Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie stabilnych linii komórek ludzkich z ekspresją shRNA lub cDNA indukowaną tetracykliną (Tet-on)

35K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50171

⸱

5 marca 2013

 ,  , 
1UCL Cancer Institute, 2Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research

W tym artykule

Podsumowanie

Szybki i prosty sposób na wygenerowanie ludzkich linii komórkowych z indukowalną i odwracalną nadekspresją cDNA lub nokautem za pośrednictwem shRNA interesującego genu. Metoda ta umożliwia naukowcom wiarygodne i wysoce powtarzalne manipulowanie liniami komórkowymi, które są trudne do zmiany za pomocą przejściowych metod transfekcji lub konwencjonalnych strategii knockdown/knockout.

Streszczenie

Głównym podejściem w dziedzinie biologii komórek ssaków jest manipulowanie ekspresją interesujących genów w wybranych liniach komórkowych, w celu ujawnienia jednej lub kilku funkcji genu za pomocą przejściowej/stabilnej nadekspresji lub knockdownu interesującego genu. Niestety, w przypadku różnych badań biologicznych komórek podejście to jest nieodpowiednie, gdy manipulacje ekspresją genów skutkują defektami wzrostu/proliferacji komórek lub niepożądanym różnicowaniem komórek. W związku z tym naukowcy dostosowali białko represorowe tetracykliny (TetR), pobrane z operonuoporności na tetracyklinę E. coli 1, do wytworzenia bardzo wydajnych i ścisłych systemów regulacyjnych do ekspresji cDNA w komórkach ssaków2,3. Krótko mówiąc, TetR został zmodyfikowany tak, aby (1) blokować inicjację transkrypcji poprzez wiązanie się z operatorem Tet (TO) w regionie promotora po dodaniu tetracykliny (określanej jako system Tet-off) lub (2) wiązać się z TO przy braku tetracykliny (określanej jako system Tet-on) (Figura 1). Biorąc pod uwagę niedogodność polegającą na tym, że system Tet-off wymaga ciągłej obecności tetracykliny (której okres półtrwania wynosi około 24 godziny w pożywce do hodowli komórek tkankowych), system Tet-on został bardziej zoptymalizowany, co zaowocowało opracowaniem bardzo ścisłych i wydajnych systemów wektorowych do ekspresji cDNA, jak zastosowano tutaj.

Krótko po ustaleniu interferencji RNA (RNAi) dla knockdownu genów w komórkach ssaków4, opisano wektory wyrażające krótkie RNA (shRNA), które działają bardzo podobnie do siRNA5-11. Jednak te podejścia do knockdownu, w których pośredniczy shRNA, mają takie same ograniczenia, jak konwencjonalne strategie nokautu, ponieważ stabilne wyczerpanie nie jest wykonalne, gdy cele genowe są niezbędne do przetrwania komórki. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, van de Wetering i wsp. 12 zmodyfikowało wektor ekspresji shRNA pSUPER5 poprzez wstawienie TO do regionu promotora, co umożliwiło im wygenerowanie stabilnych linii komórkowych z indukowanym tetracykliną zubożeniem docelowych genów będących przedmiotem zainteresowania.

Tutaj opisujemy metodę efektywnego generowania stabilnych ludzkich linii komórkowych Tet-on, które niezawodnie napędzają albo indukowaną nadekspresję, albo zubożenie interesującego nas genu. Za pomocą tej metody udało nam się wygenerować linie komórkowe Tet-on, które znacznie ułatwiły analizę kaskady MST/hMOB/NDR w centrosomie13,14 i sygnalizacji apoptozy15,16. W tym raporcie opisujemy wybrane przez nas wektory, a także opisujemy dwa kolejne etapy manipulacji, które są niezbędne do wydajnego generowania ludzkich linii komórkowych Tet-on (ryc. 2). Ponadto, oprócz nakreślenia protokołu generowania ludzkich linii komórkowych Tet-on, omówimy krytyczne aspekty dotyczące procedur technicznych i charakterystyki komórek Tet-on.

