Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila

Właściwa eliminacja niechcianych lub nieprawidłowych komórek poprzez apoptozę i późniejszą fagocytozę jest kluczowa dla rozwoju embrionalnego, jak również dla homeostazy tkanek u osoby dorosłej. Fagocytoza komórek apoptotycznych lub apoptotyczny klirens komórek jest wysoce dynamicznym procesem, który przebiega w czterech etapach: (1) rekrutacja fagocytów do komórki apoptotycznej ("znajdź mnie"), (2) rozpoznanie komórki jako celu fagocytozy ("zjedz mnie") i (3) pochłonięcie, a następnie (4) dojrzewanie fagosomu i degradacja cząstki apoptotycznej^1-5. Istnieją dwa typy fagocytów: "profesjonalne" makrofagi i niedojrzałe komórki dendrytyczne oraz "nieprofesjonalne" sąsiednie komórki rezydujące w tkankach, które mają kluczowe znaczenie dla apoptotycznego usuwania komórek podczas rozwoju metazoanu^6,7 .

W rozwoju Drosophila, eliminacja zbędnych komórek poprzez apoptozę zachodzi w trzech głównych fazach, najpierw w połowie do późnej zarodka, następnie w środkowej poczwarce i ponownie we wczesnej dorosłej osobie. Podczas embriogenezy cząstki apoptotyczne są usuwane przez "profesjonalne" fagocyty, makrofagi oraz przez "nieprofesjonalną" ektodermę i glej^8,9 .

W naszej poprzedniej pracy zidentyfikowaliśmy receptor fagocytarny, Six-microns-under (SIMU), który ulega ekspresji wyłącznie w komórkach fagocytarnych podczas embriogenezy. Korzystając z promotora simu, wygenerowaliśmy specyficzny marker dla populacji komórek fagocytarnych (simu-cytGFP), który umożliwia nam jednoczesne monitorowanie makrofagów, ektodermy i gleju w żywym, rozwijającym się zarodku⁸. Ponadto, stosując specyficzne markery dla komórek apoptotycznych w różnych stadiach apoptozy, jesteśmy w stanie śledzić dynamikę apoptotycznego klirensu komórek in vivo.

Aby śledzić dynamikę apoptotycznego oczyszczania komórek in vivo, należy oznaczyć dwie populacje komórek: komórki fagocytarne i komórki apoptotyczne.

Aby oznaczyć populacje komórek fagocytarnych, używamy linii Drosophila zawierającej marker simu-cytGFP, który oznacza wyłącznie komórki fagocytarne w zarodku: makrofagi, glej i ektodermę⁸. Można użyć różnych markerów dla komórek fagocytarnych, w tym linii zawierających specyficzny dla hemocytów sterownik Gal4 (crq-Gal4) lub specyficzny dla gleju sterownik Gal4 (repo-Gal4) oraz genetycznie kodowany reporter fluorescencyjny pod kontrolą UAS (uas-GFP).

Aby monitorować komórki apoptotyczne podczas usuwania komórek apoptotycznych, używamy różnych markerów apoptozy/fagocytozy. Aneksyna V (sondy molekularne) służy jako wczesny marker komórek apoptotycznych ¹⁰; Phiphilux (OncoImmunin) jest fluorogennym substratem kaspazy-3, który jest używany jako marker późniejszej apoptozy, a LysoTracker (Molecular Probes) działa jako marker fagosomu. Odczynniki te wtryskujemy za pomocą systemu mikroiniekcji PicoPump PV 820.

