Ocena mechaniki układu oddechowego u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji

Podsumowanie

Niniejszy protokół zawiera szczegółowy opis krok po kroku procedur wymaganych do wykonania pomiarów mechaniki układu oddechowego, jak również oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Kanada).

Streszczenie

Technika wymuszonej oscylacji (FOT) jest potężnym, integracyjnym i translacyjnym narzędziem pozwalającym na eksperymentalną ocenę funkcji płuc u myszy w sposób kompleksowy, szczegółowy, precyzyjny i powtarzalny. Zapewnia pomiary mechaniki układu oddechowego poprzez analizę sygnałów ciśnienia i objętości uzyskanych w reakcji na predefiniowane, oscylacyjne przebiegi przepływu powietrza o małej amplitudzie, które są zwykle stosowane przy ujściu dróg oddechowych pacjenta. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje kroki wymagane do odpowiedniego wykonania pomiarów wymuszonych oscylacji u myszy przy użyciu sterowanego komputerowo wentylatora tłokowego (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Kanada). Opis podzielony jest na cztery części: etapy przygotowawcze, wentylacja mechaniczna, pomiary czynności płuc i analiza danych. Zawiera również szczegółowe informacje na temat oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę u znieczulonych myszy, co jest powszechnym zastosowaniem tej techniki, które rozciąga się również na inne wyniki i różne patologie płuc. Pomiary uzyskane na myszach naiwnych, a także z modelu uszkodzenia dróg oddechowych opartego na stresie oksydacyjnym przedstawiono w celu zilustrowania, w jaki sposób narzędzie to może przyczynić się do lepszej charakterystyki i zrozumienia badanych zmian fizjologicznych lub modeli chorób, a także do zastosowań w nowych obszarach badawczych.

Wprowadzenie

Odpowiednia charakterystyka właściwości mechanicznych płuc u małych zwierząt stała się niezbędna od czasu rozkwitu mysich modeli w naukach o oddychaniu. Pomiary te, wykonywane przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji (FOT), techniki stosowanej również u ludzi, zapewniają potężne, integracyjne i translacyjne podejście do badania znaczących zmian fizjologicznych. Pomiary FOT są zwykle uzyskiwane poprzez analizę sygnałów ciśnienia i objętości uzyskanych w reakcji na wstępnie zdefiniowany, oscylacyjny przebieg przepływu powietrza o małej amplitudzie (określany również jako perturbacja lub sygnał wejściowy) zastosowany do ujścia dróg oddechowych pacjenta¹. W najprostszej formie perturbacja FOT byłaby pojedynczym przebiegiem sinusoidalnym o dobrze zdefiniowanej częstotliwości. Bardziej złożone perturbacje zazwyczaj polegają na nałożeniu na siebie wybranych określonych (wzajemnie pierwotnych) przebiegów częstotliwości obejmujących szerokie spektrum. Dekompozycja wieloczęstotliwościowych sygnałów wejściowych i wyjściowych na ich składowe za pomocą transformaty Fouriera pozwala na obliczenie impedancji wejściowej układu oddechowego (Zrs), czyli funkcji przenoszenia pomiędzy sygnałami wejściowymi i wyjściowymi, przy każdej częstotliwości wchodzącej w skład perturbacji². W związku z tym FOT pozwala na jednoczesną ocenę mechaniki oddechowej w zakresie częstotliwości podczas jednego manewru². Dopasowanie zaawansowanych modeli matematycznych (np. modelu stałofazowego³) do danych dotyczących impedancji pozwala na podział odpowiedzi na parametry zależne od dróg oddechowych (centralnych i obwodowych) oraz miąższu tkanki płuc^{1, 3}. Ponieważ wiele czynników wpływających na reakcję fizjologiczną (np. częstotliwość oddychania, objętość oddechowa, objętość płuc, górne drogi oddechowe, spontaniczne wysiłki oddechowe, czas pomiarów) jest kontrolowanych i standaryzowanych przez system pomiarowy i procedury eksperymentalne,1 technika ta jest w stanie generować precyzyjne i powtarzalne pomiary, pod warunkiem, że jest wykonywana prawidłowo. Celem tego artykułu jest szczegółowy, chronologiczny opis procedury potrzebnej do wykonania takich pomiarów u myszy. Protokół składa się z czterech części: etapów przygotowawczych (odczynniki, sprzęt i badani), wentylacji mechanicznej, pomiarów czynności płuc i analizy danych. Przedstawiono przykłady reprezentatywnych wyników mechaniki układu oddechowego uzyskanych przy użyciu wentylatora tłokowego sterowanego komputerowo (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Kanada). Uzyskano je od naiwnych myszy, a także z opartego na stresie oksydacyjnym modelu uszkodzenia dróg oddechowych charakteryzującego się zapaleniem dróg oddechowych, uszkodzeniem komórek nabłonka i zwiększoną reakcją dróg oddechowych na wdychaną metachilinę w aerozolu⁴. Chociaż protokół ten jest często stosowany do oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę, rozciąga się na inne wyniki i różne patologie, w tym astmę, przewlekłą obturacyjną chorobę płuc (POChP), rozedmę płuc, zwłóknienie płuc, uszkodzenie płuc, a także transgeniczne mysie modele patologii podobnych do choroby ludzkiej. Wyniki badań przeprowadzonych z wykorzystaniem tego narzędzia mogą przyczynić się do lepszej charakterystyki i zrozumienia zmian fizjologicznych lub modeli chorobowych, a także do rozszerzenia na nowe obszary badawcze.

