Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Podsumowanie

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Streszczenie

Badania proteomiczne ujawniły imponującą złożoność proteomów eukariotycznych w niespotykanych dotąd szczegółach. Obecnie powszechnie przyjmuje się, że białka w komórkach w większości nie istnieją jako izolowane jednostki, ale wywierają swoją aktywność biologiczną w połączeniu z wieloma innymi białkami, u ludzi dziesięcioma lub więcej, tworząc linie montażowe w komórce dla większości, jeśli nie wszystkich funkcji życiowych. ^1,2 Wiedza na temat funkcji i architektury tych wielobiałkowych zespołów wymaga ich dostarczenia w najwyższej jakości i wystarczającej ilości do szczegółowej analizy. Niedostatek wielu kompleksów białkowych w komórkach, w szczególności u eukariontów, uniemożliwia ich ekstrakcję ze źródeł natywnych i wymaga produkcji rekombinowanej. System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) okazał się szczególnie przydatny do produkcji białek eukariotycznych, których aktywność często opiera się na przetwarzaniu potranslacyjnym, którego inne powszechnie stosowane systemy ekspresji często nie są w stanie obsłużyć. ³ BEVS wykorzystują rekombinowanego bakulowirusa, do którego wprowadzono interesujący nas gen w celu zainfekowania kultur komórek owadów, które z kolei wytwarzają wybrane białko. MultiBac to BEVS, który został specjalnie dostosowany do produkcji eukariotycznych kompleksów białkowych, które zawierają wiele podjednostek. ⁴ Istotnym warunkiem wstępnym wydajnej produkcji białek i ich kompleksów są solidne protokoły dla wszystkich etapów eksperymentu z ekspresją, które w idealnym przypadku mogą być wdrożone jako standardowe procedury operacyjne (SOP) i stosowane ze stosunkowo łatwością również przez użytkowników niebędących specjalistami. Platforma MultiBac w Europejskim Laboratorium Biologii Molekularnej (EMBL) wykorzystuje standardowe procedury operacyjne (SOP) na wszystkich etapach eksperymentu z ekspresją złożoną wielobiałkową, począwszy od wprowadzenia genów do zmodyfikowanego genomu bakulowirusa zoptymalizowanego pod kątem heterologicznych właściwości produkcji białek, a skończywszy na analizie na małą skalę wytworzonych próbek białek. ^5-8 Platforma została zainstalowana w trybie otwartego dostępu w EMBL Grenoble i pomogła wielu naukowcom ze środowisk akademickich i przemysłowych w przyspieszeniu projektów badawczych dotyczących kompleksów białkowych.

Wprowadzenie

Aktywność biologiczna jest kontrolowana przez zespoły białek i innych biomolekuł, które działają wspólnie, katalizując funkcje komórkowe. Godnymi uwagi przykładami są maszyneria, która transkrybuje dziedziczną informację zawartą w DNA na informacyjny RNA. U ludzi ponad 100 białek łączy się w zdefiniowanym i regulowanym procesie transkrypcji genów, tworząc duże kompleksy wielobiałkowe z 10 i więcej podjednostkami, w tym polimerazą RNA II i ogólnymi czynnikami transkrypcyjnymi, takimi jak TFIID, TFIIH i inne. ⁹ Innymi przykładami są rybosom, składający się z wielu białek i cząsteczek RNA, który katalizuje syntezę białek, lub kompleks porów jądrowych, który jest odpowiedzialny za przenoszenie biomolekuł przez otoczkę jądrową u eukariontów. Szczegółowa analiza architektoniczna i biochemiczna zasadniczo wszystkich wieloskładnikowych maszyn w komórce jest niezbędna do zrozumienia ich funkcji. Na przykład wyjaśnienie struktury rybosomów prokariotycznych i eukariotycznych stanowiło przełomowe wydarzenia dające bezprecedensowy wgląd w to, w jaki sposób te makromolekularne maszyny wykonują wyznaczone im funkcje w komórce. ^10,11

Rybosomy można uzyskać w wystarczającej jakości i ilości do szczegółowych badań poprzez oczyszczanie endogennego materiału z hodowanych komórek, ze względu na fakt, że do 30% masy komórkowej składa się z rybosomów. Polimeraza RNA II jest już mniej obfita o rzędy wielkości, a wiele tysięcy litrów kultur drożdży musiało zostać przetworzonych, aby uzyskać szczegółowy obraz atomowy tego niezbędnego kompleksu kluczowego dla transkrypcji. ¹² Przytłaczająca większość innych niezbędnych kompleksów jest jednak obecna w znacznie mniejszych ilościach w komórkach natywnych, a zatem nie może być odpowiednio oczyszczona z rodzimego materiału źródłowego. Udostępnienie takich kompleksów do szczegółowej analizy strukturalnej i funkcjonalnej wymaga produkcji heterologicznej przy użyciu technik rekombinowanych.