Protokół

1. Klonowanie pcDNA6_TetR_IRES_blast

  1. Jak pokazano na rysunku 3, przeprowadzić częściowe trawienie plazmidu pcDNA6 / TR (V1025-20, Invitrogen) z enzymami restrykcyjnymi XbaI i NcoI w celu usunięcia genu TetR i promotora genu oporności na blasticydynę (BlastR). Wyizoluj fragment wektora o rozmiarze 4,6 kb.
  2. Aby usunąć sekwencję poliadenylacji z genu TetR, wprowadź metodą PCR miejsce XhoI natychmiast po kodonie Stop cDNA TetR, zachowując miejsce XbaI na końcu 5' cDNA. Powstały fragment należy sklonować do pMigR117 za pomocą enzymów restrykcyjnych XbaI i XhoI w celu wytworzenia plazmidu pMigR1_TetR.
  3. Strawij wektor pMigR1_TetR enzymami restrykcyjnymi XbaI i NcoI, aby uwolnić fragment TetR_IRES. Wyizoluj fragment wkładki o rozmiarze 1,25 kb.
  4. Zliżuj 4,6 kb pcDNA6/TR i 1,25 kb TetR_IRES fragmentów. Przekształć produkt ligacji w kompetentną E. coli i zidentyfikuj pożądany konstrukt pcDNA6_TetR_IRES_blast przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej.

2. Generacja linii komórkowych stabilnie wyrażających TetR

  1. W pierwszym dniu wysiewaj 1x106 komórek na 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej przy użyciu standardowego podłoża wzrostowego (np. DMEM uzupełnionego 10% FCS). Wysiewaj dwie płytki, jedną do transfekcji z pcDNA6_TetR_IRES_blast, a drugą jako kontrolę ujemną do selekcji blasticydyny. Upewnij się, że używasz najniższego możliwego pasażu i zalecanego podłoża wzrostowego.
  2. W dniu 2 należy wykonać transfekcję na jednej płytce z 2 μg pcDNA6_TetR_IRES_blast przy użyciu Fugene 6 (E2691, Promega) zgodnie z instrukcjami producenta. Nie należy transfekować drugiej płytki.
  3. W dniu 3 dodaj standardową pożywkę zawierającą 5 μg/ml blasticydyny do obu płytek. Należy pamiętać, że optymalne stężenie selekcyjne może się różnić dla danej linii komórkowej i może być konieczne wcześniejsze określenie.
  4. W 4 dniu podziel komórki na 1/5, 1/25, 1/50 i 1/100 za pomocą 10-centymetrowych płytek i standardowej pożywki zawierającej 5 mg/ml blasticydyny. Upewnij się, że prawidłowo oznaczyłeś płytki zawierające komórki nietransfekowane lub transfekowane. Przygotować dwie płytki na każdym etapie rozcieńczania.
  5. Sprawdzaj komórki codziennie, upewniając się, że wszystkie komórki na nietransfekowanych płytkach obumarły w ciągu pierwszego tygodnia. Zmieniaj wybrane media co 2-3 dni.
  6. Po 1-2 tygodniach powinny zacząć pojawiać się kolonie oporne na blasticydynę. Wybierz płytki zawierające od 5 do 50 kolonii, aby mieć pewność, że można zbierać pojedyncze kolonie.
  7. Gdy kolonie osiągną średnicę około 5 mm (lub większą), wyizoluj co najmniej 12 niezależnych klonów za pomocą cylindrów klonujących, aby wybrać pojedyncze kolonie. Przenieść każdy klon do oddzielnego dołka na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. W przypadku zlewania się podziel komórki z każdej studzienki na jedną studzienkę 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
  8. Kontynuuj hodowlę klonów w pożywkach selekcyjnych. Po zlewaniu się podziel komórki z każdej studzienki na dwie pojedyncze studzienki 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
  9. Dla każdego klonu, który ma być badany, należy zamrozić jedną studzienkę zlewających się komórek i zebrać komórki w drugiej studzience w celu przeprowadzenia kolejnych testów za pomocą immunoblottingu.
  10. Wykryj TetR za pomocą Western blot przy użyciu mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-TET02 (MoBiTec GmbH). Pamiętaj, aby jako kontrolę ujemną włączyć lizat rodzicielskiej linii komórkowej.
  11. Wybierz 3 klony o najwyższej ekspresji TetR i rozwiń każdą kulturę klonalną. Zamroź zapasy każdego obiecującego klonu tak szybko, jak to możliwe. Na koniec zbadaj interesujące nas parametry molekularne i biologiczne komórki, porównując rodzicielskie linie komórkowe z klonami wykazującymi ekspresję TetR. Wybierz "najlepszy" klon o najwyższej ekspresji TetR, który nie wykazuje żadnych zmian w interesujących nas parametrach molekularnych i biologicznych komórki.

