Niniejszy protokół zawiera szczegółowy opis krok po kroku procedur wymaganych do wykonania pomiarów mechaniki układu oddechowego, jak również oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Kanada).
Artykuł metodologiczny
Ocena mechaniki układu oddechowego u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Technika wymuszonej oscylacji (FOT) jest potężnym, integracyjnym i translacyjnym narzędziem pozwalającym na eksperymentalną ocenę funkcji płuc u myszy w sposób kompleksowy, szczegółowy, precyzyjny i powtarzalny. Zapewnia pomiary mechaniki układu oddechowego poprzez analizę sygnałów ciśnienia i objętości uzyskanych w reakcji na predefiniowane, oscylacyjne przebiegi przepływu powietrza o małej amplitudzie, które są zwykle stosowane przy ujściu dróg oddechowych pacjenta. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje kroki wymagane do odpowiedniego wykonania pomiarów wymuszonych oscylacji u myszy przy użyciu sterowanego komputerowo wentylatora tłokowego (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Kanada). Opis podzielony jest na cztery części: etapy przygotowawcze, wentylacja mechaniczna, pomiary czynności płuc i analiza danych. Zawiera również szczegółowe informacje na temat oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę u znieczulonych myszy, co jest powszechnym zastosowaniem tej techniki, które rozciąga się również na inne wyniki i różne patologie płuc. Pomiary uzyskane na myszach naiwnych, a także z modelu uszkodzenia dróg oddechowych opartego na stresie oksydacyjnym przedstawiono w celu zilustrowania, w jaki sposób narzędzie to może przyczynić się do lepszej charakterystyki i zrozumienia badanych zmian fizjologicznych lub modeli chorób, a także do zastosowań w nowych obszarach badawczych.
Wprowadzenie
Odpowiednia charakterystyka właściwości mechanicznych płuc u małych zwierząt stała się niezbędna od czasu rozkwitu mysich modeli w naukach o oddychaniu. Pomiary te, wykonywane przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji (FOT), techniki stosowanej również u ludzi, zapewniają potężne, integracyjne i translacyjne podejście do badania znaczących zmian fizjologicznych. Pomiary FOT są zwykle uzyskiwane poprzez analizę sygnałów ciśnienia i objętości uzyskanych w reakcji na wstępnie zdefiniowany, oscylacyjny przebieg przepływu powietrza o małej amplitudzie (określany również jako perturbacja lub sygnał wejściowy) zastosowany do ujścia dróg oddechowych pacjenta1. W najprostszej formie perturbacja FOT byłaby pojedynczym przebiegiem sinusoidalnym o dobrze zdefiniowanej częstotliwości. Bardziej złożone perturbacje zazwyczaj polegają na nałożeniu na siebie wybranych określonych (wzajemnie pierwotnych) przebiegów częstotliwości obejmujących szerokie spektrum. Dekompozycja wieloczęstotliwościowych sygnałów wejściowych i wyjściowych na ich składowe za pomocą transformaty Fouriera pozwala na obliczenie impedancji wejściowej układu oddechowego (Zrs), czyli funkcji przenoszenia pomiędzy sygnałami wejściowymi i wyjściowymi, przy każdej częstotliwości wchodzącej w skład perturbacji2. W związku z tym FOT pozwala na jednoczesną ocenę mechaniki oddechowej w zakresie częstotliwości podczas jednego manewru2. Dopasowanie zaawansowanych modeli matematycznych (np. modelu stałofazowego3) do danych dotyczących impedancji pozwala na podział odpowiedzi na parametry zależne od dróg oddechowych (centralnych i obwodowych) oraz miąższu tkanki płuc1, 3. Ponieważ wiele czynników wpływających na reakcję fizjologiczną (np. częstotliwość oddychania, objętość oddechowa, objętość płuc, górne drogi oddechowe, spontaniczne wysiłki oddechowe, czas pomiarów) jest kontrolowanych i standaryzowanych przez system pomiarowy i procedury eksperymentalne,1 technika ta jest w stanie generować precyzyjne i powtarzalne pomiary, pod warunkiem, że jest wykonywana prawidłowo. Celem tego artykułu jest szczegółowy, chronologiczny opis procedury potrzebnej do wykonania takich pomiarów u myszy. Protokół składa się z czterech części: etapów przygotowawczych (odczynniki, sprzęt i badani), wentylacji mechanicznej, pomiarów czynności płuc i analizy danych. Przedstawiono przykłady reprezentatywnych wyników mechaniki układu oddechowego uzyskanych przy użyciu wentylatora tłokowego sterowanego komputerowo (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Kanada). Uzyskano je od naiwnych myszy, a także z opartego na stresie oksydacyjnym modelu uszkodzenia dróg oddechowych charakteryzującego się zapaleniem dróg oddechowych, uszkodzeniem komórek nabłonka i zwiększoną reakcją dróg oddechowych na wdychaną metachilinę w aerozolu4. Chociaż protokół ten jest często stosowany do oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę, rozciąga się na inne wyniki i różne patologie, w tym astmę, przewlekłą obturacyjną chorobę płuc (POChP), rozedmę płuc, zwłóknienie płuc, uszkodzenie płuc, a także transgeniczne mysie modele patologii podobnych do choroby ludzkiej. Wyniki badań przeprowadzonych z wykorzystaniem tego narzędzia mogą przyczynić się do lepszej charakterystyki i zrozumienia zmian fizjologicznych lub modeli chorobowych, a także do rozszerzenia na nowe obszary badawcze.