Produkcja białek rekombinowanych miała duży wpływ na badania w dziedzinie nauk przyrodniczych. Wiele białek wyprodukowano w sposób rekombinowany, a ich strukturę i funkcję przeanalizowano w wysokiej rozdzielczości. Programy genomiki strukturalnej wykorzystały wyjaśnienie genomów wielu organizmów do zajęcia się repertuarem produktów genowych całych organizmów w trybie wysokoprzepustowym (HT). W ten sposób określono tysiące struktur białkowych. Do tej pory najpowszechniej stosowanym systemem do produkcji rekombinowanych białek była E. coli, a na przestrzeni lat opracowano i udoskonalono wiele systemów ekspresji do produkcji heterologicznej w tym gospodarzu. Plazmidy kryjące w sobie mnóstwo funkcji umożliwiających produkcję białek u E. coli wypełniają całe katalogi komercyjnych dostawców.

Jednakże, E. coli ma pewne ograniczenia, które sprawiają, że nie nadaje się do produkcji wielu białek eukariotycznych, a w szczególności kompleksów białkowych z wieloma podjednostkami. Dlatego produkcja białka w gospodarzach eukariotycznych staje się w ostatnich latach coraz częściej wybieraną metodą. Szczególnie dobrze nadającym się systemem do produkcji białek eukariotycznych jest system wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS), który opiera się na rekombinowanym bakulowirusie przenoszącym heterologiczne geny w celu infekowania kultur komórek owadów hodowanych w laboratorium. System MultiBac jest niedawno opracowanym BEVS, który jest specjalnie dostosowany do produkcji eukariotycznych kompleksów białkowych z wieloma podjednostkami (ryc. 1). MultiBac został po raz pierwszy wprowadzony na rynek w 2004 roku. ¹³ Od momentu wprowadzenia na rynek, MultiBac jest stale udoskonalany i usprawniany w celu uproszczenia obsługi, poprawy jakości docelowego białka i ogólnego udostępnienia systemu użytkownikom niebędącym specjalistami poprzez opracowanie skutecznych standardowych procedur operacyjnych (SOP). ⁴ MultiBac został wdrożony w wielu laboratoriach na całym świecie, w środowisku akademickim i przemyśle. Na EMBL w Grenoble Komisja Europejska wdrożyła ponadnarodowe programy dostępu, aby zapewnić szkolenia eksperckie na platformie MultiBac dla naukowców, którzy chcieliby wykorzystać ten system produkcji do rozwoju swoich badań. Struktura i funkcja wielu kompleksów białkowych, które do tej pory były niedostępne, została wyjaśniona na podstawie próbek wytworzonych za pomocą MultiBac. ⁴ Poniżej podsumowano podstawowe etapy produkcji MultiBac w protokołach obowiązujących w zakładzie MultiBac w EMBL Grenoble.

