MikroRNA odgrywają znaczącą rolę w strukturze i funkcjonowaniu mózgu. Tutaj opisujemy metodę wymuszania nadmiernej ekspresji miRNA w hipokampie za pomocą stereotaktycznego wstrzykiwania zmodyfikowanego lentiwirusa wykazującego ekspresję miRNA. Podejście to może służyć jako stosunkowo szybki sposób oceny skutków in vivo nadmiernej ekspresji miRNA w określonych regionach mózgu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
MikroRNA (miRNA) to małe regulatorowe jednoniciowe cząsteczki RNA o długości około 22 nukleotydów, z których każda może celować w liczne transkrypty mRNA i zaciemniać cały szlak ekspresji genów poprzez indukowanie destrukcji i/lub hamowanie translacji tych celów. Kilka miRNA odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu struktury i funkcji neuronów oraz w funkcjach mózgu wyższego poziomu, a także poszukuje się metod manipulowania ich poziomami w celu zbadania tych funkcji. W tym miejscu przedstawiamy bezpośrednią metodę in vivo do badania poznawczych konsekwencji wymuszonego nadmiaru miRNA u myszy poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie cząstek wirusa kodujących miRNA. W szczególności obecny protokół obejmuje wstrzyknięcie do regionu CA1 hipokampa, który przyczynia się do konsolidacji pamięci ssaków, uczenia się i reakcji na stres oraz zapewnia wygodne miejsce wstrzyknięcia. Współrzędne są mierzone zgodnie z myszą bregma, a perfuzja wirusa jest kontrolowana cyfrowo i utrzymywana bardzo powoli. Po wstrzyknięciu rana pooperacyjna zostaje uszczelniona, a zwierzęta wracają do zdrowia. Lentiwirusy kodujące tłumiki odpowiednich celów mRNA służą do implikowania specyficznej interakcji miRNA/cel odpowiedzialnej za obserwowany efekt, z myszami naiwnymi, myszami, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną i myszami, którym wstrzyknięto "puste" wektory lentiwirusowe jako kontrole. Miesiąc po wstrzyknięciu zwierzęta są badane w Morris Water Maze (MWM) w celu oceny ich zdolności do uczenia się nawigacji i zapamiętywania. MWM to okrągły zbiornik wypełniony kolorową wodą z małą platformą zanurzoną 1 cm pod powierzchnią wody. Stałe sygnały wizualne wokół zbiornika pozwalają na nawigację przestrzenną (dźwięk i pole magnetyczne Ziemi mogą również pomagać zwierzętom w nawigacji). Monitoring z kamer wizyjnych umożliwia pomiar trasy przepłynięcia oraz czasu odnalezienia i oszacowania pomostu. Mysz najpierw uczy się, że wejście na ukrytą platformę oferuje ucieczkę od wymuszonego pływania; Następnie jest testowany pod kątem korzystania z tej ucieczki, a na koniec platforma jest usuwana, a testy sondy sprawdzają, czy mysz pamięta swoją poprzednią lokalizację. Powtarzające się testy przez kilka kolejnych dni wskazują na poprawę wydajności testowanych myszy przy krótszych opóźnieniach w znalezieniu i zamontowaniu platformy, a także jako bardziej bezpośrednie drogi do dotarcia do platformy lub jej lokalizacji. Brak wykazania takiej poprawy oznacza upośledzenie uczenia się i pamięci i/lub lęk, które mogą być następnie specjalnie przetestowane (np. w labiryncie podwyższonym plus). Takie podejście umożliwia walidację specyficznych miRNA i docelowych transkryptów w badanych procesach poznawczych i/lub związanych ze stresem.
