Hybrydyzacja RNA in situ w całych zarodkach Mount i histologia komórek dostosowana do morskich spodoustych

Nicole A. Theodosiou

doi:10.3791/50165

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hybrydyzacja RNA in situ w całych zarodkach Mount i histologia komórek dostosowana do morskich spodoustych

12.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50165

⸱

12 kwietnia 2013

Nicole A. Theodosiou¹

¹Department of Biological Sciences, Union College

W tym artykule

Podsumowanie

Łącząc metody hybrydyzacji in situ i histologii całego RNA, ekspresja genów może być powiązana z decyzjami dotyczącymi losu komórki w rozwijającym się zarodku. Metody te zostały dostosowane do morskich zwierząt spodoustych i ułatwiają wykorzystanie tych zwierząt jako organizmów modelowych do badań biomedycznych, toksykologicznych i porównawczych.

Streszczenie

Morskie spodouste są cenionymi modelami zwierzęcymi do badań biomedycznych i genomicznych, ponieważ są najbardziej prymitywnymi kręgowcami posiadającymi odporność adaptacyjną i unikalne mechanizmy osmoregulacji ^1-3. Jako najbardziej prymitywne żyjące kręgowce szczękowe z parzystymi wyrostkami, spodouste są ewolucyjnie ważnym modelem, szczególnie dla badań nad ewolucją i rozwojem. Morskie spodouste zostały również wykorzystane do badania toksykologii wodnej i fizjologii stresu w odniesieniu do zmian klimatycznych ⁴. W związku z tym konieczne jest opracowanie i dostosowanie metodologii, aby ułatwić i rozszerzyć wykorzystanie tych prymitywnych kręgowców na wiele dyscyplin biologicznych. W tym miejscu przedstawiam udaną adaptację hybrydyzacji RNA w całości i technik histologicznych do badania ekspresji genów i histologii komórek u spodoustych.

Monitorowanie ekspresji genów jest charakterystycznym narzędziem biologów rozwojowych i jest szeroko stosowane do badania procesów rozwojowych ⁵. Hybrydyzacja in situ RNA w całości pozwala na wizualizację i lokalizację określonych transkryptów genów w tkankach rozwijającego się zarodka. Wzorzec ekspresji wiadomości genu może dostarczyć informacji o tym, jakie procesy rozwojowe i decyzje dotyczące losu komórki gen może kontrolować. Porównując wzorzec ekspresji genu na różnych etapach rozwoju, można uzyskać wgląd w to, jak zmienia się rola genu podczas rozwoju.

Podczas gdy całe montowanie in situ umożliwia lokalizację ekspresji genów w tkance, techniki histologiczne pozwalają na identyfikację zróżnicowanych typów komórek i tkanek. Barwienia histologiczne pełnią różne funkcje. Barwienia ogólne służą do podkreślenia morfologii komórek, na przykład hematoksylina i eozyna do ogólnego barwienia jąder i cytoplazmy, odpowiednio. Inne plamy mogą uwydatniać określone typy komórek. Na przykład niebieska plama alciańska opisana w tym artykule jest szeroko stosowanym barwnikiem kationowym do identyfikacji mukozacharydów. Barwienie przewodu pokarmowego błękitem alcyjnym może zidentyfikować rozmieszczenie komórek kubkowych, które wytwarzają mukozacharydy. Różnice w składnikach mukosacharydów na krótkich peptydach rozróżniają komórki kubkowe według funkcji w przewodzie pokarmowym ⁶. Stosując jednocześnie metody RNA in situ i metody histochemiczne, decyzje dotyczące losu komórki można powiązać z ekspresją specyficzną dla genu.

Chociaż RNA in situ i histochemia są szeroko stosowane przez badaczy, ich adaptacja i zastosowanie u morskich spodoustych spotkało się z ograniczonym i zróżnicowanym sukcesem. Prezentuję tu protokoły opracowane dla zwierząt spodoustych i stosowane na co dzień w moim laboratorium. Chociaż dalsza modyfikacja metody hybrydyzacji RNA in situ może być konieczna w celu przystosowania się do różnych gatunków, opisane tutaj protokoły stanowią silny punkt wyjścia dla badaczy, którzy chcą dostosować wykorzystanie morskich spodoustych do swoich badań naukowych.