Protokół

1. Rekombinacja tandemowa (TR) do tworzenia wielogenowych konstruktów ekspresji

1. Planowanie strategii współwyrażania. Podejście do projektowania wprowadzania interesujących Cię genów do dawców i akceptantów. Potencjalne fizjologiczne podmoduły Twojego kompleksu powinny być zgrupowane według konkretnych Akceptorów i Dawców. Użyj modułu mnożenia składającego się z par endonukleazy samonaprowadzającej (HE) - BstXI, aby połączyć kasety ekspresyjne na poszczególnych plazmidach donorowych i akceptorowych. ^7,8 Stwórz wszystkie istotne konstrukty in silico i dokładnie zweryfikuj strategię przed przystąpieniem do prac eksperymentalnych. Na przykład, geny będące przedmiotem zainteresowania powinny być sprawdzane, aby nie zawierały HE lub innych miejsc restrykcyjnych, a obecność prawidłowych otwartych ramek odczytu (ORF) powinna zostać zweryfikowana. Rozważ zamówienie syntetycznych genów zoptymalizowanych pod kątem wykorzystania kodonów w komórkach owadów i struktury drugorzędowej mRNA, aby poprawić poziom produkcji białek, a także usunąć wszelkie istniejące miejsca HE z genów będących przedmiotem zainteresowania. Rozważ umieszczenie znaczników oczyszczania w oparciu o dane z literatury na temat elastycznych lub odsłoniętych N- lub C-końców wybranych białek. Rozważ zastosowanie strategii polibiałkowych, które mają na celu wytworzenie kilku podjednostek białkowych w twoim kompleksie, jeśli względne ilości poszczególnych białek muszą być kontrolowane ze względu na problemy ze stechiometrią w kompleksie. ⁴ Przygotowanie szczegółowego dokumentu "Jak to zrobić" (zalecana jest elektroniczna książka laboratoryjna) zawierającego wszystkie przewidywane etapy eksperymentalne projektu prowadzące do kompletnego konstruktu wielogenowego. Twórz elektroniczne pliki plazmidów ze stopionymi plazmidami Cre-LoxP, na przykład za pomocą oprogramowania Cre-ACEMBLER, które można pobrać ze strony domowej grupy Berger (www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies/cre-acembler).
2. Wstaw interesujące Cię geny do wybranych dawców i akceptorów za pomocą enzymów restrykcyjnych i ligazy lub, alternatywnie, za pomocą metod niezależnych od ligacji, zgodnie z opublikowanymi protokołami. ^5,6,14 Jeśli masz dostęp do stanowiska pracy do obsługi cieczy i planujesz generowanie dużej liczby konstrukcji (na przykład dla podejść kombinatorycznych), rozważ użycie skryptów robotycznych opracowanych i wdrożonych przez grupę Berger (rysunek 2). ^14,15 Jeśli stanowisko pracy do pracy z cieczami nie jest dostępne, ręczna obsługa za pomocą płytek do mikromiareczkowania umożliwia wprowadzenie genu w sposób podobny do HT.
3. Ograniczenia wynikające z konieczności kontroli stechiometrii wyrażonych podjednostek mogą się zmaterializować. W przypadku niezrównoważonych stechiometrycznie poziomów ekspresji poszczególnych podjednostek kompleksu białkowego, należy rozważyć zastosowanie strategii polibiałkowych w celu połączenia kilku podjednostek kompleksu i określonej proteazy (na przykład proteazy NIa wirusa wytrawiania tytoniu) w pojedynczych dużych ORF oddalonych od siebie o określone miejsca proteolityczne. ^4,8 Rozważ jednoczesną ekspresję jednego lub kilku poliprotein z kasetami o pojedynczej ekspresji, jeśli masz bardzo duży kompleks z wieloma podjednostkami i szeroko rozgałęzionymi masami cząsteczkowymi poszczególnych podjednostek. Rozważ jednoczesną ekspresję kilku genów kodujących to samo białko w poliproteinie lub jako kilka identycznych kaset ekspresji, jeśli białko to charakteryzuje się niską wydajnością produkcji. ^{Kategoria 4,13}
4. Zweryfikuj wszystkie konstrukcje dawcy i akceptora sklonowane przez mapowanie ograniczeń (opcjonalnie w wysokiej przepływności) i sekwencjonowanie. Przystąp do fuzji kombinacji dawca-akceptor za pomocą rekombinacji Cre-LoxP w celu wygenerowania wybranych konstruktów ekspresji wielogenowej. Walidacja oczyszczonych plazmidów fuzyjnych akceptor-dawca poprzez mapowanie restrykcji, użycie sekwencji elektronicznych utworzonych przez Cre-ACEMBLER lub podobne programy jako odniesienie.
5. Oczyszczone i zwalidowane fuzje Dawcy, Akceptory i Dawca-Akceptor przechowuj w temperaturze -20 °C lub -80 °C. Starannie archiwizuj plazmidy i ich sekwencje (Microsoft Excel, Filemaker, inne) do późniejszego wykorzystania.