1. Przygotowania

1. Klej heptanowy:
   Rozwiń taśmę dwustronną i włóż jak najwięcej do fiolki scyntylacyjnej, napełnij heptanem, zamknij fiolkę Parafilmem i kołysz przez 24 godziny. Dodaj heptan, jeśli klej jest zbyt gęsty.
2. Pozwalamy muchom leżeć na podgrzanej płytce agarowej z sokiem winogronowym + pasta drożdżowa przez 2 godziny, a następnie przenosimy szalkę do 25 °C na 10-12 godzin (w zależności od pożądanego etapu) przed mikroiniekcją i zapisami poklatkowymi wstrzykniętych zarodków. Pobieramy zarodki z płytek agarowych utrzymywanych w temperaturze 25 °C, uzyskując w ten sposób zarodki z 15 lub 16 etapu rozwoju.
3. Przygotowanie igły:
   Do przygotowania igieł do wstrzykiwań używamy ściągacza igieł "Sutter instrument" oraz cienkościennych włókien szklanych (rurki kapilarne FHC). Końcówka połączonej kapilary jest złamana do średnicy 0,5-2 μm.
4. Szkiełko nakrywkowe z klejem:
   Za pomocą końcówki pipety rozprowadź kroplę kleju heptanowego w jednej linii na środku szkiełka nakrywkowego. Pozostaw do wyschnięcia na kilka sekund. Przygotuj kilka takich szkiełek nakrywkowych.

2. Przygotowanie zarodków

1. Zbierz zarodki z płytek agarowych i przenieś je do sitka komórkowego (SPL Life Sciences) za pomocą czystego pędzla i bieżącej wody. Sitko jest trzymane nad zlewką w celu zebrania ścieków.
2. Umyj zarodki w sitku do komórek wodą, aż cała pasta drożdżowa zostanie usunięta.
3. Wysusz nadmiar wody, wycierając zewnętrzną część sitka za pomocą chusteczek Kimwipes.
4. Umieść sitko do komórek na czystej szalce Petriego i dodaj tyle 50% wybielacza, aby pokryć zarodki w sitku do komórek. Dekorionację zarodków przez 2 minuty od czasu do czasu (2-3 razy) mieszając.
5. Spłucz obficie wodą, aż zarodki stracą zapach wybielacza.
6. Umieść sitko do komórek na czystej szalce Petriego i zalej zarodki wodą, aby zapobiec wysuszeniu.
7. Przed rozpoczęciem zawiązywania zarodków należy załadować 1 μl pożądanego odczynnika do dwóch igieł (czasami igła może być zatkana). Potrzeba około 5 minut, aby płyn dotarł do końcówki igły.
8. Wytnij prostokątny kawałek agaru z sokiem winogronowym i umieść go na szkiełku mikroskopowym. Przenieś zdekorionowane zarodki z płytki Petriego na kawałek agaru za pomocą czystego pędzla.
9. Pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym wybrać odpowiednio zaawansowane zarodki wyrażające marker GFP za pomocą mokrego pędzla i umieścić każdy zarodek blisko krawędzi kawałka agaru w rzędzie jeden po drugim (ryc. 1A). Zarodki należy umieścić brzuszną stroną do góry w celu obrazowania fagocytozy za pomocą gleju w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN).
10. Ustaw około 10 zarodków w jednym rzędzie.
11. Przymocuj zarodki do szkiełka nakrywkowego pokrytego pośrodku paskiem kleju heptanowego (ryc. 1B, C).
12. Umieść szkiełko nakrywkowe w komorze odwadniającej na około 5 minut (zależy to od wilgotności w pomieszczeniu i ilości do wstrzyknięcia).
13. Po wyschnięciu przykryj zarodki olejem halocarbon 700 (Sigma), aby uniknąć dalszego odwodnienia.
14. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym zarodkami skierowanymi do góry. Możesz nalać kroplę wody na szkiełko, aby zapobiec przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego. Zarodki są teraz gotowe do wstrzyknięcia. Miejsce wstrzyknięcia znajduje się zazwyczaj po bocznej stronie w środku zarodka.

