Tutaj opisujemy skuteczną metodę badania dynamiki apoptotycznego oczyszczania komórek in vivo. Metoda ta wykorzystuje żywe zarodki Drosophila jako potężny model do monitorowania fagocytozy komórek apoptotycznych przy użyciu specyficznego znakowania komórek apoptotycznych i fagocytów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Właściwa eliminacja niechcianych lub nieprawidłowych komórek poprzez apoptozę i późniejszą fagocytozę (apoptotyczne usuwanie komórek) jest kluczowa dla prawidłowego rozwoju we wszystkich organizmach metazoan. Apoptotyczny klirens komórek jest wysoce dynamicznym procesem ściśle związanym ze śmiercią komórki; Niepochłonięte komórki apoptotyczne są ledwo widoczne in vivo w normalnych warunkach. Aby zrozumieć różne etapy apoptotycznego usuwania komórek i porównać "profesjonalne" fagocyty - makrofagi i komórki dendrytyczne z "nieprofesjonalnymi" - sąsiadującymi komórkami rezydującymi w tkankach, niezwykle cenne jest obrazowanie tego procesu na żywo in vivo. Tutaj opisujemy protokół badania apoptotycznego klirensu komórek w żywych zarodkach Drosophila. Aby śledzić dynamikę różnych etapów fagocytozy, używamy specyficznych markerów dla komórek apoptotycznych i fagocytów. Ponadto możemy równolegle monitorować dwa systemy fagocytów: "profesjonalne" makrofagi i "półprofesjonalne" komórki glejowe w rozwijającym się ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Opisana tutaj metoda wykorzystuje zarodek Drosophila jako doskonały model do badań w czasie rzeczywistym nad apoptotycznym usuwaniem komórek.
Wprowadzenie
Właściwa eliminacja niechcianych lub nieprawidłowych komórek poprzez apoptozę i późniejszą fagocytozę jest kluczowa dla rozwoju embrionalnego, jak również dla homeostazy tkanek u osoby dorosłej. Fagocytoza komórek apoptotycznych lub apoptotyczny klirens komórek jest wysoce dynamicznym procesem, który przebiega w czterech etapach: (1) rekrutacja fagocytów do komórki apoptotycznej ("znajdź mnie"), (2) rozpoznanie komórki jako celu fagocytozy ("zjedz mnie") i (3) pochłonięcie, a następnie (4) dojrzewanie fagosomu i degradacja cząstki apoptotycznej1-5. Istnieją dwa typy fagocytów: "profesjonalne" makrofagi i niedojrzałe komórki dendrytyczne oraz "nieprofesjonalne" sąsiednie komórki rezydujące w tkankach, które mają kluczowe znaczenie dla apoptotycznego usuwania komórek podczas rozwoju metazoanu6,7 .
W rozwoju Drosophila, eliminacja zbędnych komórek poprzez apoptozę zachodzi w trzech głównych fazach, najpierw w połowie do późnej zarodka, następnie w środkowej poczwarce i ponownie we wczesnej dorosłej osobie. Podczas embriogenezy cząstki apoptotyczne są usuwane przez "profesjonalne" fagocyty, makrofagi oraz przez "nieprofesjonalną" ektodermę i glej8,9 .
W naszej poprzedniej pracy zidentyfikowaliśmy receptor fagocytarny, Six-microns-under (SIMU), który ulega ekspresji wyłącznie w komórkach fagocytarnych podczas embriogenezy. Korzystając z promotora simu, wygenerowaliśmy specyficzny marker dla populacji komórek fagocytarnych (simu-cytGFP), który umożliwia nam jednoczesne monitorowanie makrofagów, ektodermy i gleju w żywym, rozwijającym się zarodku8. Ponadto, stosując specyficzne markery dla komórek apoptotycznych w różnych stadiach apoptozy, jesteśmy w stanie śledzić dynamikę apoptotycznego klirensu komórek in vivo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Aby śledzić dynamikę apoptotycznego oczyszczania komórek in vivo, należy oznaczyć dwie populacje komórek: komórki fagocytarne i komórki apoptotyczne.