2. Generowanie, amplifikacja i przechowywanie złożonego wielogenowego bakulowirusa

1. Zintegruj wielogenowe wektory transferowe genomu bakulowirusa MultiBac poprzez przekształcenie w komórki DH10 zawierające genom wirusa i funkcje wymagane do transpozycji Tn7. Należy zauważyć, że genom bakulowirusa Multibac może być wstępnie załadowany określonymi genami będącymi przedmiotem zainteresowania (marker YFP, białka opiekuńcze itp.) we własnym miejscu LoxP (zmodyfikowanym w genomie dystalnie do miejsca przyłączenia Tn7) przez reakcję Cre in vivo poprzedzającą integrację Tn7. ¹³ Po transpozycji Tn7 komórki ze złożonym bakulowirusem zawierającym interesujące geny są selekcjonowane przez niebiesko-białe badanie przesiewowe (udana transpozycja Tn7 powoduje utratę α-komplementacji β-galaktozydazy; dlatego kolonie z prawidłową transpozycją Tn7 pozostają białe na selektywnych płytkach agarowych zawierających X-gal), a genom jest przygotowywany przez lizę alkaliczną i wytrącanie etanolu/izopropanolu. ^5,6
TGL
2. Transfekcja i początkowa produkcja wirusa. Umieścić 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej w sterylnym kapturze. Z hodowli komórek owadów Sf21 w fazie logarytmicznej wysadzić podwielokrotności komórek w studzienkach i dokonać transfekcji, dodając oczyszczony genom bakulowirusa i odczynnik do transfekcji zmieszany z pożywką hodowlaną, jak opisano. ⁶ Pobrać początkowego wirusa po 48-60 godzinach, usuwając pożywkę (wirus V₀ o niskiej jakości, zwykle 3 ml na studzienkę). Uzupełnij świeżą pożywkę i przetestuj produkcję białka (i, jeśli obecny jest marker YFP, fluorescencję) po dodatkowych 2-3 dniach. ^6,7
3. Amplifikacja wirusa, niski schemat MOI. Użyj wirusa V₀, aby zainfekować 25-50 ml komórek w fazie logarytmicznej (gęstość komórek <1x10⁶ komórek na ml) w małych (100-250 ml) kolbach Erlenmeyera mieszanych na wytrząsarkach platformy orbitalnej (ryc. 3). Policz komórki i dziel je co 24 godziny, aż komórki przestaną się podwajać (zatrzymanie proliferacji). Postępuj zgodnie ze schematem niskiego MOI (mnogość infekcji, tj. liczba cząstek wirusa na komórkę): Komórki muszą podwoić się (co najmniej) raz (MOI < 1), w przeciwnym razie powtórz eksperyment z dodaną mniejszą objętością V₀. Zwykle 3 ml V₀ są używane do zakażenia 25 ml komórek owadów Sf21 o gęstości 0,5x10⁶ komórek / ml. Jest to niezbędne, aby zapobiec szkodliwej nadmiernej amplifikacji i autodelecji wirusa, które mogą skutkować utratą interesujących nas heterologicznych genów. Zebrać wirusa V₁ (25-50 ml) po 48-60 godzinach, osadzając komórki i usuwając pożywkę zawierającą wirusa. Uzupełnij świeżą pożywką i przetestuj YFP i produkcję białka, usuwając^{1x10 6} komórek co 12 lub 24 godziny, granulując i walidując produkcję białka i sygnał białka markerowego (YFP). ⁶, Amplifikować wirusa (do V₂) dalej, jeśli dąży się do większych objętości ekspresji poprzez zakażenie do 400 ml komórek w 2 litrowych kolbach wytrząsarskich wirusem V₁ przestrzegającym powyższego schematu niskiego MOI (komórki muszą podwoić się co najmniej raz po zakażeniu V₁). Rygorystycznie testuj produkcję białek i sygnał białka markerowego podczas amplifikacji, aby uniknąć akumulacji wadliwych wirusów, które nie zawierają już interesujących Cię genów. ^5-7 Użyj osadów komórkowych gromadzących się na każdym etapie amplifikacji już w celu ustalenia protokołów oczyszczania dla eksprymowanego kompleksu białkowego będącego przedmiotem zainteresowania.
4. Przechowywanie wirusa produkcyjnego BIIC. Zdecydowanie zalecamy przechowywanie wirusa V₂ jako wirusa produkcyjnego przy użyciu metody BIIC (Baculovirus-i nfected insect cells), aby zapobiec modyfikacjom (np. utracie interesującego genu) rekombinowanego wirusa i zachować wysokie poziomy ekspresji. ¹⁶ Komórki zakażone osadkami obserwuje się 24 godziny po zatrzymaniu proliferacji - na tym etapie komórki zawierają kompletne cząsteczki wirusa tuż przed ich uwolnieniem (przez pączkowanie) do pożywki. Usunąć pożywkę i zamrozić porcje osadu komórkowego w ciekłym azocie i przechowywać przez czas nieokreślony. ^7,16

