkowym a zarodkiem).
2. Umieść ramkę taśmy klejącej wokół zarodka i powiększ kroplę PBS, aby wypełnić ramkę, gdy jest pokryta szkiełkiem. Ostrożnie umieść na nim szkiełko i przymocuj go lakierem do paznokci. Wypełnione neurony należy jak najszybciej zbadać pod mikroskopem konfokalnym (lub fluorescencyjnym).

Wyniki

Rycina 4 przedstawia typowe wyniki opisanej tutaj techniki. Rycina 4A pokazuje przykład pojedynczego interneuronu wypełnionego barwnikiem DiI, który został prawidłowo poddany fotokonwersji. Doskonale obrazuje to poziom szczegółowości, jaki oferują takie preparaty. Podczas obserwacji w optyce DIC widoczny staje się kontekst przestrzenny znakowanej komórki w obrębie nieznakowanej tkanki otaczającej, np. położenie ciała komórki w korze oraz projekcji włókien w neuropilu.

Dyskusja

Jedną z głównych zalet Drosophila jako systemu modelowego jest to, że umożliwia analizę rozwoju i funkcji na poziomie pojedynczych komórek. Jest to szczególnie pomocne w przypadku układu nerwowego, w którym różnorodność typów komórek jest wyjątkowo duża, a funkcja i morfologia sąsiednich komórek może być zupełnie inna.

Metoda, którą tutaj prezentujemy, pozwala na znakowanie pojedynczych neuronów barwnikiem, który może być albo przekształcony w trwałe barwnik, albo badany bezpośrednio ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ODCZNIKI
DAB	Sigma-Aldrich	D-5905	2-3 mg/ml w 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI	Invitrogen/Molecular Probes	D-282	1 mg/ml w etanolu
Formaldehyd	Merck Millipore		7,4 % w PBS
Glicerol	Roth	3783	70% w PBS
Klej heptanowy	Beiersdorf AG	Cello 31-39-30 *	rozcieńczyć ok. 1:1 n-Heptanem
PBS			1x
TRIS	Roth	4855
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
SPRZĘT
Mikroskop konfokalny	Leica	TCS SP2	do obserwacji i dokumentowania znakowań w fluorescencji
Wzmacniacz DC	Dragan Corporation	Cornerstone ION-100	do przeprowadzania znakowań
Kryszalki	Menzel	BB018018A1	18 x 18 mm
Kryszalki	Menzel	BB024060A1	24 x 60 mm
Mikroskop stereoskopowy	Leica	MZ8	do przygotowania i sekcji embrionów
Kapilary płaskie	Hilgenberg		średnica zewnętrzna 1 mm; grubość szkła 0.1 mm
Kapilary do iniekcji	Science Products	GB 100 TF 8P
Mikromanipulator R	Leica		do przeprowadzania znakowań
Model P-97	Sutter Instruments		do wyciągania kapilar
Szkiełka przedmiotowe	Marienfeld Superior	1000000
Mikroskop naukowy	Zeiss	Axioskop 2 mot	do obserwacji znakowań po fotokonwersji
Mikroskop naukowy	Olympus	BX50	do przeprowadzania znakowań
Kamera wideo Sony MC3255	Sony/AVT Horn	Sony MC3255	do rejestrowania znakowań po fotokonwersji
Tabela 1.