Aby oznaczyć populacje komórek fagocytarnych, używamy linii Drosophila zawierającej marker simu-cytGFP, który oznacza wyłącznie komórki fagocytarne w zarodku: makrofagi, glej i ektodermę8. Można użyć różnych markerów dla komórek fagocytarnych, w tym linii zawierających specyficzny dla hemocytów sterownik Gal4 (crq-Gal4) lub specyficzny dla gleju sterownik Gal4 (repo-Gal4) oraz genetycznie kodowany reporter fluorescencyjny pod kontrolą UAS (uas-GFP).
Aby monitorować komórki apoptotyczne podczas usuwania komórek apoptotycznych, używamy różnych markerów apoptozy/fagocytozy. Aneksyna V (sondy molekularne) służy jako wczesny marker komórek apoptotycznych 10; Phiphilux (OncoImmunin) jest fluorogennym substratem kaspazy-3, który jest używany jako marker późniejszej apoptozy, a LysoTracker (Molecular Probes) działa jako marker fagosomu. Odczynniki te wtryskujemy za pomocą systemu mikroiniekcji PicoPump PV 820.
1. Przygotowania
- Klej heptanowy:
Rozwiń taśmę dwustronną i włóż jak najwięcej do fiolki scyntylacyjnej, napełnij heptanem, zamknij fiolkę Parafilmem i kołysz przez 24 godziny. Dodaj heptan, jeśli klej jest zbyt gęsty. - Pozwalamy muchom leżeć na podgrzanej płytce agarowej z sokiem winogronowym + pasta drożdżowa przez 2 godziny, a następnie przenosimy szalkę do 25 °C na 10-12 godzin (w zależności od pożądanego etapu) przed mikroiniekcją i zapisami poklatkowymi wstrzykniętych zarodków. Pobieramy zarodki z płytek agarowych utrzymywanych w temperaturze 25 °C, uzyskując w ten sposób zarodki z 15 lub 16 etapu rozwoju.
- Przygotowanie igły:
Do przygotowania igieł do wstrzykiwań używamy ściągacza igieł "Sutter instrument" oraz cienkościennych włókien szklanych (rurki kapilarne FHC). Końcówka połączonej kapilary jest złamana do średnicy 0,5-2 μm. - Szkiełko nakrywkowe z klejem:
Za pomocą końcówki pipety rozprowadź kroplę kleju heptanowego w jednej linii na środku szkiełka nakrywkowego. Pozostaw do wyschnięcia na kilka sekund. Przygotuj kilka takich szkiełek nakrywkowych.
2. Przygotowanie zarodków
- Zbierz zarodki z płytek agarowych i przenieś je do sitka komórkowego (SPL Life Sciences) za pomocą czystego pędzla i bieżącej wody. Sitko jest trzymane nad zlewką w celu zebrania ścieków.
- Umyj zarodki w sitku do komórek wodą, aż cała pasta drożdżowa zostanie usunięta.
- Wysusz nadmiar wody, wycierając zewnętrzną część sitka za pomocą chusteczek Kimwipes.
- Umieść sitko do komórek na czystej szalce Petriego i dodaj tyle 50% wybielacza, aby pokryć zarodki w sitku do komórek. Dekorionację zarodków przez 2 minuty od czasu do czasu (2-3 razy) mieszając.
- Spłucz obficie wodą, aż zarodki stracą zapach wybielacza.
- Umieść sitko do komórek na czystej szalce Petriego i zalej zarodki wodą, aby zapobiec wysuszeniu.
- Przed rozpoczęciem zawiązywania zarodków należy załadować 1 μl pożądanego odczynnika do dwóch igieł (czasami igła może być zatkana). Potrzeba około 5 minut, aby płyn dotarł do końcówki igły.
- Wytnij prostokątny kawałek agaru z sokiem winogronowym i umieść go na szkiełku mikroskopowym. Przenieś zdekorionowane zarodki z płytki Petriego na kawałek agaru za pomocą czystego pędzla.
- Pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym wybrać odpowiednio zaawansowane zarodki wyrażające marker GFP za pomocą mokrego pędzla i umieścić każdy zarodek blisko krawędzi kawałka agaru w rzędzie jeden po drugim (ryc. 1A). Zarodki należy umieścić brzuszną stroną do góry w celu obrazowania fagocytozy za pomocą gleju w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN).
- Ustaw około 10 zarodków w jednym rzędzie.