Protokół

I. RNA Cała góra Hybrydyzacja In situ u morskich spodoustych

1. Utrwalanie i przygotowanie zarodka

Zarodki łyżwiarzy mogą być inscenizowane zgodnie z Ballardem ⁷. Optymalne etapy wykrywania ekspresji genów zależą od tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Aby śledzić ekspresję genów w przewodzie pokarmowym łyżwy, etapy 27-30 są optymalne ⁷.
Rozbioruj zarodki na PBS, oddzielając zarodki od woreczka żółtkowego.
Umieścić 30 ml świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu (PFA) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc. Poprawka na 24 godziny.
Umyj zarodki w PBT, dwa razy przez 15 minut, obracając w temperaturze pokojowej. Uwzględniono wszystkie receptury roztworów dla RNA w całości montowanych in situ (Tabela 1).
Odwodnić zarodki, myjąc je w serii metanolu 25%, 50% i 75% metanolu: PBT kołysząc w temperaturze pokojowej. Czas trwania płukania zależy od stadium rozwoju zarodków. W przypadku zarodków w stadium pre-neurulacji wystarczy 5 minut każdego przemycia w serii metanolu. W przypadku zarodków starszych niż 30 stadium płukanie może trwać do 30 minut. Aby ustalić, czy zarodki są wystarczająco penetrowane i aklimatyzują się do każdego prania, trzymaj rurkę pionowo w dłoni. Jeśli zarodki opadną na dno tuby, jesteś gotowy do następnego prania. Jeśli zarodki unoszą się na wierzchu roztworu, zmień roztwór i powtórz ten konkretny etap odwodnienia.
Prać dwukrotnie w 100% metanolu przez 10 minut delikatnie kołysząc.
Po odwodnieniu do 100% metanolu zarodki powinny być przechowywane w temperaturze -20 °C przez co najmniej 24 godziny przed przystąpieniem do stosowania protokołu. Zarodki były z powodzeniem przechowywane w temperaturze -20 °C i wykorzystywane do tworzenia całych wierzchowców RNA przez okres do 1 roku.

2. Synteza sondy RNA

Wygeneruj liniowy fragment genu, którego ekspresję chcesz wykryć. Można to zrobić przez amplifikację PCR lub linearyzację plazmidu z interesującym Cię genem. Aby amplifikować metodą PCR, wybierz startery, których miejsca wiązania flankują wstawkę genu i zachowują miejsca wiązania polimerazy RNA w amplifikowanym regionie. W przypadku powszechnie stosowanych plazmidów, takich jak pBS lub pGEM, idealne są startery M15 do przodu i do tyłu. Alternatywnie, linearyzuj plazmid, trawiąc 15 μl DNA QIAGEN miniprep za pomocą enzymu, który rozszczepia się na końcu 5' genu. Ekstrakt żelowy i oczyszczanie za pomocą odpowiedniego zestawu QIAquick.
Odwrotną transkrypcję sondy RNA przy użyciu 8 μl liniowego plazmidu lub 100 ng produktu PCR jako matrycy przy użyciu odpowiedniej polimerazy RNA (patrz Tabela 2 dla reakcji transkrypcyjnej).
Inkubować reakcję odwrotnej transkrypcji przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
Aby potwierdzić reakcję, uruchom 1 μl reakcji transkrypcji na 1% żelu agaroza/TAE. Uruchom żel pod napięciem 100 mV, aż barwnik po prostu wpłynie do żelu. Powinien być widoczny pojedynczy wyraźny pasek. Liniowy fragment matrycy DNA może być słabo widoczny przy większej masie cząsteczkowej.
Dodać 1 μl bezkrwistego DNAzy I do reakcji transkrypcji i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
Aby się wytrącić, dodać 100 μl TE pH 8, 10 μl 4 M LiCl, 300 μl 100% EtOH i inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 60 minut lub przez noc.
Wirować przez 10 minut w mikrofugach o temperaturze 4 °C przy 14 000 obr./min.
Umyj granulat 70% EtOH i wysusz na powietrzu.
Zawiesić sondę RNA w 20 μl dH₂O. Dodać 80 μl buforu hybrydyzacyjnego (bufor hybrydyzacyjny należy wstępnie ogrzać do 70 °C). Sonda może być przechowywana w 80% buforze hybrydyzacyjnym przez kilka miesięcy w temperaturze -20 °C lub dłużej w temperaturze -80 °C.