3. Pilotażowe testowanie wektorów pTER i pT-Rex DEST30 wyrażających odpowiednio shRNA lub cDNA

  1. Wygeneruj plazmid pTER z wstawieniami shRNA, jak opisano12. Skonstruować wektor pT-Rex DEST30 (12301-016, Invitrogen) zawierający interesujące go cDNA przy użyciu technologii Gateway (Invitrogen). W przypadku ekspresji cDNA, dodanie znacznika do cDNA ułatwi później wykrycie białka eksprymowanego egzogennie.
  2. Przejściowo transfekować rodzicielską docelową linię komórkową plazmidami pTER lub pT-Rex DEST30 (wyrażającymi interesujące nas shRNA lub cDNA) przy użyciu wybranego odczynnika do transfekcji. Do testowania plazmidów ekspresyjnych shRNA należy zapewnić wysoką wydajność transfekcji.
  3. Zbierz transfekowane komórki i poddaj je immunoblottingowi przy użyciu odpowiednich przeciwciał, spodziewając się wykrycia wyczerpania lub nadekspresji interesującego Cię genu.

4. Generowanie stabilnych linii komórkowych z ekspresją shRNA lub cDNA indukowaną tetracykliną (Tet-on) za pomocą wektorów pTER lub pT-Rex DEST30