3. Produkcja i przetwórstwo białek

1. Infekowanie dużych kultur i monitorowanie YFP. Użyć podwielokrotności V₁, V₂ lub zamrożonych BIIC do infekowania większych kultur komórkowych w seriach produkcyjnych (zwykle 400 ml w kolbach o pojemności 2 l). Przestrzegaj schematu niskiego MOI (dostosuj objętość wirusa używaną do infekcji tak, aby zakażona hodowla podwoiła się co najmniej raz). W razie potrzeby powiększyć objętości zainfekowanych kultur, mnożąc liczbę kolb. Jeśli obecne jest białko markerowe YFP, należy wycofać w określonych odstępach czasu⁶ komórek, osadów i komórek lizujących oraz monitorować ewolucję sygnału YFP, aż do osiągnięcia plateau wskazującego na maksymalną produkcję białka rekombinowanego. Poziomy YFP można mierzyć w standardowym 96-dołkowym czytniku płytek zdolnym do rejestrowania sygnałów fluorescencyjnych (np. Tecan SPECTRAFluor). Na tym etapie zbierz komórki. Przechowuj granulki komórkowe w temperaturze -20 °C (krótkoterminowo) lub -80 °C (długoterminowo).
2. Liza i frakcjonowanie komórek. Lizuj komórki ulubioną metodą z wyboru, dostosowaną do wymagań Twojego białka (zamrażanie-rozmrażanie, sonikacja, French Press, inne). ^5-7 Frakcjonuj cytozol i jądra i przetestuj obecność interesujących Cię białek. Opracuj protokoły oczyszczania w oparciu o wyniki, aby uprościć oczyszczanie białek. Rozważ zastosowanie procedur namaczania w celu ekstrakcji białka z frakcji jądrowej w warunkach wysokiego KCl, jeśli białka znajdują się w jądrze. ^7,18
3. Oczyszczanie białek (mikroskala, duża skala). Należy pamiętać, że często małe objętości (10 lub 25 ml) hodowli komórkowej są wystarczające do uzyskania granulek komórkowych do oczyszczania znacznych ilości interesujących Cię białek ze względu na zazwyczaj wysoki lub bardzo wysoki poziom produkcji białek heterologicznych w systemach komórkowych bakulowirusa / owadów (często 10-100 mg białka na kulturę L i więcej). W połączeniu z mikrooczyszczaniem (płytki wielodołkowe, metody mikrokońcówek, system GE Healthcare ÄKTAmicro, inne) możliwe jest uzyskanie danych biochemicznych i aktywnych, a często także wystarczającej ilości pożądanych białek i kompleksów do wysokoprzepustowej krystalizacji w skali nanolitrów (HTX). Rozważ użycie oczyszczania powinowactwa do metali (Clonetech Takara TALON, żywice chelatatorowe metali Qiagen NiNTA) i znacznika oligo-histydyny (6-10 reszt) na odsłoniętych podjednostkach kompleksu białkowego, aby ułatwić oczyszczanie, w połączeniu z chromatografią wymiany jonowej i wykluczania wielkości w małych objętościach, na przykład przy użyciu ÄKTAmicro lub podobnej maszyny do oczyszczania o małej objętości (Rysunek 4). Inne etapy oczyszczania powinowactwa i etapy wymiany jonowej (IEX) oprócz oczyszczania powinowactwa za pomocą znaczników oligohistydyny lub innych znaczników (do wyboru GST, MBP, CBP, inne) mogą i powinny być brane pod uwagę, zgodnie z właściwościami biochemicznymi interesujących białek i indywidualnymi preferencjami. Rozważ oznaczenie więcej niż jednej podjednostki znacznikami powinowactwa, aby zwiększyć wydajność oczyszczania. Skoncentruj oczyszczone kompleksy białkowe i ustal protokoły przechowywania, takie jak zamrażanie z glicerolem lub bez. Opracuj kryteria kontroli jakości, które mogą być stosowane standardowo (testy aktywności, testy biochemiczne i biofizyczne) w celu oceny zmienności oczyszczonych białek między partiami.

Wyniki

Silna koekspresja białek heterologicznych osiągnięta przez system MultiBac jest pokazana na rysunku 1d (sondy pobrane 48 godzin po zakażeniu hodowli komórek zawiesinowych). Nadekspresja prążków białkowych jest wyraźnie widoczna w ekstrakcie z całej komórki (SNP) i oczyszczonym lizacie (SN). Jakość i ilość wytworzonego materiału białkowego jest często wystarczająca, aby umożliwić określenie struktury kompleksów białkowych, takich jak mitotyczny kompleks punktów kontrolnych MCC pokazany na rysunku ...

