Artykuł metodologiczny

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

23.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50180

⸱

30 marca 2013

 ,  ,  , 
1Center for Human Genetic Research and Department of Medicine, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, 2Department of Earth, Atmospheric, and Planetary Sciences, Massachusetts Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Streszczenie

Nicień C. elegans stał się ważnym modelem do badania zachowanych szlaków genetycznych regulujących metabolizm tłuszczów w odniesieniu do ludzkiej otyłości i związanych z nią patologii. Kilka wcześniejszych metodologii opracowanych do wizualizacji zapasów tłuszczu bogatych w trójglicerydy C. elegans okazało się błędnych, podkreślając przedziały komórkowe inne niż kropelki lipidów. Inne metody wymagają specjalistycznego sprzętu, są czasochłonne lub dają niespójne wyniki. Wprowadzamy szybką, powtarzalną, opartą na utrwalaczu metodę barwienia czerwienią nilową w celu dokładnego i szybkiego wykrywania obojętnych kropelek lipidów u C. elegans. Krótki etap utrwalania w 40% izopropanolu sprawia, że zwierzęta są całkowicie przepuszczalne dla czerwieni nilowej, która jest następnie używana do barwienia zwierząt. Właściwości spektralne tego lipofilowego barwnika pozwalają mu silnie i selektywnie fluoryzować w żółto-zielonym widmie tylko w środowisku bogatym w lipidy, ale nie w bardziej polarnych środowiskach. W ten sposób kropelki lipidów można uwidocznić pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w prostą funkcję obrazowania GFP po zaledwie krótkim etapie barwienia czerwienią nilową w izopropanolu. Szybkość, przystępność cenowa i powtarzalność tego protokołu sprawiają, że idealnie nadaje się on do ekranów o wysokiej przepustowości. Demonstrujemy również sparowaną metodę biochemicznego oznaczania triglicerydów i fosfolipidów za pomocą chromatografii gazowej ze spektrometrią mas. Ten bardziej rygorystyczny protokół powinien być stosowany jako potwierdzenie wyników uzyskanych z mikroskopowego oznaczania lipidów czerwieni nilowej. Przewidujemy, że techniki te staną się nowymi standardami w dziedzinie badań metabolicznych C. elegans.

Wprowadzenie

Zachowanie szlaków metabolicznych między ludźmi a nicieniem Caenorhabditis elegans czyni go potężnym organizmem modelowym do badań nad otyłością. Podczas gdy C. Elegans nie mają adipocytów przeznaczonych do magazynowania tłuszczu, jak u ssaków, przechowują trójglicerydy w kropelkachlipidów1 i posiadają wiele takich samych regulatorów magazynowania tłuszczu i zużycia energii2,3. Aby oznaczyć poziom tłuszczu u C. elegans, zaproponowano kilka metod o różnym poziomie łatwości i skuteczności. Niegdyś powszechne stosowanie fluorescencyjnych, witalnych barwników4-7 zostało ostatnio zakwestionowane, a odczynniki te okazały się barwić komorę odrębną od głównego magazynu tłuszczu C. elegans1,8-11. Niefluorescencyjne barwniki na bazie utrwalacza, takie jak Sudan black i Oil-red-O, chociaż skutecznie podkreślają kropelki lipidów w robaku12-14, nie mają tak dużego zakresu dynamicznego do oznaczania ilościowego, jak barwniki fluorescencyjne8,13,15. Ponadto obecne metody utrwalania zarówno barwników fluorescencyjnych, jak i niefluorescencyjnych są czasochłonne i obejmują wiele etapów zamrażania i rozmrażania lub stosowania toksycznych substancji chemicznych1,9,10 . Doniesiono, że stosowanie specyficznych analogów lipidowych znakowanych BODIPY uwydatnia kropelki lipidów po podaniu żywym robakom z krótkotrwałym znakowaniem15. Zależy to jednak od wychwytu barwnika i dlatego jest stronnicze przez obchodzenie się z C. elegans i metabolizm analogów kwasów tłuszczowych BODIPY. Uznaną alternatywą dla barwników barwiących lipidy jest bezznacznikowa, spójna mikroskopia anty-Stokesa rozpraszania Ramana (CARS) lub stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS), które wykorzystują charakterystyczne właściwości wibracyjne cząsteczek lipidów do wizualizacji zapasów tłuszczu10,16,17 . Jednak do tej metody niezbędny jest drogi specjalistyczny sprzęt, a przepustowość jest w najlepszym razie niska.

Aby zaspokoić potrzebę szybkiej, skalowalnej analizy neutralnych zapasów lipidów w badaniach metabolicznych C. elegans, wprowadzamy nową, wysoce powtarzalną metodę barwienia czerwonych lipidów na bazie utrwalacza. Właściwości spektralne i fizykochemiczne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej indukują żółto-złote przesunięcie widmowe w jego piku wzbudzenia-emisji, umożliwiając mu fluoryzację w zielonym widmie emisyjnym tylko w środowisku bogatym w lipidy, ale nie w bardziej polarnych środowiskach18,19 . W ten sposób kropelki lipidów można wykryć po prostym barwieniu za pomocą zestawu filtrów z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) do mikroskopii fluorescencyjnej. Łatwość i przystępność cenowa tej techniki sprawiają, że idealnie nadaje się ona do ekranów o wysokiej przepustowości. Demonstrujemy również sparowaną, rygorystyczną metodę biochemicznego oznaczania triglicerydów i fosfolipidów przy użyciu ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas. Biochemiczny pomiar lipidów koreluje z mikroskopowym oznaczaniem masy tłuszczowej C. elegans na podstawie czerwieni nilowej i powinien być stosowany jako potwierdzenie wyników uzyskanych za pomocą mikroskopowego oznaczania lipidów.