Protokół
Procedury opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu McGill zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC).
1. Kroki przygotowawcze
- Rozwiązania:
- Metacholina: Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml i wykonać seryjne rozcieńczenia (1:1) w oparciu o stężenia, które mają być badane5. Pozwól, aby roztwory osiągnęły temperaturę pokojową przed nebulizacją5.
- Środki znieczulające: W literaturze opisano różne schematy leczenia u różnych szczepów myszy (Tabela 1). Uwaga: Schemat 1 był używany w ramach niniejszego protokołu.
- Wyposażenie: Niniejszy protokół dotyczy jednej z dwóch generacji oprogramowania flexiVent obsługiwanych przez oprogramowanie flexiWare 7. Funkcje oprogramowania są pogrupowane w trzech modułach: Definicja i Planowanie Badania, Sesja Eksperymentalna oraz Przegląd i Raportowanie.
- Włącz system (tylko flexiVent FX) i/lub uruchom oprogramowanie.
- Podczas pierwszej sesji eksperymentalnej lub w dowolnym momencie przed nią otwórz moduł Definicja i Planowanie badania, aby wstępnie zdefiniować strukturę badania.
- Kliknij przycisk Utwórz nowe badanie i postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora, aby utworzyć badanie, nakreślić protokół i zdefiniować grupy eksperymentalne i osoby, które mają być badane.
- Rozpocznij sesję eksperymentalną, otwierając moduł Sesja eksperymentalna i postępując zgodnie z sekwencją początkową w celu wyboru badania i szablonu.
- Przypisz obiekt do miejsca pomiaru i potwierdź jego wagę.
- Kontynuuj kalibrację systemu, postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi w oprogramowaniu operacyjnym. W pewnym momencie zostaniesz poproszony o podłączenie kaniuli, która ma być używana (krok 1.3.3) do rurki Y w celu kalibracji.
- Krytyczny krok. Powtórzyć krok 1.2.6, jeśli uzyskane wartości kalibracji wykraczają poza dopuszczalny zakres. (Zapoznaj się z instrukcją obsługi flexiVent FX lub flexiWare 7, aby zapoznać się z dopuszczalnymi zakresami wartości kalibracji dla poszczególnych modułów).
- Anuluj monity o rozpoczęcie wentylacji i rejestrowania danych, chyba że wszystko jest gotowe do rozpoczęcia eksperymentu. Można je zainicjować w późniejszym terminie.
- Tematy:
- Znieczulić pacjenta za pomocą odpowiednich dawek środków znieczulających (Tabela 1).
- Sprawdź, czy pacjent osiągnął chirurgiczny poziom znieczulenia. Pacjent nie powinien reagować na uszczypnięcie palca u nogi, a jego oddech powinien być regularny i nie powinien być ciężki.
- Wykonaj tracheotomię i kaniulację tchawicy.
- Połóż zwierzę na grzbiecie i zapewnij źródło ciepła (np. koc grzewczy o kontrolowanej temperaturze lub lampę z żarówką o mocy 60 W umieszczoną w odległości około 45 cm od myszy, aby uniknąć nadmiernego nagrzewania).
- Oczyść okolice gardła alkoholem i odsłoń tchawicę, wykonując nacięcie skóry i delikatnie oddzielając gruczoł podszczękowy i pokrywającą go warstwę mięśniową.
- Delikatnie unieś tchawicę za pomocą mikrokleszczy i przełóż pod nią szew .
- Przeciąć między dwoma pierścieniami chrząstki znajdującymi się najbliżej krtani, aby wykonać małe nacięcie w tchawicy bez jej cięcia.
- Włóż wcześniej skalibrowaną kaniulę do nacięcia i delikatnie wsuń ją do tchawicy na długość około 5 pierścieni. Uwaga: Obecne eksperymenty przeprowadzono przy użyciu metalowej kaniuli o długości 1,2 cm o rozmiarze 18.