3. Wstrzyknięcie zarodka

1. Przymocować igłę do mikromanipulatora.
2. Aby złamać końcówkę igły, umieść krawędź szkiełka nakrywkowego w polu view i ustaw igłę w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Bardzo ostrożnie przesuwaj szkiełko nakrywkowe, aż dotknie końcówki igły i ją złamie.
3. Skupiając się na zarodkach, umieść igłę w oleju i upewnij się, że z igły dostała się kropla płynu. Oznacza to, że końcówka igły została dobrze złamana.
4. Nie dotykając uchwytu igły, wsunąć zarodek do igły i wstrzyknąć kroplę do zarodka. Odsuń zarodek i przejdź do następnego, aż wszystkie zarodki zostaną wstrzyknięte.

4. Obrazowanie

Obrazujemy zarodki na odwróconym mikroskopie konfokalnym z obiektywem 40X lub 100X. Szukamy ładnie ustawionego zarodka z OUN pośrodku, który wykazuje silną ekspresję GFP i dobre oznakowanie komórek apoptotycznych po wstrzyknięciu.

Do nagrań poklatkowych żywych zarodków zazwyczaj wybieramy 5 lub 6 plastrów konfokalnych (każdy o grubości 2 μm). Następnie wykonujemy rzut 3 plastrów (o grubości 6 μm) w celu obserwacji całych komórek.

Używamy markerów dla komórek apoptotycznych, które są stabilne i nie blakną łatwo. Aby uniknąć wybielania GFP, wykonujemy nagrania w odstępach 60 sek.

W niektórych przypadkach zarodki mogą zacząć się toczyć podczas nagrywania wideo. Dlatego raz na jakiś czas zaglądamy do nagrania, aby w razie potrzeby zatrzymać się i zacząć od nowa.

Reprezentatywne klatki z filmu, w którym komórki apoptotyczne są oznaczone Aneksyną V, a glej, ektoderma i makrofagi są oznaczone simu-cytGFP, są pokazane na rysunku 2. Każda klatka to projekcja 3 warstw po 2 μm każdy.

Zarodek w stadium 15 jest prawidłowo ustawiony, pokazując embrionalny OUN pośrodku z dobrze oznaczonym glejem (g). Makrofagi (m), które w większości znajdują się poza OUN, wykazują silną cytoplazmatyczną ekspresję GFP. Komórki ektodermalne są również znakowane cytoplazmatycznym GFP (e). Wiele komórek aneksyny V dodatnich jest widocznych wewnątrz i na zewnątrz OUN. Śledzenie wydarzenia pochłonięcia nie jest łatwe. Podkreśliliśmy jedno zdarzenie białym prostokątem, w którym komórka glejowa pochłania cząstkę apoptozy. Zwróć uwagę na sondujące zachowanie komórki glejowej: dotknięcie cząstki apoptotycznej kilka razy bez jej pochłonięcia, a następnie zakończenie pochłonięciem komórki apoptotycznej oznaczonej Aneksyną V (ryc. 2).

Dodatkowe znaczniki dla różnych etapów apoptozy mogą być używane przy tej samej procedurze.

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie przygotowania zarodków do mikroiniekcji. ZA. Szkiełko mikroskopowe zawierające kawałek agaru, na który przenoszone są zarodki po dekorionacji. Około 20 zarodków umieszcza się w linii, blisko krawędzi kawałka agaru, brzuszną stroną do góry, w celu obrazowania OUN. Ur. Szkiełko nakrywkowe zawierające pasek kleju heptanowego pośrodku. C. Szkiełko nakrywkowe z B z zarodkami przymocowanymi do paska kleju heptanowego.

Rysunek 2. Dynamiczna analiza klirensu komórek apoptotycznych. Nagrania poklatkowe klirensu komórek apoptotycznych w zarodku w stadium 15. Glej (g), makrofagi (m) i ektoderma (e) są znakowane za pomocą simu-cytGFP (zielony). Komórki apoptotyczne są oznaczone fluorescencyjną aneksyną V (czerwoną). ZA. Wyświetlane są wybrane klatki z reprezentatywnego filmu. Komórka glejowa pochłaniająca komórkę apoptotyczną jest przedstawiona przez prostokąt. Ur. Zbliżenia na zaznaczony prostokąt.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.