Protokół

Procedury opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu McGill zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC).

1. Kroki przygotowawcze

1. Rozwiązania:
   1. Metacholina: Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml i wykonać seryjne rozcieńczenia (1:1) w oparciu o stężenia, które mają być badane⁵. Pozwól, aby roztwory osiągnęły temperaturę pokojową przed nebulizacją⁵.
   2. Środki znieczulające: W literaturze opisano różne schematy leczenia u różnych szczepów myszy (Tabela 1). Uwaga: Schemat 1 był używany w ramach niniejszego protokołu.
2. Wyposażenie: Niniejszy protokół dotyczy jednej z dwóch generacji oprogramowania flexiVent obsługiwanych przez oprogramowanie flexiWare 7. Funkcje oprogramowania są pogrupowane w trzech modułach: Definicja i Planowanie Badania, Sesja Eksperymentalna oraz Przegląd i Raportowanie.
   1. Włącz system (tylko flexiVent FX) i/lub uruchom oprogramowanie.
   2. Podczas pierwszej sesji eksperymentalnej lub w dowolnym momencie przed nią otwórz moduł Definicja i Planowanie badania, aby wstępnie zdefiniować strukturę badania.
   3. Kliknij przycisk Utwórz nowe badanie i postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora, aby utworzyć badanie, nakreślić protokół i zdefiniować grupy eksperymentalne i osoby, które mają być badane.
   4. Rozpocznij sesję eksperymentalną, otwierając moduł Sesja eksperymentalna i postępując zgodnie z sekwencją początkową w celu wyboru badania i szablonu.
   5. Przypisz obiekt do miejsca pomiaru i potwierdź jego wagę.
   6. Kontynuuj kalibrację systemu, postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi w oprogramowaniu operacyjnym. W pewnym momencie zostaniesz poproszony o podłączenie kaniuli, która ma być używana (krok 1.3.3) do rurki Y w celu kalibracji.
   7. Krytyczny krok. Powtórzyć krok 1.2.6, jeśli uzyskane wartości kalibracji wykraczają poza dopuszczalny zakres. (Zapoznaj się z instrukcją obsługi flexiVent FX lub flexiWare 7, aby zapoznać się z dopuszczalnymi zakresami wartości kalibracji dla poszczególnych modułów).
   8. Anuluj monity o rozpoczęcie wentylacji i rejestrowania danych, chyba że wszystko jest gotowe do rozpoczęcia eksperymentu. Można je zainicjować w późniejszym terminie.
3. Tematy:
   1. Znieczulić pacjenta za pomocą odpowiednich dawek środków znieczulających (Tabela 1).
   2. Sprawdź, czy pacjent osiągnął chirurgiczny poziom znieczulenia. Pacjent nie powinien reagować na uszczypnięcie palca u nogi, a jego oddech powinien być regularny i nie powinien być ciężki.
   3. Wykonaj tracheotomię i kaniulację tchawicy.
      1. Połóż zwierzę na grzbiecie i zapewnij źródło ciepła (np. koc grzewczy o kontrolowanej temperaturze lub lampę z żarówką o mocy 60 W umieszczoną w odległości około 45 cm od myszy, aby uniknąć nadmiernego nagrzewania).
      2. Oczyść okolice gardła alkoholem i odsłoń tchawicę, wykonując nacięcie skóry i delikatnie oddzielając gruczoł podszczękowy i pokrywającą go warstwę mięśniową.
      3. Delikatnie unieś tchawicę za pomocą mikrokleszczy i przełóż pod nią szew
      .
      4. Przeciąć między dwoma pierścieniami chrząstki znajdującymi się najbliżej krtani, aby wykonać małe nacięcie w tchawicy bez jej cięcia.
      5. Włóż wcześniej skalibrowaną kaniulę do nacięcia i delikatnie wsuń ją do tchawicy na długość około 5 pierścieni. Uwaga: Obecne eksperymenty przeprowadzono przy użyciu metalowej kaniuli o długości 1,2 cm o rozmiarze 18.
      6. Krytyczny krok. Zamocuj kaniulę na miejscu za pomocą szwu. Nasadka powinna tworzyć hermetyczne uszczelnienie wokół kaniuli.