- Krytyczny krok. Zamocuj kaniulę na miejscu za pomocą szwu. Nasadka powinna tworzyć hermetyczne uszczelnienie wokół kaniuli.
2. Wentylacja mechaniczna
- Zbliż zwierzę do respiratora.
- Wentylację mechaniczną można uruchomić, wybierając predefiniowany lub dostosowany profil wentylacji w oknie dokowanym wentylacji.
- Podłącz zwierzę do respiratora za pomocą rurki Y.
- Krytyczny krok. Ustawić zwierzę w stosunku do respiratora i upewnić się, że kaniula tchawicy znajduje się na tym samym poziomie co respirator, aby uniknąć możliwej niedrożności kaniuli lub skręcenia tchawicy.
- Krok krytyczny. Wykonaj perturbację głębokiej inflacji, klikając dwukrotnie nazwę perturbacji, aby zweryfikować wprowadzenie i zamocowanie kaniuli. W przypadku braku nieszczelności system powinien być w stanie utrzymać ciśnienie 30 cmH2O w okresie 3 sekund bez nadmiernego przemieszczenia objętości (rysunek 1). Zarejestrowane ślady objętości i ciśnienia powinny być również gładkie, bez oznak przesunięcia lub deformacji, ponieważ mogą one wskazywać na niedrożność lub niewłaściwe przemieszczenie kaniuli.
- W razie potrzeby podłącz przetworniki parametrów życiowych do monitorowania tętna i temperatury ciała. Rejestrowanie danych może być zainicjowane ręcznie lub automatycznie za pomocą skryptu.
3. Pomiary funkcji płuc
Pomiary lub polecenia (np. aktywacja nebulizatora, znaczniki zdarzeń) mogą być zautomatyzowane za pomocą predefiniowanych lub dostosowanych skryptów dla wysoce kontrolowanego i powtarzalnego procesu eksperymentalnego (Rysunek 2). Sześć rodzin zaburzeń powodujących powstanie szeregu parametrów można wykorzystać do opisania mechaniki układu oddechowego na początku badania i po danym wyzwaniu (tab. 2).
- Krytyczny krok. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia wykonywania pomiarów, przeprowadź głęboką inflację, aby zrekrutować zamknięte obszary płuc i ustandaryzować historię objętości płuc.
- Krytyczny krok. Sprawdź, czy nie ma spontanicznych wysiłków wdechowych, przeprowadzając pomiar testowy (np. PVs-P lub PVs-V). Obserwuj ślady sygnału ciśnienia w widoku Wybrany zestaw danych. W przypadku stopniowych krzywych PV płaskowyże ciśnienia powinny być dobrze zdefiniowane, bez odchyleń w dół. Spadek ciśnienia wskazywałby na wysiłek wdechowy zwierzęcia (ryc. 3).
- Uruchom wybrany skrypt, klikając dwukrotnie na jego tytuł. Skrypty wykorzystane w niniejszym badaniu obejmowały na ogół pomiary:
- Sekwencja pomiarów podstawowych w trzech egzemplarzach.
- Aktywacja nebulizatora w celu oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę. Uwaga: Po wyświetleniu monitu przez system załadować do nebulizatora około 100 μl soli fizjologicznej lub roztworu metacholiny. Nebulizacja rozpocznie się i zatrzyma automatycznie.
- Sekwencja pomiarów w krótkich odstępach czasu (co 10-15 sekund) przez okres około 3 minut po aktywacji nebulizatora.
- Monit o wykonanie kolejnego wyzwania i powtórzenie sekwencji pomiarów. nuta: Osuszenie wnętrza uchwytu nebulizatora za pomocą wacika między wyzwaniami może pomóc w zapobieganiu gromadzeniu się kropelek lub kondensatu w przewodzie wdechowym.
- Pod koniec eksperymentu zatrzymaj wentylację i odłącz obiekt.
- Przełącz się na następny temat w oprogramowaniu operacyjnym i potwierdź jego wagę.
- Krytyczny krok. Wypłucz i wysusz nebulizator, adapter, rurkę Y i kaniulę między pacjentami.
- Powtórz kroki od 1.2.6 do 3.6.
- Na koniec dnia zamknij sesję eksperymentalną. Należy pamiętać o wypłukaniu i osuszeniu nebulizatora, adaptera, rurki Y i kaniuli oraz oczyszczeniu zaworu wydechowego systemu przed opuszczeniem laboratorium, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Analiza danych
Oprogramowanie automatycznie oblicza i wyświetla parametry związane z zakłóceniami. Zapewnia również współczynnik determinacji (ChZT), który odzwierciedla dopasowanie modelu matematycznego do danych. Każdy zbiór danych z niewystarczającym ChZT jest oznaczony przez oprogramowanie jako wykluczony. Przegląd sesji eksperymentalnych, ponowna analiza danych i tworzenie scenariuszy eksportu odbywa się w module Review & Reporting oprogramowania.