3. Wstępne leczenie zarodków i hybrydyzacja

Usunąć zarodki przechowywane w 100% metanolu z temperatury -20 °C. W przypadku młodszych zarodków należy postępować zgodnie z krokiem (3.2). W przypadku zarodków w późniejszym stadium rozwoju (stadium 29/30 <) może pojawić się warstwa naskórka, która "oderwała się" od ciała zarodka. Pod mikroskopem ostrożnie wypreparuj warstwę naskórka, aby zmaksymalizować penetrację sondy.
Umieść zarodki w czystych szklanych fiolkach scyntylacyjnych. Ponownie nawodnić zarodki w odwróconej serii metanolu opisanej powyżej: (75%, 50%, 25% metanolu:PBT), delikatnie kołysząc każdy roztwór przez 5-30 minut w temperaturze pokojowej. Pełne nawodnienie dzięki dwóm myciom PBT po 10 minut każde, delikatnie kołysząc.
Aby usunąć pigment, wybielaj zarodki 6% nadtlenkiem wodoru w PBT przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, kołysząc.
Usunąć nadtlenek wodoru przez trzykrotne przemycie w PBT (kołysanie w temperaturze pokojowej, 10 minut każde).
Traktuj zarodki proteinazą K, aby umożliwić penetrację sondy podczas hybrydyzacji. Ilość proteinazy K i czas trwania leczenia zależy od tkanki, którą chcesz zbadać oraz wieku zarodka. Bardziej powierzchowne tkanki i młodsze zarodki wymagają krótszej i mniejszej ilości proteinazy K, podczas gdy głębsze tkanki i starsze zarodki wymagają wyższego stężenia i dłuższego czasu leczenia, aby w pełni przeniknąć zarodek do hybrydyzacji sondowej. Na przykład, aby wykryć Shh w endodermie jelitowej zarodków łyżwiarzy w stadium 29, 30 μg/ml proteinazy K/PBT inkubuje się przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
Szybko wypłucz zarodki w PBT, aby zmyć proteinazę K.
Aby dezaktywować proteinazę K, należy postfix zarodków z 4% PFA, 0,2% aldehydem glutarowym w PBT przez 20 minut, delikatnie kołysząc.
Umyć dwa razy przez 10 minut z PBT.
1. W celu wstępnej hybrydyzacji dodaj do zarodków 2-3 ml podgrzanego roztworu hybrydyzacyjnego, tylko tyle, aby je przykryć. Delikatnie rozdrabniać w podgrzewanej łaźni wodnej w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę.
2. Aby przygotować roztwór hybrydyzacyjny, podgrzej sondę RNA do 70 °C przez 10 minut i ostudź na lodzie. Rozcieńczyć 15-20 μl sondy RNA do 2 ml świeżo podgrzanego roztworu hybrydyzacyjnego, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5-1,0 μg/ml. Usuń pre-hybe i dodaj rozcieńczoną sondę RNA do zarodków. Zarodki należy po prostu przykryć roztworem, w razie potrzeby dodać więcej roztworu do hybrydyzacji. Szczelnie zabezpieczyć pokrywkę fiolki scyntylacyjnej. Hybrydyzuj przez delikatne kołysanie w podgrzewanej łaźni wodnej w temperaturze 70 °C przez noc.

4. Mycie po hybrydyzacji i hybrydyzacja przeciwciał

Usunąć roztwór hybrydyzacyjny za pomocą sondy z zarodków i umieścić w świeżej fiolce scyntylacyjnej lub probówce Eppendorfa. Sonda może być przechowywana w temperaturze -20 °C i ponownie wykorzystana w przyszłości. W celu przepłukania po hybrydyzacji umieść zarodki w Netwell osadzonym na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
Prać 3 razy po 30 minut w podgrzanym roztworze #1, kołysząc w temperaturze 70 °C.
Umyć 3 razy po 30 minut w podgrzanym roztworze #2, kołysząc w temperaturze 70 °C.
Prać 3 razy po 5 minut w TBST, kołysząc w temperaturze pokojowej.
Wstępnie zablokuj 10% inaktywowaną termicznie surowicą owczą w TBST przez 1 godzinę, kołysząc w temperaturze pokojowej.
Przenieść zarodki z Netwell do świeżej szklanej fiolki scyntylacyjnej. Dodaj anty-DIG Fab Fragments (1:5,000) w 1% inaktywowanej termicznie surowicy owczej/TBST do zarodków. Kołysz przez noc w temperaturze 4 °C.