2. Wentylacja mechaniczna

1. Zbliż zwierzę do respiratora.
2. Wentylację mechaniczną można uruchomić, wybierając predefiniowany lub dostosowany profil wentylacji w oknie dokowanym wentylacji.
3. Podłącz zwierzę do respiratora za pomocą rurki Y.
4. Krytyczny krok. Ustawić zwierzę w stosunku do respiratora i upewnić się, że kaniula tchawicy znajduje się na tym samym poziomie co respirator, aby uniknąć możliwej niedrożności kaniuli lub skręcenia tchawicy.
5. Krok krytyczny. Wykonaj perturbację głębokiej inflacji, klikając dwukrotnie nazwę perturbacji, aby zweryfikować wprowadzenie i zamocowanie kaniuli. W przypadku braku nieszczelności system powinien być w stanie utrzymać ciśnienie 30 cmH₂O w okresie 3 sekund bez nadmiernego przemieszczenia objętości (rysunek 1). Zarejestrowane ślady objętości i ciśnienia powinny być również gładkie, bez oznak przesunięcia lub deformacji, ponieważ mogą one wskazywać na niedrożność lub niewłaściwe przemieszczenie kaniuli.
6. W razie potrzeby podłącz przetworniki parametrów życiowych do monitorowania tętna i temperatury ciała. Rejestrowanie danych może być zainicjowane ręcznie lub automatycznie za pomocą skryptu.

3. Pomiary funkcji płuc

Pomiary lub polecenia (np. aktywacja nebulizatora, znaczniki zdarzeń) mogą być zautomatyzowane za pomocą predefiniowanych lub dostosowanych skryptów dla wysoce kontrolowanego i powtarzalnego procesu eksperymentalnego (Rysunek 2). Sześć rodzin zaburzeń powodujących powstanie szeregu parametrów można wykorzystać do opisania mechaniki układu oddechowego na początku badania i po danym wyzwaniu (tab. 2).