Wprowadzenie
Rola poszczególnych miRNA w funkcjonowaniu układu nerwowego została ostatnio zakwestionowana przez iniekcję lentiwirusową w kilku badaniach. Stwierdzono, że MiRNA mają kluczowe znaczenie dla utrzymania i ponownego kształtowania struktury synaps 1, synaptogenezy 2 oraz przebudowy i utrzymania synaps 3. Badania te silnie sugerują, że miRNA są zaangażowane, poprzez wielopoziomowe efekty regulacyjne, zarówno w kształtowanie, jak i utrzymywanie głównego wyjścia układu nerwowego, funkcji poznawczych. Stereotaktyczne wstrzykiwanie cząstek lentiwirusa do określonych regionów mózgu gryzoni umożliwia poszukiwanie zmian w morfologii synaps i aktywności neuronalnej, a także wykorzystano do ustalenia funkcjonalnego znaczenia nadekspresji transkryptów 4,5. Bezpośrednie zakażenie neuronów w dobrze zdefiniowanych obszarach mózgu lentiwirusami wyrażającymi miRNA może być związane z badaniami nad starzeniem się, zaburzeniami mózgu i neurodegeneracją; Badania miRNA w sferze regulacji behawioralnej 6-8 są na znacznie mniej zaawansowanym etapie, a stereotaktyczne wstrzyknięcie cząstek lentiwirusa eksprymujących miRNA, a następnie testy behawioralne może być przydatne do takich celów. Znacznie bardziej pracochłonna metoda wywoływania nadmiernej lub niedostatecznej ekspresji obejmuje genetycznie modyfikowane myszy knock-in lub knockout. Systemy genetyczne mogą ponadto pozwalać na warunkową i czasową kontrolę ekspresji (np. systemy Cre-Lox, Tet), ale prawie nie zapewniają one przestrzennej specyficzności procedury wstrzykiwania i prawie zawsze występuje pewna nieszczelność. Ponadto procedury inżynieryjne nie wymagają operacji i mogą być stosowane w laboratoriach ze stosunkowo dobrą odtwarzalnością; Są one jednak wolniejsze i wymagają znacznie większej siły roboczej i środków finansowych. Ponadto czasowa kontrola nadmiernej lub niedostatecznej ekspresji u myszy, którym wstrzyknięto zastrzyk, jest znacznie dokładniejsza w porównaniu z myszami modyfikowanymi genetycznie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie lentiwirusa
- Hoduj komórki HEK-293FT do 90% konfluencji.
- W dniu transfekcji należy zmienić pożywkę komórkową na DMEM bez surowicy, uzupełnioną o 1 mM glutaminę i 50 mg/ml penicyliny-streptomycyny.
- Kotransfekować komórki wektorem pLKO.1-Puro i plazmidami kodującymi ugrupowania delta R8.2 i VSV-G oraz miRNA będące przedmiotem zainteresowania, używając 10 μl 1 mg / ml polietylenininy jako nośnika 9.
- Zbierz zapakowane lentiwirusy po 24 godzinach i 48 godzinach po transfekcji, przefiltruj przez filtr 0,45 μm.
- Zagęścić lentiwirusy za pomocą ultrawirowania w 70 000 x g, przez 2 godziny w temperaturze 15 °C, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -70 °C.
- Zmierz miano wirusa, infekując komórki HEK-293T seryjnie rozcieńczonymi preparatami wirusowymi (1 do 10-6 ml wektora na studzienkę). Otrzymane miano (zalecane minimum ~1×109 zakaźnych cząstek na ml) ocenia się pod kątem ekspresji interesującego genu, stosując selekcję puromycyny i ilościowe określenie wirusów eksprymujących GFP poprzez zliczanie komórek fluorescencyjnych.
Aby uzyskać bardziej szczegółowy protokół przygotowania lentiwirusa, zobacz 10.
2. Przygotowanie zwierząt do operacji
- Strój chirurga powinien obejmować fartuch chirurgiczny, sterylne rękawiczki, czepek i maskę.
- Zważyć zwierzę, a następnie znieczulić je wstrzyknięciem IP mieszaniny ketaminy, o objętości proporcjonalnej do masy zwierzęcia, jak określono dla każdego leku. W przypadku mieszaniny ketaminy/ksylazyny zwykle stosuje się zakres dawek 80-200 mg/kg ketaminy i 7-20 mg/kg ksylazyny.
- Poczekaj, aż zwierzę zostanie w pełni znieczulone, a następnie sprawdź, czy nie ma odruchu wycofania w tylnej kończynie zwierzęcia, rozciągając kończynę, a następnie naciskając ją palcem.