- Otwórz moduł Review & Reporting (Przegląd i raportowanie) i utwórz scenariusz eksportu, zwracając uwagę na to, aby uwzględnić tylko zestawy danych o wystarczającym COD.
- W razie potrzeby eksportuj parametry, krzywą ciśnienia lub przepływu-objętości, surowe sygnały zestawu danych lub informacje o temacie do aplikacji arkusza kalkulacyjnego (patrz tabela 3).
- Średnie pomiary podstawowe dla każdego parametru i wykreślić wszystkie pomiary w funkcji czasu (zob. rysunek 4). Następnie można obliczyć obszar pod krzywą, przeanalizować ogólny profil krzywych lub przeprowadzić analizę statystyczną.
- Aby wyrazić wyniki reakcji dróg oddechowych w funkcji stężenia metacholiny, należy określić dla każdego uczestnika, parametru i warunku doświadczalnego określony punkt (np. szczyt) lub określony czas po każdym prowokacji metacholiną. Obliczyć średnie grupowe i przedstawić lub wykreślić wyniki dla każdego warunku doświadczalnego (Tabela 4, Rysunek 5).
- Można również rozważyć obliczenie stężenia, co daje podwojenie danej wartości podstawowej parametru (PC200; Rysunek 5C), stosując normalizację (np. % wartości wyjściowej) lub przeprowadzając analizę statystyczną.
Wyniki
Pomiary mechaniki układu oddechowego. Tabela 4 przedstawia typowe wyniki uzyskane od naiwnych myszy A/J w stanie spoczynkowym oraz po wywołanym metacholiną skurczu oskrzeli (12,5 mg/ml), przy użyciu jednej z dwóch generacji systemu flexiVent wspieranego przez oprogramowanie flexiWare 7. Mechanikę układu oddechowego, t.j. w warunkach zamkniętej klatki piersiowej, oceniano poprzez naprzemienne zaburzenia pojedynczej i szerokopasmowej rodziny wymuszonych oscylacji o częstotliwościach w krótkich odstępach czasu (odpowiednio SnapShot-150, Quick Prime-3). Ponieważ podczas pomiarów wentylacja zostaje wstrzymana, wybrano Quick Prime-3, który obejmuje podobny zakres częstotliwości co Prime-8, ale ma krótszy czas trwania (3 vs 8 s), aby skrócić okres bezdechu, zminimalizować wpływ zaburzenia na gazy krwi i zapewnić lepszą rozdzielczość odpowiedzi. Parametry związane z każdym zaburzeniem były obliczane automatycznie przez oprogramowanie sterujące. Wyniki pokazują, że dwie generacje systemu flexiVent dostarczyły równoważnych pomiarów mechaniki oddechowej.
Miejsce odpowiedzi płuc. Rozróżnienie miejsca odpowiedzi płuc pozwala badaczowi na dokładniejsze wskazanie dotkniętych obszarów, a także na zidentyfikowanie potencjalnych punktów interwencji farmakologicznej6. Na przykład u naiwnych myszy A/J obserwuje się wzrost podstawowego oporu, gdy ciśnienie końcowowydechowe, względem którego wykonywane są pomiary, wzrasta z 3 do 9 cmH2O (Rysunek 6A, SnapShot-150). W niniejszym przykładzie zastosowanie szerokopasmowych pomiarów FOT (Quick Prime-3) dostarczyło szczegółów wyjaśniających podstawę zmiany oporu: zmiana ciśnienia końcowowydechowego doprowadziła do zmniejszenia oporu dróg oddechowych (RN), co jest zgodne z efektami rozszerzenia oskrzeli przy wyższej objętości płuc i większym ciśnieniu nadmuchania (Rysunek 6D), oraz do zwiększenia tłumienia tkanek (G; Rysunek 6E) – parametru ściśle związanego z oporem tkanek, który odzwierciedla lepko-sprężystość tkanek i prawdopodobnie opór małych dróg oddechowych7. Wiadomo, że ten ostatni wzrasta wraz ze wzrostem objętości płuc.