1. Krytyczny krok. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia wykonywania pomiarów, przeprowadź głęboką inflację, aby zrekrutować zamknięte obszary płuc i ustandaryzować historię objętości płuc.
2. Krytyczny krok. Sprawdź, czy nie ma spontanicznych wysiłków wdechowych, przeprowadzając pomiar testowy (np. PVs-P lub PVs-V). Obserwuj ślady sygnału ciśnienia w widoku Wybrany zestaw danych. W przypadku stopniowych krzywych PV płaskowyże ciśnienia powinny być dobrze zdefiniowane, bez odchyleń w dół. Spadek ciśnienia wskazywałby na wysiłek wdechowy zwierzęcia (ryc. 3).
3. Uruchom wybrany skrypt, klikając dwukrotnie na jego tytuł. Skrypty wykorzystane w niniejszym badaniu obejmowały na ogół pomiary:
   • Sekwencja pomiarów podstawowych w trzech egzemplarzach.
   • Aktywacja nebulizatora w celu oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę. Uwaga: Po wyświetleniu monitu przez system załadować do nebulizatora około 100 μl soli fizjologicznej lub roztworu metacholiny. Nebulizacja rozpocznie się i zatrzyma automatycznie.
   • Sekwencja pomiarów w krótkich odstępach czasu (co 10-15 sekund) przez okres około 3 minut po aktywacji nebulizatora.
   • Monit o wykonanie kolejnego wyzwania i powtórzenie sekwencji pomiarów. nuta: Osuszenie wnętrza uchwytu nebulizatora za pomocą wacika między wyzwaniami może pomóc w zapobieganiu gromadzeniu się kropelek lub kondensatu w przewodzie wdechowym.
4. Pod koniec eksperymentu zatrzymaj wentylację i odłącz obiekt.
5. Przełącz się na następny temat w oprogramowaniu operacyjnym i potwierdź jego wagę.
6. Krytyczny krok. Wypłucz i wysusz nebulizator, adapter, rurkę Y i kaniulę między pacjentami.
7. Powtórz kroki od 1.2.6 do 3.6.
8. Na koniec dnia zamknij sesję eksperymentalną. Należy pamiętać o wypłukaniu i osuszeniu nebulizatora, adaptera, rurki Y i kaniuli oraz oczyszczeniu zaworu wydechowego systemu przed opuszczeniem laboratorium, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

4. Analiza danych

Oprogramowanie automatycznie oblicza i wyświetla parametry związane z zakłóceniami. Zapewnia również współczynnik determinacji (ChZT), który odzwierciedla dopasowanie modelu matematycznego do danych. Każdy zbiór danych z niewystarczającym ChZT jest oznaczony przez oprogramowanie jako wykluczony. Przegląd sesji eksperymentalnych, ponowna analiza danych i tworzenie scenariuszy eksportu odbywa się w module Review & Reporting oprogramowania.

1. Otwórz moduł Review & Reporting (Przegląd i raportowanie) i utwórz scenariusz eksportu, zwracając uwagę na to, aby uwzględnić tylko zestawy danych o wystarczającym COD.
2. W razie potrzeby eksportuj parametry, krzywą ciśnienia lub przepływu-objętości, surowe sygnały zestawu danych lub informacje o temacie do aplikacji arkusza kalkulacyjnego (patrz tabela 3).
3. Średnie pomiary podstawowe dla każdego parametru i wykreślić wszystkie pomiary w funkcji czasu (zob. rysunek 4). Następnie można obliczyć obszar pod krzywą, przeanalizować ogólny profil krzywych lub przeprowadzić analizę statystyczną.
4. Aby wyrazić wyniki reakcji dróg oddechowych w funkcji stężenia metacholiny, należy określić dla każdego uczestnika, parametru i warunku doświadczalnego określony punkt (np. szczyt) lub określony czas po każdym prowokacji metacholiną. Obliczyć średnie grupowe i przedstawić lub wykreślić wyniki dla każdego warunku doświadczalnego (Tabela 4, Rysunek 5).
5. Można również rozważyć obliczenie stężenia, co daje podwojenie danej wartości podstawowej parametru (PC₂₀₀; Rysunek 5C), stosując normalizację (np. % wartości wyjściowej) lub przeprowadzając analizę statystyczną.