Dyskusja

Zrzuty wideo na rysunkach 2 i 3 ilustrują cały proces, od wspomaganego przez robota generowania z cDNA wielogenowych konstruktów ekspresyjnych, aż po infekcję kultur komórek owadów w celu produkcji białka. Opracowano nowe odczynniki (plazmidy i wirusy) oraz solidne protokoły, aby umożliwić proces oparty na standardowych procedurach operacyjnych. Cały rurociąg został wdrożony jako technologia platformowa w EMBL w Grenoble. Z platformy MultiBac korzysta wielu naukowców ze środowisk akademi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bluo-Gal	Invitrogen	15519-028 (1 g)
Tetracyklina	Euromedex	UT2965-B (25 g)	1,000X przy 10 mg/ml
Kanamycine	Euromedex	EU0420 (25 g)	1,000X przy 50 mg/ml
Gentamycine	SIGMA	G3632 (5 g)	1,000X przy 10 mg/ml
IPTG	Euromedex	EU0008-B (5 g)	1,000X przy 1M
Cre-rekombinaza	New England BioLabs	M0298
Odczynnik do transfekcji X-Treme GENE HP	Roche	06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect	Thermo Scientific	SH 30913.02
Płytka 6-dołkowa Falcon	Dominique Dutscher	353046
Pipeta 2 ml Falcon	Dominique Dutscher	357507
5 ml pipeta Falcon	Dominique Dutscher	357543
Pipeta 10 ml Falcon	Dominique Dutscher	357551
Pipeta 25 ml Falcon	Dominique Dutscher	357535
Rurka 50 ml Falcon	Dominique Dutscher	357550
Tubka 50 ml Falcon	Dominique Dutscher	352070
Tubka 15 ml Falcon	Dominique Dutscher
1,8 ml krioprobówka Nunc	Dominique Dutscher	55005
Kolby do wytrząsania 100 ml Pyrex	Dominique Dutscher	211917
Kolby do wytrząsania 250 ml Pyrex	Dominique Dutscher	211918
Kolby do wytrząsania 500 ml Pyrex	Dominique Dutscher	211919
2 L Termosy Pyrex	Dominique Dutscher
Wytrząsarka orbitalna Certomat + plateau	Sartorius	4445110, 4445233
Zbiornik ciekłego azotu dewar 35 L	Fisher Scientific	M76801
Szafa bezpieczeństwa biologicznego Szybszy	Sodipro	FASV20000606
	Zeiss	451207
Sf21 Komórki
owadówHi5 Komórki przeciw owadom	Invitrogen	B855-02
Tecan freedom EVO z uruchomieniem Evoware plus	TECAN
10 μ l końcówki przewodzące (czarne),	TECAN	10 612 516
200 i mu; l końcówki przewodzące (czarne)	TECAN	10 612 510
jednorazowa rynna na odczynniki, 100 ml	TECAN	10 613 049
twin.tec PCR płytka 96, z osłoną	Eppendorf	0030 128.648
96 dołkowa V dno, niesterylna	płytka głębinowa BD falcon	353263
96 kolor naturalny, PP)	Mikropłytka Fisher	M3752M
PS, 96 studnia z płaskim dnem	Greiner	655101
96 płyta głębinowa	Thermo scientific	AB-0932
bloki 24-dołkowe RB	Qiagen	19583
Enzym restrykcyjny DpnI	NEB	R0176L	20 U/uL
NEBuffer 4 10X	NEB	B7004S
2X phusion mastermix HF	Finnzyme	ref F-531L
2X phusion mastermix GC	Finnzyme	ref F-532L
DGLB 1.5X	domowej roboty		7,5% glicerol, 0,031% błękit bromofenolowy, 0,031% xylen cyjanol FF
Drabinka o wysokiej masie DNA do e-żelu	Life Technologies	10496-016
Drabinka o niskiej masie DNA do e-żelu	Life Technologies	10068-013
E-żel 48 1% agaroza GP	Life Technologies	G8008-01
Zestaw plazmidów Nucleo Spin-robot-96	Macherey Nagel	740 708.24
Zestaw do czyszczenia PCR, Ekstrakt z robota Nucleospin-96	Macherey Nagel	740 707.2
Gotaq green master mix	Promega	M7113
T4 polimeraza DNA, z kwalifikacją LIC	Novagen	70099-3
DTT 100 mM	domowej roboty
Mocznik 2 M	domowej roboty
EDTA 500 mM pH 8,0	Domowy
bulion LB (Miller) 500 g	Athena ES	103