Nadreaktywność dróg oddechowych. W następstwie ekspozycji na chlor, reaktywność dróg oddechowych na wziewaną metacholinę u myszy Balb/c wzrasta w porównaniu do ekspozycji na powietrze w wyniku uszkodzenia dróg oddechowych4 (Rycina 2). Znane jest, że chlor indukuje stres oksydacyjny, prowadząc do zniszczenia komórek strukturalnych w drogach oddechowych, w szczególności komórek nabłonkowych, oraz indukując rekrutację komórek zapalnych. Jak przedstawiono na Rycini 5, w odpowiedzi na zwiększające się dawki metacholiny widoczne są zmiany we wszystkich parametrach opisujących mechanikę układu oddechowego. W porównaniu z myszami eksponowanymi na powietrze, myszy eksponowane na chlor wykazały większe odpowiedzi maksymalne dla wszystkich parametrów FOT (Rycina 5A, 5B, 5D-5F), a także statystycznie istotne przesunięcie krzywej koncentracja-odpowiedź w lewo, czego przykładem jest zmniejszenie stężenia metacholiny wymaganego do spowodowania dwukrotnego wzrostu oporu i elastancji (PC200; Rycina 5C). Wyniki te ilustrują odpowiednio nadreaktywność dróg oddechowych oraz nadwrażliwość na wziewaną metacholinę po ekspozycji na chlor.
Inne pomiary. Oprócz FOT, system flexiVent może być również wykorzystywany do zbierania innych rodzajów pomiarów funkcji płuc8-10 lub układu sercowo-naczyniowego11. Rycina 7 przedstawia reprezentatywną, stopniową krzywą ciśnienie-objętość sterowaną ciśnieniem u naiwnych myszy A/J w warunkach bazowych. Górna część ramienia wydechowego krzywej została dopasowana do równania Salazar-Knowlesa12, a parametry są automatycznie obliczane przez oprogramowanie.
Tabela 1. Przykłady reżimów anestezjologicznych stosowanych u myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą tabelę.
Tabela 2. Perturbacje stosowane w pomiarach funkcji płuc u myszy. *Wymagane rozszerzenie systemu. Badany obiekt musi również znajdować się w zamkniętej komorze pletyzmografu podczas pomiarów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą tabelę.
Tabela 3. Przykład wyeksportowanych parametrów z rodzin perturbacji wymuszonych oscylacji o pojedynczej i szerokopasmowej częstotliwości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą tabelę.
Tabela 4. Porównanie systemów. Porównanie parametrów mechaniki płuc zebranych przy użyciu dwóch generacji systemu flexiVent obsługiwanego przez oprogramowanie flexiWare 7. Wyniki uzyskano u naiwnych myszy A/J (n=5/grupa) w stanie podstawowym oraz po indukowanym metacholiną skurczu oskrzeli (Mch 12.5 mg/ml). *Grupy porównywano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) dla pomiarów powtórzonych oraz log10 poszczególnych odpowiedzi w celu sprawdzenia jednorodności wariancji (GraphPad Prism, wersja 5.03; GraphPad Software, San Diego, USA).
Rycina 1. Zrzut ekranu głębokiej inflacji płuc. Górny panel pokazuje objętość przemieszczoną przez tłok respiratora (linia czerwona) oraz objętość dostarczoną do badanego (linia szara). Dolny panel przedstawia wzrost ciśnienia w cylindrze do ustawionego ciśnienia 30 cmH2O w okresie 3 sekund, utrzymywane na stałym poziomie przez ten sam czas.
Rysunek 2. Przykład typowego skryptu używanego do oceny mechaniki układu oddechowego w stanie bazowym.
Rysunek 3. Spontaniczne wysiłki inspiracyjne podczas wykonywania skokowej krzywej ciśnienie-objętość.
Rysunek 4. Przebieg czasowy odpowiedzi po zwiększających się dawkach wziewnej metacholiny. Wyniki przedstawiono jako średnią (± odchylenie standardowe) dla grupy 5 naiwnych myszy A/J o spontanicznej nadreaktywności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Rycina 5. Zmiany w mechanice układu oddechowego po zwiększających się dawkach metacholiny u myszy Balb/c eksponowanych na chlor oraz powietrze. Dla każdego parametru u każdego osobnika i w każdym warunku eksperymentalnym określono wartość szczytową. Następnie obliczono średnie grupowe (średnia ± odchylenie standardowe; n=4-6). Różnice między grupami oceniono za pomocą analizy wariancji, wykorzystując log10 poszczególnych odpowiedzi w celu uzyskania jednorodności wariancji. Stężenie metacholiny powodujące dwukrotny wzrost wartości bazowej (PC200) uzyskano poprzez dopasowanie wielomianu drugiego stopnia do indywidualnych krzywych zależności dawka-odpowiedź oraz interpolację dopasowanej krzywej. Punkty danych w panelach D, E i F dla myszy eksponowanych na chlor przy dwóch najwyższych stężeniach metacholiny są pominięte ze względu na niewystarczająco wysokie współczynniki determinacji, co odzwierciedla słabe dopasowanie modelu matematycznego do danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię.