Wyniki

Pomiary mechaniki układu oddechowego. Tabela 4 przedstawia typowe wyniki dotyczące wcześniej nieleczonych myszy A/J uzyskanych na początku badania i po zwężeniu oskrzeli wywołanym metacholiną (12,5 mg/ml) przy użyciu jednej z dwóch generacji flexiVent obsługiwanych przez oprogramowanie flexiWare 7. Mechanikę układu oddechowego, tj. w warunkach zamkniętej klatki piersiowej, oceniano poprzez naprzemienne zaburzenia rodziny oscylacji wymuszonych o pojedynczej i szerokopasmowej częstotliwości w ściśle rozmieszczonych odstępach czasu (odpowiednio SnapShot-150, Quick Prime-3). Ponieważ wentylacja jest wstrzymywana podczas pomiarów, wybrano Quick Prime-3, który obejmuje podobny zakres częstotliwości jak Prime-8, ale ma krótszy czas trwania (3 vs 8 sekund), w celu skrócenia okresu bezdechu, zminimalizowania wpływu zaburzeń na gazometrię krwi i zapewnienia lepszej rozdzielczości odpowiedzi. Parametry związane z każdą perturbacją były obliczane automatycznie przez oprogramowanie operacyjne. Wyniki pokazują, że dwie generacje systemu flexiVent dostarczyły równoważnych pomiarów mechaniki oddechowej.

Miejsce reakcji płuc. Wyróżnienie miejsca odpowiedzi płuc pozwala badaczowi na dokładniejsze wskazanie dotkniętych regionów, a także na zidentyfikowanie potencjalnych punktów interwencji farmakologicznej⁶. Na przykład naiwne myszy A/J wykazują wzrost odporności wyjściowej, gdy końcowe ciśnienie wydechowe, przeciwko któremu wykonywane są pomiary, wzrasta z 3 do 9 cmH₂O (Rysunek 6A, SnapShot-150). W niniejszym przykładzie zastosowanie szerokopasmowych pomiarów FOT (Quick Prime-3) dostarczyło szczegółów wyjaśniających podstawę zmiany oporności: Zmiana końcowego ciśnienia wydechowego spowodowała spadek oporu dróg oddechowych (R_N) zgodny z rozszerzającym oskrzela działaniem większej objętości płuc i większego ciśnienia napompowania (Figura 6D) oraz wzrostem tłumienia tkanek (G; Ryc. 6E), parametr ściśle związany z oporem tkanek, który odzwierciedla lepkosprężystość tkanek i ewentualnie opór małych dróg oddechowych⁷. Wiadomo, że ten ostatni zwiększa się wraz ze wzrostem objętości płuc.

Nadreaktywność dróg oddechowych. Po ekspozycji na chlor gazowy reakcja dróg oddechowych na wdychaną metacholinę wzrasta w porównaniu z ekspozycją na powietrze u myszy Balb/c w wyniku uszkodzenia dróg oddechowych⁴ (ryc. 2). Wiadomo, że chlor indukuje stres oksydacyjny, prowadząc do niszczenia komórek strukturalnych dróg oddechowych, w szczególności komórek nabłonkowych, i indukuje rekrutację komórek zapalnych. Jak pokazano na rycinie 5, zmiany we wszystkich parametrach opisujących mechanikę układu oddechowego można zaobserwować w odpowiedzi na rosnące wyzwania związane z metacholiną. W porównaniu z myszami wystawionymi na działanie powietrza, myszy wystawione na działanie chloru gazowego wykazywały większe maksymalne odpowiedzi przy wszystkich parametrach FOT (Figura 5A, 5B, 5D-5F), a także statystycznie istotne przesunięcie krzywej stężenie-odpowiedź w lewo, czego przykładem jest zmniejszenie stężenia metacholiny wymagane do spowodowania podwojenia odporności i elastancji (PC₂₀₀; Rysunek 5C). Wyniki te ilustrują, odpowiednio, nadreaktywność dróg oddechowych i nadwrażliwość na wdychaną metacholinę po ekspozycji na chlor gazowy.

