Pomiar dotykowej allodynii w mysim modelu bakteryjnego zapalenia gruczołu krokowego

Podsumowanie

Infekcja prostaty może być czynnikiem przyczyniającym się do pośredniczenia w bólu miednicy w przewlekłym zapaleniu gruczołu krokowego. Opisujemy procedurę przygotowania standaryzowanego inokulum bakteryjnego, wkraplania bakterii do cewki moczowej samców myszy oraz metodologii pomiaru allodynii dotykowej u myszy w czasie.

Streszczenie

Uropatogenne Escherichia coli (UPEC) to patogeny, które odgrywają ważną rolę w infekcjach dróg moczowych i bakteryjnym zapaleniu gruczołu krokowego¹. Niedawno wykazaliśmy, że UPEC odgrywają ważną rolę w inicjacji przewlekłego bólu miednicy², który jest cechą przewlekłego zapalenia gruczołu krokowego/zespołu przewlekłego bólu miednicy (CP/CPPS)^3,4. Zakażenie gruczołu krokowego przez klinicznie istotny UPEC może zainicjować i wywołać przewlekły ból poprzez mechanizmy, które mogą wiązać się z uszkodzeniem tkanek i inicjacją mechanizmów autoimmunizacji⁵.

Wyzwaniem dla zrozumienia patogenezy UPEC w prostacie jest względna niedostępność gruczołu krokowego do manipulacji. Wykorzystaliśmy wcześniej opisaną metodę infekcji cewki moczowej⁶, aby dostarczyć kliniczny szczep UPEC do samców myszy, ustanawiając w ten sposób wstępującą infekcję prostaty. Tutaj opisujemy nasze protokoły standaryzacji inokulum bakteryjnego⁷, a także procedurę cewnikowania znieczulonych samców myszy w celu wkroplenia bakterii.

CP/CPPS charakteryzuje się przede wszystkim obecnością dotykowej allodynii⁴. Testy behawioralne opierały się na koncepcji przeczulicy skórnej wynikającej z bólu trzewnego^8-10. Drażliwe skupienie w tkankach trzewnych zmniejsza próg bólu skórnego, co pozwala na nadmierną reakcję na normalnie niebolesne bodźce (allodynia). Przyłożenie normalnej siły do skóry powoduje nieprawidłowe reakcje, które mają tendencję do zwiększania się wraz z intensywnością leżącego u podstaw bólu trzewnego. Opisujemy metodologię u myszy NOD / ShiLtJ, które wykorzystują włókna von Freya do ilościowego oznaczania allodynii dotykowej w czasie w odpowiedzi na pojedynczą infekcję bakteriami UPEC.

Protokół

1. Przygotowanie bakterii do inokulacji myszy

Następujące czynności muszą być wykonane w warunkach aseptycznych.