Rysunek 6. Podział odpowiedzi oddechowej na mechanikę dróg oddechowych i tkanki płucnej. Zapis eksperymentalny z naiwnych myszy A/J ilustrujący pomiary mechaniki oddechowej metodą wymuszonych oscylacji o pojedynczej częstotliwości (2,5 Hz) oraz szerokopasmowej (1-20,5 Hz), wykonane w trzech powtórzeniach przy dwóch różnych ciśnieniach końcowo-wydechowych (3 & 9 cmH2O). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.
Rycina 7. Krzywa ciśnienie-objętość u naiwnych myszy A/J w warunkach bazowych. Krzywe ciśnienie-objętość zostały wygenerowane przy użyciu stopniowej perturbacji sterowanej ciśnieniem (PVs-P), aby zapewnić napompowanie płuc każdej myszy do tego samego ciśnienia, niezależnie od ich stanu. Parametry równania Salazara-Knowlesa wyodrębnione z poszczególnych krzywych ciśnienie-objętość zostały również uśrednione i przedstawione w formie tabeli. Wyniki wyrażono jako średnia ± odchylenie standardowe (n=6).
Dyskusja
Nieustanne badania nad dysfunkcją dróg oddechowych w odniesieniu do astmy i innych chorób płuc mają zasadnicze znaczenie dla zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw choroby i opracowania opcji leczenia. Wykorzystanie myszy do modelowania chorób dróg oddechowych miało zasadnicze znaczenie dla zrozumienia tych mechanizmów chorobowych. Rozważając ocenę dysfunkcji dróg oddechowych u osoby tak małej jak mysz, posiadanie wiarygodnych i dokładnych narzędzi do pomiaru czynności płuc ma kluczowe znaczenie. Ponadto nieocenione jest posiadanie narzędzi, które mogą dostarczyć informacji na temat lokalizacji dysfunkcji dróg oddechowych lub efektu terapeutycznego. Technika FOT łączy w sobie wszystkie te atrybuty i zapewnia silne, integracyjne i translacyjne podejście do oceny zmian fizjologicznych.
Aby odnieść sukces w tego typu pomiarze u myszy, należy zwrócić szczególną uwagę na kilka kroków, a mianowicie kalibrację systemu, rezystancję kaniuli dotchawiczej, rodzaj nebulizatora (a także jego ustawienia pracy), ułożenie zwierzęcia oraz standaryzację historii objętości płuc. Ponadto, w celu uzyskania prawidłowych zbiorów danych, konieczne jest, aby układ oddechowy badanego pozostał bierny podczas pomiarów. Można to osiągnąć poprzez podanie środka paraliżującego mięśnie, działającego w głębokim znieczuleniu lub poprzez hiperwentylację pacjenta w celu wywołania bezdechu (patrz Tabela 1). Badacze mogą zacząć od opanowania systemu i jego oprogramowania operacyjnego, w razie potrzeby, z obciążeniami testowymi, jednocześnie nabywając umiejętności niezbędne do pomiarów na myszach. Logiczne byłoby zatem wygenerowanie powtarzalnych wyników u naiwnych zwierząt przed przejściem do modeli choroby lub leczonych myszy. Ponieważ znaczna część modeli chorób w badaniach układu oddechowego wiąże się z narażeniem zwierząt na czynniki takie jak alergeny, toksyny, zanieczyszczenia, dym papierosowy lub gazy, na zmienność wyników uzyskanych za pomocą techniki pomiarowej opisanej w tym artykule może mieć wpływ zastosowana procedura narażenia. Standaryzacja kluczowych procesów eksperymentalnych (np. z wykorzystaniem sterowanych komputerowo systemów ekspozycji i pomiarów6, 13, 14) może potencjalnie mieć znaczący wpływ na zmniejszenie zmienności.