Inne pomiary. Oprócz FOT, system flexiVent może być również używany do zbierania innych rodzajów pomiarów funkcji płuc^8-10 lub układu sercowo-naczyniowego¹¹. Rysunek 7 przedstawia reprezentatywną krokową, sterowaną ciśnieniem krzywą ciśnienia i objętości u naiwnych myszy A/J w warunkach wyjściowych. Górna część kończyny deflacyjnej krzywej jest dopasowana do równania Salazara-Knowlesa¹², a parametry są automatycznie obliczane przez oprogramowanie.

Tabela 1. Przykłady schematów znieczulania stosowanych u myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą tabelę.

Tabela 2. Perturbacje stosowane do pomiarów czynności płuc u myszy. *Wymagane rozszerzenie systemu. Pacjent musi również znajdować się w zamkniętej komorze pletyzmografu podczas pomiarów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą tabelę.

Tabela 3. Przykład wyeksportowanych parametrów z rodzin perturbacji oscylacji wymuszonych o częstotliwości pojedynczej i szerokopasmowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą tabelę.

Tabela 4. Porównanie systemów. Porównanie parametrów mechaniki płuc zebranych przy użyciu dwóch generacji systemu flexiVent obsługiwanego przez oprogramowanie flexiWare 7. Wyniki uzyskano u wcześniej nieleczonych myszy A/J (n = 5 / grupa) na początku badania i po zwężeniu oskrzeli wywołanym metacholiną (Mch 12,5 mg / ml). *Grupy porównano przy użyciu dwukierunkowej ANOVA dla powtarzanych pomiarów i logarytmu₁₀ indywidualnych odpowiedzi dla jednorodności wariancji (GraphPad Prism, wersja 5.03; GraphPad Software, San Diego, Stany Zjednoczone).

Rysunek 1. Zrzut ekranu przedstawiający głębokie napompowanie płuc. Górny panel pokazuje objętość przemieszczoną przez tłok wentylatora (czerwony ślad) oraz objętość dostarczoną do pacjenta (szary ślad). Dolny panel wyświetla ciśnienie w butli wzrastające do ustawionego ciśnienia 30_cmH2O w ciągu 3 sekund i utrzymywane na stałym poziomie przez ten sam okres czasu.

Rysunek 2. Przykład typowego skryptu używanego do oceny mechaniki układu oddechowego na początku badania.

Rysunek 3. Spontaniczne wysiłki wdechowe podczas wykonywania krokowej krzywej ciśnienie-objętość.

Rysunek 4. Reakcja w czasie po nasileniu się prowokacji wziewnej metacholiny. Wyniki są wyrażone jako średnia (± odchylenie standardowe) grupy 5 naiwnych, spontanicznie nadreaktywnych myszy A / J. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 5. Zmiany w mechanice układu oddechowego po rosnących wyzwaniach związanych z metacholiną u myszy Balb/c wystawionych na działanie chloru i powietrza. Wartość szczytową określono dla każdego parametru w każdym badanym i warunku eksperymentalnym. Następnie obliczono średnie grupowe (średnia ± odchylenie standardowe; n=4-6). Różnice między grupami oceniano za pomocą analizy wariancji przy użyciu logarytmu₁₀ indywidualnych odpowiedzi dla jednorodności wariancji. Stężenie metacholiny powodujące podwojenie wartości podstawowej (PC₂₀₀) uzyskano poprzez dopasowanie wielomianu drugiego rzędu do poszczególnych krzywych dawka-odpowiedź i interpolację dopasowanej krzywej. Brakuje punktów danych w D, E i F u myszy narażonych na działanie chloru przy dwóch najwyższych stężeniach metacholiny z powodu niewystarczająco wysokich współczynników determinacji, co odzwierciedla słabe dopasowanie modelu matematycznego do danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 6. Podział odpowiedzi oddechowej na mechanikę dróg oddechowych i tkanki płucnej. Eksperymentalny ślad od naiwnych myszy A/J ilustrujący pomiary wymuszonych oscylacji pojedynczej (2,5 Hz) i szerokopasmowej (1-20,5 Hz) częstotliwości mechaniki oddechowej w trzech powtórzeniach przy dwóch różnych końcowych ciśnieniach wydechowych (3 i 9 cmH₂O). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 7. Krzywa ciśnienie-objętość u nieleczonych myszy A/J w warunkach wyjściowych. Krzywe ciśnienia i objętości zostały wygenerowane przy użyciu krokowych zaburzeń sterowanych ciśnieniem (PVs-P), aby zapewnić, że każde płuco myszy zostało napompowane do tego samego ciśnienia, niezależnie od ich stanu. Parametry równania Salazara-Knowlesa wyodrębnione z poszczególnych krzywych ciśnienie-objętość zostały również uśrednione i przedstawione w formie tabeli. Wyniki są wyrażone jako średnia ± odchylenie standardowe (n=6).