  1. W dniu 1 wysiewaj 1x106 komórek "najlepszego" klonu z ekspresją TetR na 10-centymetrową płytkę, używając standardowej pożywki wzrostowej uzupełnionej certyfikowaną surowicą wolną od tetracyklin (na przykład FBS z Invitrogen; 16000-014). Zasiać jedną płytkę do transfekcji pTER (lub pT-Rex DEST30) i jedną szalkę jako kontrolę ujemną do podwójnej selekcji. Upewnij się, że korzystasz z najniższego możliwego przejścia.
  2. W dniu 2 należy wykonać transfekcję na jednej płytce z 2 μg pTER (lub pT-Rex DEST30) przy użyciu Fugene 6. Nie należy transfekować drugiej płytki.
  3. W dniu 3 dodaj standardową pożywkę wzrostową zawierającą 5 μg/ml blasticydyny i 500 μg/ml zeocyny (lub 1 mg/ml G418).
  4. W 4 dniu podziel komórki na 1/5, 1/25, 1/50 i 1/100 za pomocą 10-centymetrowych płytek i standardowej pożywki zawierającej 5 μg/ml blasticydyny i 500 μg/ml zeocyny (lub 1 mg/ml G418). Przygotować dwie płytki na każdym etapie rozcieńczania.
  5. Sprawdzaj komórki codziennie, upewniając się, że w ciągu pierwszego tygodnia wszystkie komórki na nietransfekowanych płytkach obumarły. Zmieniaj standardową pożywkę zawierającą blasticydynę i zeocynę (lub G418) co 3-4 dni.
  6. Po 2-3 tygodniach powinny zacząć pojawiać się kolonie podwójnie oporne blasticydyna/zeocyna (lub blasticydyna/G418). Wybierz płytki zawierające od 5 do 50 kolonii, aby wybrać pojedyncze kolonie.
  7. Gdy kolonie osiągną średnicę około 5 mm (lub większą), użyj cylindrów klonujących, aby wybrać pojedyncze kolonie. Odizoluj co najmniej 24 pojedyncze klony. Przenieść każdy klon do oddzielnego dołka na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
  8. Klony hodowlane w pożywce zawierającej podtrzymujące stężenia blasticydyny (5 μg/ml) i zeocyny (250 μg/ml) [lub G418 (0,5 mg/ml)]. W przypadku zlewania się podziel komórki z każdej studzienki na jedną studzienkę 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
  9. Dla każdego klonu, który ma być badany, należy podzielić jedną zlewającą się studzienkę z płytki 6-dołkowej na trzy pojedyncze studzienki z płytki 6-dołkowej. Po zlewaniu się zamroź komórki z jednej studzienki. Użyj pozostałych dwóch studzienek do zbadania ekspresji indukowanej tetracykliną. Dodać tetracyklinę w stężeniu 1 μg/ml do jednego dołka, pozostawiając drugi studzienkę wolną od tetracykliny.
  10. Po 24 do 96 godzinach inkubacji z tetracykliną należy pobrać komórki i przeprowadzić proces immunoblottingu przy użyciu odpowiednich przeciwciał. Krótsze czasy inkubacji tetracyklin są zalecane podczas badań przesiewowych pod kątem indukcji ekspresji cDNA, podczas gdy dłuższe leczenie tetracykliną będzie konieczne w celu określenia zubożenia endogennych białek za pośrednictwem shRNA.
  11. Wybierz co najmniej dwa klony z żądanym zubożeniem/nadekspresją i rozwiń każdą kulturę. Zamroź zapasy każdego obiecującego klonu tak szybko, jak to możliwe. Podczas hodowli klonów Tet-on do eksperymentów zawsze upewnij się, że używasz pożywki uzupełnionej surowicą wolną od tetracyklin i odpowiednimi antybiotykami selekcyjnymi w stężeniach podtrzymujących.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przykład wstępnej charakterystyki linii komórkowych RPE-1 stabilnie eksponujących TetR przedstawiono na Rysunku 4. Należy zauważyć, że wszystkie klony RPE-1 wykazują zróżnicowany poziom ekspresji TetR (porównać ścieżki 2 i 5), podczas gdy linia komórek macierzystych (pełniąca rolę kontroli negatywnej) nie wykazuje ekspresji egzogennego białka TetR (Rysunek 4, ścieżka 1). Taka zmienność ekspresji TetR pomiędzy klonami komórek RPE-1 Tet-on jest spodziewana, ponieważ ekspresja plazmidów kod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Uważamy, że systemy Tet-on znacznie ułatwiają analizę funkcji genów, szczególnie w systemach komórkowych, które są trudne do manipulowania i/lub gdy manipulowany gen jest niezbędny do przeżycia komórki. Co więcej, zdolność do kontrolowania ekspresji genów przez wysoce specyficzne systemy Tet-on daje możliwość badania funkcji genów na różnych etapach (na przykład podczas progresji cyklu komórkowego lub dobrze zdefiniowanych procesów różnicowania). Przedstawiona tutaj metoda umożliwi naukowcom wygenerowanie pożądanych stab...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim członkom naszego laboratorium za pomocne dyskusje. Dziękujemy Joannie Lisztwan i Christinie Gewinner za krytyczną lekturę rękopisu. Prace te były wspierane przez grant BBSRC BB/I021248/1 oraz grant Wellcome Trust 090090/Z/09/Z.A.H. jest stypendystą Wellcome Trust Research Career Development w UCL Cancer Institute.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Invitrogen16000-044Testowane Tet-free
BlasticidinInvivogenant-bl-1
ZeocinInvivogenant-zn-5
G418PAA laboratoriesP31-011100 mg / ml w pożywce
anty-TET02MoBiTec GmbHTET02Stosować w 1/1000 do 1/2000 dla WB
pcDNA6/ TRInvitrogenV1025-20
pT-Rex DEST30Invitrogen12301-016
TetracyklinaSigma871282 mg/ml w etanolu
DoksycyklinaSigmaD98912 mg/ml w wodzie
Butle klonująceBellco Glass Inc.2090-00808wielokrotnego użytku

Bibliografia

  1. Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
  2. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
  3. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
  4. Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
  5. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
  6. McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
  7. Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
  8. Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
  9. Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
  10. Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
  11. Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
  12. van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
  13. Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
  14. Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
  15. Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
  16. Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
  17. Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

System Tet-onstabilne linie komórkoweekspresja shRNArepresor TetWestern blotcylindry do klonowaniapodwójna selekcjawyciszanie genów
Generowanie stabilnych linii komórek ludzkich z ekspresją shRNA lub cDNA indukowaną tetracykliną (Tet-on)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.