- Należy wstrzyknąć zwierzęciu podskórnie preparat Rimadyl, zgodnie z zaleceniami na pudełku, w celu złagodzenia bólu. Typowy zakres dawek leku Rymadil wynosi 5-10 mg.
- Umieść zwierzę na poduszce grzewczej, aby utrzymać stałą temperaturę ciała i zwilż oczy maścią.
- Ogol obszar między dwoma uszami za pomocą maszyny do przycinania.
- Zdezynfekuj skórę za pomocą betadyny.
3. Odsłonięcie czaszki i wiercenie
- Umieść zwierzę w stereotakcie, dopasowując pręty do szczelin tuż przed uszami zwierzęcia.
- Za pomocą skalpela wykonaj przednio-tylne nacięcie o długości około 1,5 cm między uszami i utrzymuj je otwarte za pomocą zacisków chirurgicznych (serfines).
- Oczyść powierzchnię czaszki bawełnianym wacikiem, aż do przecięcia szwu koronalnego i szwów strzałkowych; tj. bregma i przecięcie szwów koronalnych i lambdoidalnych; tj. lambda, są widoczne.
- Skieruj końcówkę strzykawki, trzymaną przez stereotakt, na punkt bregma, we wszystkich trzech osiach. Zapisz współrzędne. Punkt ten byłby traktowany jako punkt zerowy we wszystkich trzech osiach.
- Podnieść strzykawkę w osi pionowej tak, aby ruch płaski nie porysował czaszki i przesunąć główkę strzykawki we właściwe miejsce. Wstrzyknięcia CA1 do hipokampa wymagają następujących współrzędnych względem bregmy w mm: -2 na osi przedniej/tylnej, ±1,8 na osi bocznej/przyśrodkowej i -1,5 na osi grzbietowej/brzusznej.
- Opuścić końcówkę strzykawki, aż dotknie czaszki i oznaczyć to miejsce markerem. Wyjąć strzykawkę z powrotem, aby uniknąć dźgnięcia.
- Wywierć płytki otwór, tylko w kości czaszki za pomocą drobnego wiertła. Trzymaj wiertło stabilnie, aby nie kontynuowało wiercenia w tkance miękkiej pod spodem. Można temu zapobiec, podpierając jedną rękę drugą i wiercąc w krótkich impulsach.
4. Wstrzyknięcie lentiwirusa
- Pobrać 0,5 ml stężonego roztworu lentiwirusa.
- Umieść strzykawkę nad otworem i powoli opuść ją pionowo, aż dotrze do powierzchni czaszki. Kontynuuj bardzo powolne opuszczanie strzykawki do mózgu. Na tym etapie może wystąpić krwawienie, które niekoniecznie wskazuje na nieudaną penetrację. Jeśli wystąpi krwawienie, wytrzyj je bawełnianym wacikiem.
- Ustawić pompę cyfrową na 0,02 ml/min (0,5 μl zostanie wstrzyknięte w ciągu 25 minut) i rozpocząć infuzję. Powolna infuzja pozwala na skuteczne rozprzestrzenianie się wirusa w tkance i zapobiega przepływowi wstecznemu. W niektórych typach strzykawek należy rozważyć włożenie strzykawki na dodatkową głębokość 0,5 mm przed wycofaniem się do pierwotnych współrzędnych i zaparzeniem.
- Po zakończeniu infuzji należy odczekać dodatkowe 5 minut, aby materiał mógł rozprzestrzenić się do mózgu, zamiast wycofywać się z powrotem do kanału utworzonego przez strzykawkę.
- Wyjmować strzykawkę bardzo powoli i obserwować, czy nie ma przepływu wstecznego. Jeśli na tym etapie zaobserwuje się przepływ wsteczny, prawdopodobnie część wstrzykniętego materiału została utracona.
5. Uszczelnianie ran i rekonwalescencja
- Uszczelnij ranę histoakrylem. Należy pamiętać, aby nie dopuścić do przeciekania histoakrylu do oczu.
- Wstrzyknąć zwierzęciu dootrzewnowo (IP) 1 ml podgrzanego roztworu soli fizjologicznej, aby uniknąć odwodnienia.