Dyskusja

Nieustanne badania nad dysfunkcją dróg oddechowych w odniesieniu do astmy i innych chorób płuc mają zasadnicze znaczenie dla zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw choroby i opracowania opcji leczenia. Wykorzystanie myszy do modelowania chorób dróg oddechowych miało zasadnicze znaczenie dla zrozumienia tych mechanizmów chorobowych. Rozważając ocenę dysfunkcji dróg oddechowych u osoby tak małej jak mysz, posiadanie wiarygodnych i dokładnych narzędzi do pomiaru czynności płuc ma kluczowe znaczenie. Ponadto nieocenione jest posiadanie narzędzi, które mogą dostarczyć informacji na temat lokalizacji dysfunkcji dróg oddechowych lub efektu terapeutycznego. Technika FOT łączy w sobie wszystkie te atrybuty i zapewnia silne, integracyjne i translacyjne podejście do oceny zmian fizjologicznych.

Aby odnieść sukces w tego typu pomiarze u myszy, należy zwrócić szczególną uwagę na kilka kroków, a mianowicie kalibrację systemu, rezystancję kaniuli dotchawiczej, rodzaj nebulizatora (a także jego ustawienia pracy), ułożenie zwierzęcia oraz standaryzację historii objętości płuc. Ponadto, w celu uzyskania prawidłowych zbiorów danych, konieczne jest, aby układ oddechowy badanego pozostał bierny podczas pomiarów. Można to osiągnąć poprzez podanie środka paraliżującego mięśnie, działającego w głębokim znieczuleniu lub poprzez hiperwentylację pacjenta w celu wywołania bezdechu (patrz Tabela 1). Badacze mogą zacząć od opanowania systemu i jego oprogramowania operacyjnego, w razie potrzeby, z obciążeniami testowymi, jednocześnie nabywając umiejętności niezbędne do pomiarów na myszach. Logiczne byłoby zatem wygenerowanie powtarzalnych wyników u naiwnych zwierząt przed przejściem do modeli choroby lub leczonych myszy. Ponieważ znaczna część modeli chorób w badaniach układu oddechowego wiąże się z narażeniem zwierząt na czynniki takie jak alergeny, toksyny, zanieczyszczenia, dym papierosowy lub gazy, na zmienność wyników uzyskanych za pomocą techniki pomiarowej opisanej w tym artykule może mieć wpływ zastosowana procedura narażenia. Standaryzacja kluczowych procesów eksperymentalnych (np. z wykorzystaniem sterowanych komputerowo systemów ekspozycji i pomiarów^{6, 13, 14}) może potencjalnie mieć znaczący wpływ na zmniejszenie zmienności.