5. Mycie po hybrydyzacji przeciwciał

Usuń przeciwciało i wyrzuć. Umieść zarodki z powrotem w Netwell w celu umycia.
Prać 3 razy po 5 minut w TBST, bujając się w temperaturze pokojowej
Prać co najmniej 6 razy przez 1 godzinę każde, kołysząc w temperaturze pokojowej.
Prać przez noc w TBST, kołysząc w temperaturze 4 °C. Ponieważ płukanie przeciwciałami pomaga ograniczyć barwienie tła, preferowana jest maksymalizacja liczby i czasu trwania prania. Zarodki są rutynowo myte w TBST w temperaturze 4 °C w weekendy.

6. Wykrywanie sondy

Uzupełnić świeży roztwór NTMT i wysterylizować filtrem.
Odrzucić roztwór do płukania TBST i umieścić zarodki w czystej szklanej fiolce scyntylacyjnej. Umyj zarodki 3 razy w świeżym NTMT przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej, kołysząc.
Usunąć płukanie NTMT i dodać mieszaninę reakcyjną 1 x NBT / 1 x BCIP w NTMT. Ponieważ te reagenty są wrażliwe na światło, przykryj fiolkę scyntylacyjną folią i rozdrobnij w temperaturze pokojowej.
Monitoruj reakcję koloru co 15 minut, aż pożądana ekspresja genów będzie wyraźnie widoczna. Silne sondy mogą potrzebować zaledwie 10 minut, aby się rozwinąć. Słabe sondy mogą zająć 1-2 godziny. Nie pozwól, aby reakcja trwała zbyt długo, ponieważ zacznie pojawiać się zabarwienie tła (cały zarodek zacznie zmieniać kolor na matowy fioletowy lub brązowy).
Prać 2 razy po 10 minut w PBT w temperaturze pokojowej, kołysząc.
Postfix zarodki w 4% paraformaldehydzie, 0,1% aldehydu glutarowego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Zarodki mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w utrwalaczu w temperaturze 4 °C.
Wizualizuj zarodki za pomocą mikroskopu stereoskopowego do preparacji. Aby uzyskać jasnoniebieskie tło do zdjęć, umieść zarodki w naczyniu ze wstępnie utwardzoną 1% agarozą/PBS.

7. Reprezentatywne wyniki dla I. Hybrydyzacja in situ RNA Whole Mount u morskich spodoustych

RNA całe wierzchowanie in situ, przedstawiające ekspresję jeża Sonic (Shh) i Hoxa13 w zarodkach skaterów, pokazano na rysunku 1. Ekspresja Shh u wyższych kręgowców znajduje się w strunie grzbietowej i endodermie jelitowej i ten wzorzec ekspresji jest zachowany w łyżwach (ryc. 1a) ^8,9 . Morskie spodouste mają unikalną metodę osmoregulacji, która wykorzystuje gruczoł odbytniczy do wydzielania soli. Ekspresja Hoxa13 jest wysoka w rozwijającym się gruczole odbytniczym (ryc. 1b) ¹⁰. Rola produktu genu Hoxa13 w kształtowaniu gruczołu odbytniczego pozostaje nieznana.

II. Parafina zatapiająca i cięta na sekcje tkanki spodoustej

1. Pobieranie i przygotowanie tkanek

Wypreparuj pożądaną tkankę i utrwal 10% formalinę przez 24-48 godzin, kołysząc w temperaturze pokojowej. 4% paraformaldehyd (PFA) może być również stosowany jako utrwalacz (patrz Dyskusja).
Wypłukać utrwalacz przez mycie w PBS, 3 razy po 30 minut. W zależności od wielkości chusteczki czas prania może zostać skrócony do 10 minut lub wydłużony do 1 godziny.
Odwodnić zarodki, myjąc je w serii etanolu 25%, 50% i 75% etanolu: PBS kołysząc w temperaturze pokojowej. Ponownie, czas każdego prania będzie zależał od rozmiaru chusteczki. Na 0,5 cm³ tkankę inkubować każde płukanie przez 15 minut. Zwiększ czas dla większych elementów. Jeśli pożądane jest długotrwałe przechowywanie tkanki, należy przemyć ją dodatkowo dwa razy w 75% etanolu i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego roku. W przeciwnym razie przejdź do następnego kroku.
Dalej odwodnić, myjąc 3 razy w 100% etanolu przez 15 minut każde, kołysząc.