1. Weź jedną probówkę polipropylenową o wymiarach 17 x 100 mm z nakrętkami i dodaj 3 ml świeżego bulionu Luria (LB). Używając autoklawowanych końcówek, weź trochę zamrożonego zapasu glicerolu bakteryjnego szczepu CP1² i przenieś niewielką ilość kultury do probówki zawierającej pożywkę LB. Załóż nasadkę probówki, aby tlen nadal mógł dostać się do probówki - kultura musi rosnąć w warunkach tlenowych. Umieścić probówkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 220 obr./min na noc.
2. Następnego dnia przenieść 5 μl kultury przez noc do świeżej probówki z 3 ml pożywki LB i hodować w warunkach statycznych w inkubatorze przez noc w temperaturze 37 °C.
3. W dniu 3 przenieść 40 μl kultury do probówki o pojemności 50 ml zawierającej po 40 ml pożywki LB. Umieścić na noc w inkubatorze statycznym o temperaturze 37 °C.
4. Włączyć i ustawić wirówkę na 4 °C. Gdy wirówka osiągnie temperaturę końcową, przenieś każdą 40 ml kultury do probówki wirówkowej Nalgene o pojemności 40 ml.
5. Zważ probówki, aby zrównoważyć wirówkę - w razie potrzeby dostosuj objętość za pomocą pożywki LB. Wirować rurki z prędkością 6 000 obr./min przez 20 min.
6. Ostrożnie usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad bakteryjny w 40 ml sterylnego PBS.
7. Powtórz krok 1.5 z PBS.
8. Odessać supernatant i zawiesić bakterie w 500 μl sterylnego PBS. Przenieść roztwór do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Pobrać 10 μl zawiesiny i rozcieńczyć w 990 μl lodowatego PBS. Użyj spektrofotometru, aby odczytać OD_{420 nm}, aby określić objętość potrzebną do inokulacji. Aby określić odpowiednią objętość lodowatego PBS do zawieszenia osadu: Weź liczbę OD_{420 nm} (w ml) i odejmij szacowaną objętość osadu bakteryjnego [np. OD_{420 nm} = 0,545, osad około 0,075 ml. 0,545 - 0,075 = 0,470].
9. Usunąć 10 μl zawiesiny bakteryjnej i rozcieńczyć w 990 μl lodowatego PBS. Odczytać OD_{420 nm}. Celem jest osiągnięcie wartości OD_{420 nm} dla rozcieńczonej zawiesiny 1.000 ± .010. Jeśli liczba rozcieńczenia jest wyższa od tego celu, dodać więcej objętości do zawiesiny i wykonać kolejny odczyt. Jeśli liczba jest poniżej .990, odkręć zawieszenie i powtarzaj odczyt OD_{420 nm}, aż do uzyskania żądanego odczytu.

2. Zakażenie zwierząt

Myszy (5 do 7 tygodni, dziesięć na grupę) zostały zakupione w Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

1. Myszy są znieczulane przez wdychanie 1-4% izofluranu w komorze z pleksiglasu i monitorowane do momentu leżenia.
2. Jedna mysz na raz jest pobierana do wkraplania bakterii przez cewnikowanie cewnikiem polietylenowym (PE10) przymocowanym do zmodyfikowanej igły 30 G szklanej strzykawki Hamiltona (długość 1,5-2,0 cm). Cewnik wprowadza się do piasty igły. Mysz umieszcza się na jej grzbietowej powierzchni w znieczuleniu podtrzymywanym za pomocą stożka nosowego.
3. Penis myszy jest wytłaczany przez delikatny nacisk, a duże ilości lubrykantu na wacikach są używane do smarowania wejścia do cewki moczowej prącia.
4. 10 μl buforowanej fosforanem soli fizjologicznej zawierającej 1 x 10⁸ bakterii wprowadza się do cewki moczowej znieczulonych myszy po cewnikowaniu.
5. Myszy są utrzymywane w stanie znieczulonym przez 15 minut w komorze z pleksiglasu po wprowadzeniu bakterii, aby umożliwić przyczepienie się bakterii i zapobiec natychmiastowemu oddawaniu moczu.
6. Myszy są umieszczane z powrotem w klatkach i monitorowane przez następne 24 godziny.

3. Testowanie zachowania

Myszy były testowane przed zakażeniem (wartość wyjściowa) oraz w dniach 3, 7, 14, 21 i 28 po zakażeniu. Wspomniana hiperalgezja i allodynia dotykowa badano przy użyciu włókien von Freya nałożonych na brzuch^11,12 i okolicę podeszwową tylnej łapy¹³. Testy przeprowadzano o ustalonej porze dnia, stosowano standardową metodologię i stosowano testy na wszystkich zwierzętach przeprowadzane przez jednego eksperymentatora. Zaślepione testy grup wykorzystano do zwalczania ograniczeń testów bólu opartych na zachowaniu w modelach zwierzęcych. Pięć pojedynczych włókien von Freya o siłach 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 i 4,0 g (Stoelting, USA) przyłożono do brzucha i obliczono częstość reakcji odstawienia.