Przykłady przedstawione w tym artykule reprezentują wybór typowych wyników eksperymentów na myszach naiwnych i narażonych na działanie chloru, podkreślając jednocześnie mocne strony, jak i ograniczenia tej techniki. Jak widać na przykład na rysunku 6, technika ta jest w stanie generować powtarzalne pomiary czynności płuc. Podczas gdy podobne wyjściowe wartości oporności zgłaszano między szczepami myszy, zaobserwowano jednak różnice w elastancji¹⁵. Należy również spodziewać się znacznych zmian między niemowlętami i dorosłymi myszami¹⁶. Jeśli chodzi o inne oceny fizjologiczne in vivo , wyniki o wysokiej precyzji, takie jak te generowane przez FOT, wiążą się z ustępstwem co do naturalnego stanu badanych. Zasada ta, określana^{jako zasada} niepewności fenotypowania1, ma zastosowanie do niniejszego protokołu w tym sensie, że pomiary muszą być wykonywane u osób znieczulonych, tracheotomowych (lub zaintubowanych doustnie) i wentylowanych mechanicznie. Inne ograniczenie tej techniki można zaobserwować na rysunku 5D-5F , gdzie dane nie są dostępne dla najwyższych stężeń dla grupy narażonej na chlor, ponieważ dopasowanie modelu stałej fazy do danych jest słabe powyżej umiarkowanych poziomów zwężenia oskrzeli. Jednak zwierzęta z poważnym zwężeniem oskrzeli można ocenić, analizując Zrs^{bezpośrednio 15} lub używając oprogramowania do analizy końcowej innej firmy w celu dopasowania bardziej złożonych modeli matematycznych, np . biorąc pod uwagę niejednorodność funkcji mechanicznych¹⁷. Wykluczone zestawy danych można również zaobserwować, jeśli drogi oddechowe zwierzęcia nie są wystarczająco bierne lub jeśli opór kaniuli jest zbyt wysoki. Z reguły opór kaniuli nie powinien przekraczać oporu zwierzęcia na początku badania. Praca z kaniulą o większej średnicy wewnętrznej i/lub krótszej długości pomoże zmniejszyć opór kaniuli. Wreszcie, obecna demonstracja pomiarów FOT u myszy może być postrzegana jako czasochłonna, a zatem mniej wydajna metodologia lub mniej przydatna w badaniach podłużnych w porównaniu z mniej inwazyjnymi technikami. Jednak te ostatnie wiążą się z dużą niepewnością co do podstawy ich wyników i są postrzegane przez wielu jako wadliwe¹. Powtarzające się pomiary inwazyjne są możliwe u zwierząt zaintubowanych doustnie, chociaż są one trudniejsze technicznie¹⁷.

Na podstawie podanych przykładów wyniki wykazały równoważność dwóch generacji systemu flexiVent w wykonywaniu pomiarów mechaniki układu oddechowego, a także nadreaktywności dróg oddechowych i nadwrażliwości na wdychaną metacholinę po ekspozycji na chlor u myszy. Szczegółowy aspekt pomiarowy związany z tą techniką, stosowany do scharakteryzowania lub zrozumienia zmian fizjologicznych lub modeli chorób, może przyczynić się do poszerzenia obecnego stanu wiedzy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ODCZYNNIKI
Acetyl-β-metylocholiny	chlorek Sigma-Aldrich	A-2251	Kleszczyki Micro-Adson do metacholiny
, ząbkowane 12 cm	Fine Science Tools	11018-12
Kleszcze Moria MC31, ząbkowane, zakrzywione	Fine Science Tools	11370-31
Nożyczki do irysów, twarde, proste 11,5 cm	Fine Science Tools	14058-11
Nożyczki sprężynowe-Ostrza 2,5 mm, proste	Fine Science Tools	15000-08
Niesterylna igła (18g x ½ ")	Brico Zaopatrzenie Medyczne Inc.	BN1805	Kaniula dotchawicza
Niesterylny szew jedwabny 5-0	Seraflex	IDI58000
Roztwór buforowany fosforanem	Gibco	14190-144
15 ml probówki stożkowe	Starstedt	SS-4001
1 ml strzykawki TB	Becton Dickinson	309626
200 μ l końcówki filtrów	Biosphere	70.760.211
EQUIPMENT
flexiVent FX	SCIREQ Inc.	sales@scireq.com	www.scireq.com
nebulizator	Aerogen Aeroneb SCIREQ Inc.	sales@scireq.com	www.scireq.com