- Umieść zwierzę w klatce regeneracyjnej, która jest umieszczona na podgrzewanej podkładce. Obserwuj zwierzę, gdy dochodzi do siebie przez dodatkową godzinę.
W przypadku utraty wagi, braku apetytu, osłabienia/niemożności uzyskania paszy lub wody, stanu agonalnego lub infekcji, należy przeprowadzić eutanazję zwierzęcia. Dopuszczalnymi metodami eutanazji gryzoni są barbiturany, wziewne środki znieczulające, CO2, CO lub chlorek potasu w połączeniu ze znieczuleniem ogólnym.
Po 4 do 6 tygodniach, ocena pamięci nawigacyjnej zwierzęcia jest oceniana w Labiryncie Wodnym Morrisa. lentiwirus zwykle infekuje większość komórek w sferze iniekcyjnej.
6. Ocena zachowania w wodnym labiryncie Morrisa
- Trenuj zwierzęta w wodnym labiryncie Morrisa. Dokładny protokół szkolenia i testowania znajduje się w punkcie 11. Po każdej próbie osusz zwierzę suchym ręcznikiem, umieść je w klatce i odśwież wodę w zbiorniku.
- Testuj zwierzęta w labiryncie wodnym Morris przez 3 kolejne dni, 4 próby każdego dnia. Każdego dnia wprowadzaj zwierzę do labiryntu w każdym z 4 kierunków labiryntu (północ, południe, wschód i zachód) w zmieniającej się kolejności, na przykład dzień pierwszy: wschód-zachód-północ-południe, dzień drugi: zachód-południe-północny-wschód. Wytrzyj zwierzęta po każdej próbie.
- Podczas prób testowych śledź zwierzę za pomocą systemu śledzenia, takiego jak system śledzenia Noldus.
- Po 12. próbie testowej włóż zwierzę do zbiornika na wodę bez platformy na jedną minutę. Zostanie to wykorzystane do analizy strategii poszukiwawczej, którą przyjmuje zwierzę.
- Przeanalizuj dane zgodnie z sugestią w punkcie 12.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wstrzyknięcie 0,5 μl lentiwirusa do obszaru CA1 w hipokampie myszy, przy szybkości przepływu określonej w sekcji protokołu, pozwala uzyskać zainfekowaną sferę o średnicy około 1 mm w osi rostralno-kaudalnej oraz około 0,5 mm w osiach przyśrodkowej-bocznej i przednio-tylnej (Rysunek 3).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusa jest stosunkowo szybką metodą oceny in vivo zarówno w górę, jak i w dół regulacji różnych genów i miRNA. Główną alternatywą jest genetycznie zmodyfikowana mysz, która jest znacznie bardziej pracochłonną i czasochłonną techniką niż bezpośrednie wstrzyknięcie lentiwirusa. Ponadto regulacja w górę, w przypadku wstrzyknięcia lentiwirusa, zachodzi w określonym czasie u dorosłej myszy i nie obejmuje żadnej możliwości nieszczelności podczas rozwoju, jak to najczęściej ma miejsc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (stypendium SB), The Legacy Heritage Biomedical Science Partnership Program of the Israel Science Foundation (grant nr 378/11, dla HS) oraz Niemiecko-Izraelską Fundację Badań Naukowych i Rozwoju (G.I.F) (grant nr. 1093-32.2/2010, do HS).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Waga dla gryzoni | Burtons (UK) | 115-455 | |
| poduszka grzewcza | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| Stoelting | 51465 | ||
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Skalpel i ostrza | Kent scientific | ||
| Strzykawka Harland | Wiertarka Hamilton | 7632-01 | |
| Pompa cyfrowa Stoelting | 51449 | ||
| Aparatura Harvard | 704507 | ||
| Zbiornik na wodę i platforma | Stoelting | 60135 | |
| Reodczynniki | |||
| ketamina | Vetoquinol (Lure France) | ||
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer zdrowie zwierząt | 24751 | |
| maść nawilżająca - Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| sola fizjologiczna | Sigma Aldrich | D8662 |
Bibliografia
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171(2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897(2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920(2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