1. Po 30-minutowym okresie aklimatyzacji myszy umieszcza się w indywidualnych komorach z pleksiglasu (6 x 10 x 12 cm) wykonanych we własnym zakresie z podłogą z siatki ze stali nierdzewnej.
2. Hiperalgezja referowana i allodynia dotykowa zostały przetestowane przy użyciu pięciu włókien von Freya. Każde włókno przykładano przez 1-2 sekundy z odstępem między bodźcami wynoszącym 5 sekund, w sumie 10 razy, a włosy testowano w rosnącej kolejności siły.
3. Każde włókno jest nakładane na dolną część brzucha w ogólnym sąsiedztwie prostaty i dołożono starań, aby stymulować różne obszary w tym regionie, aby uniknąć efektu odczulania lub "nakręcania". Filamenty przykładano w rosnącej kolejności siły przez 1-2 sekundy z co najmniej 5-sekundowymi przerwami między stymulacjami, w sumie 10 razy.
4. Trzy rodzaje zachowań są uważane za pozytywną reakcję na stymulację włóknami: 1) ostre cofnięcie brzucha; 2) natychmiastowe lizanie lub drapanie obszaru stymulacji filamentu; 3) Skakanie.
5. Częstość odpowiedzi obliczono jako odsetek odpowiedzi pozytywnych (na 10, np. 5 odpowiedzi na 10 = 50%), a dane podano jako średni odsetek częstości odpowiedzi ± SE
6. Zwierzęta, u których uzyskano więcej niż 25 dodatnich całkowitych odpowiedzi wyjściowych, są wykluczone z badania.
7. Dotykowa allodynia została przetestowana na okolicy podeszwowej tylnej łapy przy użyciu włókien von Freya o siłach 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 i 4,0 g. Medianę progu wycofania wynoszącą 50% (5) oceniono przy użyciu metody góra-dół, w której badanie rozpoczęto od 0,04 g włókna nałożonego prostopadle do podeszwowej powierzchni tylnej łapy, aż włókno lekko się ugięło. Filamenty testowano w kolejności rosnącej, aż do momentu zaobserwowania pozytywnej odpowiedzi. Pozytywna reakcja na filament została zdefiniowana jako gwałtowne wycofanie łapy lub lizanie łapy testowej. Gdy zarejestrowano pozytywną odpowiedź, przykładano następny słabszy filament, a jeśli zaobserwowano negatywną odpowiedź, przykładano następny silniejszy filament.
8. Opisane eksperymenty i metodologia zostały zrecenzowane i zatwierdzone przez komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania na Uniwersytecie Northwestern.

Wyniki

Zbadaliśmy obecność przewlekłego bólu po infekcji bakteryjnej u samców myszy szczepów NOD/ShiLtj oraz C57BL/6J. Do cewki moczowej samców myszy (w wieku od 5 do 7 tygodni) wprowadzono sól fizjologiczną lub bakterie (Rycina 1). Stymulacja mechaniczna obszaru miednicy za pomocą filamentów von Frey u myszy C57BL/6J po podaniu soli fizjologicznej oraz u myszy C57BL/6J zainfekowanych UPEC skutkowała częstotliwością odpowiedzi, która nie uległa zmianie w ciągu 28-dniowego przebiegu eksperymentu (Rycina ...

Dyskusja

Zakażenie mysiej prostaty UPEC pozwala na modelowanie in vivo zdarzeń, które mogą być zaangażowane w patogenezę bakteryjnego zapalenia gruczołu krokowego, CP/CPPS lub jako zdarzenie predysponujące do przewlekłego stanu zapalnego. Opisane metody przygotowania i wkraplania bakterii opierają się na obszernej literaturze na temat modeli UPEC w zakażeniach dróg moczowych u kobiet^7,14. Model ten ma szerokie zastosowanie w badaniu patogenezy, testowaniu potencjalnych kandydatów na szczepionki i mechanizmach ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki	hodowlane BD Falcon	352059
LB Bulion Miller	EMD	EM1.10285.0500
Probówki wirówkowe Nalgene	Thermo	3118-0050
Izofluran	Butler Schein	NDC 11695-6776-1
Igła do cewnika 30G	Rurka Hamilton	91030
PE10	BD intramedic	427400
Von Frey	Filaments Stoelting	58025-31