- Przymocuj zarodki do szkiełka nakrywkowego pokrytego pośrodku paskiem kleju heptanowego (ryc. 1B, C).
- Umieść szkiełko nakrywkowe w komorze odwadniającej na około 5 minut (zależy to od wilgotności w pomieszczeniu i ilości do wstrzyknięcia).
- Po wyschnięciu przykryj zarodki olejem halocarbon 700 (Sigma), aby uniknąć dalszego odwodnienia.
- Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym zarodkami skierowanymi do góry. Możesz nalać kroplę wody na szkiełko, aby zapobiec przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego. Zarodki są teraz gotowe do wstrzyknięcia. Miejsce wstrzyknięcia znajduje się zazwyczaj po bocznej stronie w środku zarodka.
3. Wstrzyknięcie zarodka
- Przymocować igłę do mikromanipulatora.
- Aby złamać końcówkę igły, umieść krawędź szkiełka nakrywkowego w polu view i ustaw igłę w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Bardzo ostrożnie przesuwaj szkiełko nakrywkowe, aż dotknie końcówki igły i ją złamie.
- Skupiając się na zarodkach, umieść igłę w oleju i upewnij się, że z igły dostała się kropla płynu. Oznacza to, że końcówka igły została dobrze złamana.
- Nie dotykając uchwytu igły, wsunąć zarodek do igły i wstrzyknąć kroplę do zarodka. Odsuń zarodek i przejdź do następnego, aż wszystkie zarodki zostaną wstrzyknięte.
4. Obrazowanie
Obrazujemy zarodki na odwróconym mikroskopie konfokalnym z obiektywem 40X lub 100X. Szukamy ładnie ustawionego zarodka z OUN pośrodku, który wykazuje silną ekspresję GFP i dobre oznakowanie komórek apoptotycznych po wstrzyknięciu.
Do nagrań poklatkowych żywych zarodków zazwyczaj wybieramy 5 lub 6 plastrów konfokalnych (każdy o grubości 2 μm). Następnie wykonujemy rzut 3 plastrów (o grubości 6 μm) w celu obserwacji całych komórek.
Używamy markerów dla komórek apoptotycznych, które są stabilne i nie blakną łatwo. Aby uniknąć wybielania GFP, wykonujemy nagrania w odstępach 60 sek.
W niektórych przypadkach zarodki mogą zacząć się toczyć podczas nagrywania wideo. Dlatego raz na jakiś czas zaglądamy do nagrania, aby w razie potrzeby zatrzymać się i zacząć od nowa.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne klatki z filmu, na którym komórki apoptotyczne są znakowane Aneksyną V, a glej, ektoderma i makrofagi są znakowane simu-cytGFP, przedstawiono na Rysunku 2. Każda klatka jest projekcją 3 warstw o grubości 2 μm każda.
Zarodek w stadium 15 jest odpowiednio ustawiony, ukazując embrionalny OUN w środku z wyraźnie oznakowaną gleją (g). Makrofagi (m), znajdujące się głównie poza OUN, wykazują silną cytoplazmatyczną ekspresję GFP. Komórki ektodermalne są równi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Apoptotyczny klirens komórek jest krytycznym ostatnim etapem apoptozy, która jest bardzo dynamiczna. Dlatego badania procesu w czasie rzeczywistym mają ogromne znaczenie. W tym miejscu opisujemy protokół, który umożliwia monitorowanie apoptotycznego klirensu komórek u żywych, rozwijających się zarodków Drosophila . W tej procedurze dwie populacje komórek muszą być oznaczone za pomocą określonych markerów: komórek apoptotycznych i fagocytów. Reporter simu-cytGFP nadaje się do jednoczesnego monitorowania ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant reintegracyjny Marie Curie (IRG249084). Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Kurant. Dziękujemy również E. Suss-Toby'emu z Międzywydziałowego Ośrodka Bioobrazowania za doskonałe wsparcie techniczne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Odczynnik | |||
| Annexin V | Sondy molekularne | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| Sondy molekularne | LysoTracker | L-7528 | |
| Olej halowęglowy 700 | Sigma | H8898 | |
| < mocny>Materiał< / mocny> | |||
| rurka kapilarna | FHC | 30-30-0 | |
| Sitko do komórek | SPL | 93100 | |
| Pędzel |
Bibliografia
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