2. Osadzanie i cięcie parafiny

Sklarować tkankę, myjąc 2 razy w ksylenie przez 5 minut każdy w szklanych fiolkach scyntylacyjnych z zakrętkami. Ksylen sprawi, że tkanka stanie się krucha, więc nie przekraczaj łącznie 10 minut na pranie. Tkanka powinna wyglądać na półprzezroczystą, gdy trzymasz ją pod światło. Jeśli po dwóch praniach chusteczka jest nadal bardzo nieprzezroczysta, wykonaj dodatkowe płukanie w ksylenie przez 5 minut, a następnie postępuj zgodnie z protokołem. Z ksylenem należy obchodzić się wyłącznie w dygestoriach w rękawiczkach.
Usunąć ksylen i napełnić fiolkę scyntylacyjną w 2/3 stopioną parafiną. Inkubować w piecu o temperaturze 60 °C przez 30 minut. Podczas umieszczania parafiny w fiolce można zauważyć, że parafina krzepnie wzdłuż boków fiolki. Umieścić fiolkę w piekarniku i odczekać, aż parafina ponownie się rozpuści przez kilka minut. Wyjąć fiolkę z suszarki i szybko zamieszać roztwór, aby wymieszać i umieścić w piecu do końca inkubacji.
Powtórz inkubację parafiny jeszcze dwa razy przez 30 minut.
Inkubować w parafinie dwa razy przez godzinę. Zmienić parafinę po raz ostatni i inkubować przez noc w piecu o temperaturze 60 °C.
Następnego dnia umieść tkankę w podgrzewanej komorze kąpieli parafinowej i umieść pod próżnią na 2-3 godziny. Ułatwi to infiltrację parafiny do tkanki i usunie wszelkie pęcherzyki powietrza. W przypadku niektórych rodzajów cienkich tkanek stopień podciśnienia może nie być wymagany, ale jest konieczny w przypadku całych zarodków lub przewodu pokarmowego i innych narządów z przedziałami świetlnymi.
Po infiltracji próżniowej tkanki należy umieścić tkankę w metalowej formie z roztopioną parafiną i ostudzić na płycie lodowej. Pozostaw na lodzie lub w temperaturze 4 °C na noc przed próbą usunięcia chusteczki z formy. Bloki parafiny mogą być przechowywane w nieskończoność w temperaturze 4 °C.
Umieść blok parafiny na mikrotomie i wytnij odcinki o grubości 8 μm. Sekcje powinny być unoszone na łaźni wodnej podgrzanej do 48 °C i montowane na szklanych szkiełkach Superfrost*Plus.
Suszyć szkiełka przez noc w piekarniku o temperaturze 37 °C.
Przechowywać skrawki w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.

III. Błękit alcki / Jądrowa czerwona plama tkanki spodoustej

1. Alcian Blue Bejca do mucyn

Umieść slajdy sekcjami skierowanymi do góry na podgrzewaczu do slajdów. Topić przez 45 min.
Umieść slajdy w uchwycie na slajdy. Wszystkie powstałe roztwory znajdują się w wannach wewnątrz dygestorium. Szkiełka myje się, przenosząc je z jednej wanny z roztworem do drugiej. Upewnij się, że poziom roztworu w wannach zakrywa szkiełka; Tkanki na szkiełkach są całkowicie zanurzone. Rozpuść parafinę, myjąc szkiełka 2 razy w ksylenie przez 5 minut każda.
Umyj szkiełka dwa razy 100% etanolem przez 1 minutę każda.
Preparaty nawadniające w serii etanolowej (75%, 50%, 25% etanolu) myć w każdym roztworze przez 1 min. Myć w dH₂O przez 1 min.
Barwienie w roztworze Alcian Blue o pH 2,5 przez 15 min.
Plamę można uzyskać, myjąc ją pod bieżącą wodą z kranu przez 3 minuty. Zanurz raz w dH₂O.
Barwienie przeciwbarwiące w roztworze Nuclear Fast Red Counterstain, przez 10 min.
Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 3 minuty i zanurzyć jednorazowo w dH₂O.
Odwadniać w serii etanolu (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) przez 20 zanurzeń każdy lub 1 minutę każdy. Umyj 2 razy w ksylenie po 5 minut. Montaż za pomocą medium montażowego DPX i szkiełek nakrywkowych. Pozostaw medium montażowe do wyschnięcia i stwardnienia przez 48 godzin w dygestoriach przed manipulowaniem szkiełkami.