Przykłady przedstawione w tym artykule reprezentują wybór typowych wyników eksperymentów na myszach naiwnych i narażonych na działanie chloru, podkreślając jednocześnie mocne strony, jak i ograniczenia tej techniki. Jak widać na przykład na rysunku 6, technika ta jest w stanie generować powtarzalne pomiary czynności płuc. Podczas gdy podobne wyjściowe wartości oporności zgłaszano między szczepami myszy, zaobserwowano jednak różnice w elastancji15. Należy również spodziewać się znacznych zmian między niemowlętami i dorosłymi myszami16. Jeśli chodzi o inne oceny fizjologiczne in vivo , wyniki o wysokiej precyzji, takie jak te generowane przez FOT, wiążą się z ustępstwem co do naturalnego stanu badanych. Zasada ta, określanajako zasada niepewności fenotypowania1, ma zastosowanie do niniejszego protokołu w tym sensie, że pomiary muszą być wykonywane u osób znieczulonych, tracheotomowych (lub zaintubowanych doustnie) i wentylowanych mechanicznie. Inne ograniczenie tej techniki można zaobserwować na rysunku 5D-5F , gdzie dane nie są dostępne dla najwyższych stężeń dla grupy narażonej na chlor, ponieważ dopasowanie modelu stałej fazy do danych jest słabe powyżej umiarkowanych poziomów zwężenia oskrzeli. Jednak zwierzęta z poważnym zwężeniem oskrzeli można ocenić, analizując Zrsbezpośrednio 15 lub używając oprogramowania do analizy końcowej innej firmy w celu dopasowania bardziej złożonych modeli matematycznych, np . biorąc pod uwagę niejednorodność funkcji mechanicznych17. Wykluczone zestawy danych można również zaobserwować, jeśli drogi oddechowe zwierzęcia nie są wystarczająco bierne lub jeśli opór kaniuli jest zbyt wysoki. Z reguły opór kaniuli nie powinien przekraczać oporu zwierzęcia na początku badania. Praca z kaniulą o większej średnicy wewnętrznej i/lub krótszej długości pomoże zmniejszyć opór kaniuli. Wreszcie, obecna demonstracja pomiarów FOT u myszy może być postrzegana jako czasochłonna, a zatem mniej wydajna metodologia lub mniej przydatna w badaniach podłużnych w porównaniu z mniej inwazyjnymi technikami. Jednak te ostatnie wiążą się z dużą niepewnością co do podstawy ich wyników i są postrzegane przez wielu jako wadliwe1. Powtarzające się pomiary inwazyjne są możliwe u zwierząt zaintubowanych doustnie, chociaż są one trudniejsze technicznie17.
Na podstawie podanych przykładów wyniki wykazały równoważność dwóch generacji systemu flexiVent w wykonywaniu pomiarów mechaniki układu oddechowego, a także nadreaktywności dróg oddechowych i nadwrażliwości na wdychaną metacholinę po ekspozycji na chlor u myszy. Szczegółowy aspekt pomiarowy związany z tą techniką, stosowany do scharakteryzowania lub zrozumienia zmian fizjologicznych lub modeli chorób, może przyczynić się do poszerzenia obecnego stanu wiedzy.
Oświadczenia
AR, LF, TFS są zatrudniane przez SCIREQ Scientific Respiratory Equipment Inc. TFS jest również właścicielem akcji.
Bezpłatny dostęp do tego artykułu jest sponsorowany przez SCIREQ Scientific Respiratory Equipment, Inc.
Podziękowania
TKMcG jest wspierane przez stypendium Kanadyjskiego Towarzystwa Klatki Piersiowej.
WKŁAD AUTORÓW
Wszyscy autorzy brali udział w tworzeniu manuskryptu. Ponadto TKMcG zainicjowało projekt, zebrało wyniki eksperymentów, przyczyniło się do napisania manuskryptu i jego krytycznej recenzji. AR zebrał i przeanalizował wyniki eksperymentów, sporządził manuskrypt i przyczynił się do jego krytycznej recenzji. LF zebrał wyniki eksperymentów i przyczynił się do krytycznej recenzji manuskryptu. TFS i JGM przyczyniły się do krytycznej recenzji manuskryptu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODCZYNniki | |||
| Chlorek acetyl-β-metylocholiny | Sigma-Aldrich | A-2251 | Metacholina |
| Pinceta Micro-Adson, ząbkowana 12 cm | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Pinceta Moria MC31, ząbkowana-zakrzywiona | Fine Science Tools | 11370-31 | |
| Nożyczki tępe do tęczówki, proste 11,5 cm | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Nożyczki sprężynowe, ostrza 2,5 mm, proste | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Niejałow łomyk igłowy (18g x ½") | Brico Medical Supplies Inc. | BN1805 | Kaniula endotrachealna |
| Niejałow szew jedwabny 5-0 | Seraflex | IDI58000 | |
| Bufor fosforanowy (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Probówki stożkowe 15 ml | Starstedt | SS-4001 | |
| Strzykawki TB 1 ml | Becton Dickinson | 309626 | |
| Tipsy filtrowane 200 μl | Biosphere | 70.760.211 | |
| SPRZĘT | |||
| flexiVent FX |  SCIREQ Inc. | sales@scireq.com | www.scireq.com |
| Nebulizator Aerogen Aeroneb | SCIREQ Inc. | sales@scireq.com | www.scireq.com |
Bibliografia
- Bates, J. H. T., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J. Appl. Physiol. 94, 1297-1306 (2003).
- Bates, J. H. T. Lung mechanics. An inverse modeling approach. , Cambridge University Press. New York. (2009).
- Hantos, Z., Daroczy, B., Suki, B., Nagy, S., Fredberg, J. J. Input impedance and peripheral inhomogeneity in dog lungs. J. Appl. Physiol. 72, 168-178 (1992).
- McGovern, T. K., et al. Dimethylthiourea protects against chlorine induced changes in airway function in a murine model of irritant induced asthma. Respir. Res. 11, 138(2010).
- Hayes, R. D., Beach, J. R., Rutherford, D. M., Sim, M. R. Stability of methacholine chloride solutions under different storage conditions over a 9 month period. Eur. Respir. J. 11, 946-948 (1998).
- North, M. L., et al. Augmentation of arginase 1 expression by exposure to air pollution exacerbates the airways hyperresponsiveness in murine models of asthma. Respir. Res. 12, (2011).
- Siddiqui, S., et al. Site of allergic airway narrowing and the influence of exogenous surfactant in the brown norway rat. PloS ONE. 7, e29381(2012).
- Cohen, J. C., Lundblad, L. K. A., Bates, J. H. T., Levitzky, M., Larson, J. E. The "Goldilocks Effect" in cystic fibrosis: identification of a lung phenotype in the cftr knockout and heterozygous mouse. BMC Genetics. 5, 21(2004).
- Shalaby, K. H., Gold, L. G., Schuessler, T. F., Martin, J. G., Robichaud, A. Combined forced oscillation and forced expiration measurements in mice for the assessment of airway hyperresponsiveness. Respir Res. 11, 82(2010).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. J. Appl. Physiol. 109, 1960-1968 (2010).
- Amatullah, H., et al. Comparative cardiopulmonary effects of size-fractionated airborne particulate matter. Inhalation Toxicology. 24, 161-171 (2012).
- Salazar, E., Knowles, J. H. An analysis of pressure-volume characteristics of the lungs. J. Appl. Physiol. 19, 97-104 (1963).
- Balakrishna, S., et al. Environmentally persistent free radicals induce airway hyperresponsiveness in neonatal rat lungs. Particle Fibre Tox. 8, 11(2011).
- Fahmy, B., et al. In vitro and in vivo assessment of pulmonary risk associated with exposure to combustion generated fine particles. Environ. Toxicol. Pharmacol. 29, 173(2010).
- Duguet, A., et al. Bronchial responsiveness among inbred mouse strains. Role of airway smooth-muscle shortening velocity. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 161, 839-848 (2000).
- Bozanich, E. M., et al. Developmental changes in airway and tissue mechanics in mice. J. Appl. Physiol. 99, 108-113 (2005).
- Schwartz, B. L., et al. Effects of central airway shunting on the mechanical impedance of the mouse lung. Ann. Biomed. Eng. 39, 497-507 (2011).
- De Vleeschauwer, S. I., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab Anim. 45, 81-89 (2011).
- Takubo, Y., et al. α1-Antitrypsin determines the pattern of emphysema and function in tobacco smoke-exposed mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166, 1596-1603 (2002).
- Salerno, F. G., et al. Effect of PEEP on induced constriction is enhanced in decorin-deficient mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1111-L1117 (2007).
- Therien, A. G., et al. Adenovirus IL-13-induced airway disease in mice. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 39, 26-35 (2008).
- Bates, J. H. T., Cojocaru, A., Lundblad, L. K. A. Bronchodilatory effect of deep inspiration on the dynamics of bronchoconstriction in mice. J. Appl. Physiol. 103, 1696-1705 (2007).
- Wagers, S. S., et al. Intrinsic and antigen-induced airway hyperresponsiveness are the result of diverse physiological mechanisms. J. Appl. Physiol. 102, 221-230 (2007).
- Collins, R. A., Sly, P. D., Turner, D. J., Herbert, C., Kumar, R. K. Site of inflammation influences site of hyperresponsiveness in experimental asthma. Respir. Physiol. Neurobiol. 139, 51-61 (2003).
- Bishai, J. M., Mitzner, W. Effect of severe calorie restriction on the lung in two strains of mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L356-L362 (2008).
- Song, W., et al. Postexposure administration of β2-agonist decreases chlorine-induced airway hyperreactivity in mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 45, 88-94 (2011).
- Hirota, J. A., Ellis, R., Inman, M. D. Regional differences in the pattern of airway remodeling following chronic allergen exposure in mice. Respir. Res. 7, 120(2006).
- Llop-Guevara, A., et al. In vivo-to-in silico iterations to investigate aeroallergen-host interactions. PloS ONE. 3, e2426(2008).
Przedruki i uprawnienia