Protokół

1. Przygotowanie prostokątnych płytek agarowych Amp/Tet (A/T) LB i płytek NGM IPTG RNAi

A/T płytki powinny być przygotowane 1-4 tygodnie przed użyciem i przechowywane w ciemności w temperaturze 4 °C.

  1. Na 1 l pożywki dodać 1 l wody dejonizowanej, 32 g agaru LB, 1,5 ml 2 M NaOH i 2 g agaru Bacto. Autoklaw 40 min w cyklu cieczy. Po schłodzeniu do temperatury 60 °C dodać 3 ml tetracykliny i 0,5 ml ampicyliny. Wlej 45 ml pożywki do każdej płytki.

Przygotuj 96-dołkowe płytki RNAi 3 dni do 2 tygodni wcześniej.

  1. Aby wlać 25 96-dołkowych płytek RNAi, przygotuj 1 l pożywki dla nicieni (NGM): 1 l wody dejonizowanej, 3 g NaCl, 17 g agarozy i 2,5 g baktopeptonu. Cykl cieczy w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 40 minut z mieszadłem. Ostudzić, mieszając na płycie grzejnej ustawionej na 60 °C.
  2. Po schłodzeniu do temperatury 60 °C dodać następujące roztwory podstawowe: 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5 mg/ml cholesterolu, 25 ml 1 M KH2PO4 (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 200 mg/ml karbenicyliny i 5 ml 1 M IPTG (przepisy znajdują się w tabeli materiałów).
  3. Dozować 150 μl pożywki RNAi do każdego dołka płaskodennej płytki 96-dołkowej za pomocą elektronicznego pipetora wielokanałowego. Unikaj pęcherzyków powietrza. Podczas dozowania należy przechowywać media w sterylnym pojemniku ze stali nierdzewnej zanurzonym w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C.
  4. Utrzymuj płytki RNAi poziomo, aż agaroza zastygnie. Talerze można wylewać do 2 tygodni wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 °C.

Dzień 1

2. Stempluj zamrożone tabliczki biblioteczne na prostokątnych płytkach agarowych Amp/Tet (A/T) LB

  1. Podgrzej płyty A/T do temperatury pokojowej, trzymając je w ciemności.
  2. Przenieś 96-dołkowe płytki biblioteczne RNAi z temperatury -80 °C na suchy lód. Otwórz aluminiową płytkę w pobliżu palnika Bunsena.
  3. Wysterylizuj 96-pinowy replikator, zanurzając szpilki szeregowo (po 10 sekund każdy) w 10% wybielaczu, dejonizowanymH2Oi 70% EtOH, a następnie przepuszczając szpilki przez płomień. Powtórz krok EtOH i płomienia.
  4. Nałożyć replikator na zamrożony 96-dołkowy zapas glicerolu RNAi, upewniając się, że każdy szpilka styka się z powierzchnią każdego dołka.
  5. Stempluj na płytce A/T, rysując małe kółko każdym kołkiem bez uszkadzania powierzchni agaru.
  6. Ponownie uszczelnić i zwrócić płytki biblioteczne do temperatury -80 °C. Inkubować wytłoczone płytki A/T w temperaturze 37 °C przez noc w celu rozwoju bakterii.

Dzień 2

3. Hoduj klony bakterii RNAi przez noc w blokach głębokich studni

  1. Wyjąć płytki A/T z temperatury 37 °C i potwierdzić rozwój bakterii.
  2. Napełnij każdą studzienkę 96-dołkowego bloku studni 1,5 ml LB z 200 μg/ml karbenicyliny.
  3. Wysterylizuj 96-pinowy replikator (patrz krok 2.3).
  4. Nałożyć replikator na górną część płytki A/T, upewniając się, że kołki stykają się z każdym klonem bakteryjnego RNAi. Podnieś replikator i zanurz kołki w bloku studni głębinowej. Obracaj i powoli usuwaj, uważając, aby nie zanieczyścić sąsiednich studzienek.
  5. Blok uszczelniający z folią ułatwiającą oddychanie. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z mieszaniem (preferowane 950 obr./min w wytrząsarce MT Infors Microtiteron II lub 250 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem o rozkładzie 25 mm).

Dzień 3

4. Klony bakteryjne RNAi na 96-dołkowych płytkach RNAi NGM

  1. Wyjąć 96-dołkowe płytki RNAi z 4 °C i ogrzać do temperatury pokojowej.
  2. Usunąć bloki studni głębinowej i odwirować przez 10 minut przy 4 000 x g.
  3. Szybko odwróć bloki do zlewu, aby odsączyć media, i stempluj odwrócone na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar mediów.
  4. Pod okapem z przepływem laminarnym dodać 40 μl LB z 200 μg/ml karbenicyliny do każdej studzienki i zamknąć sterylną folią.
  5. Włóż bloki do wytrząsarki bakteryjnej o temperaturze pokojowej na 10 minut, aby ponownie zawiesić granulki, lub ręcznie ponownie zawiesić granulki, ostrożnie pipetując.
  6. W okapie z przepływem laminarnym usuń sterylny film i przenieś bakterie z bloków głębokiej studzienki na 96-dołkowe płytki RNAi. Dodać 40 μl zawieszonych bakterii do rzędów "A" i "H" oraz 35 μl ze wszystkich pozostałych rzędów. Więcej płynu dodaje się do studzienek brzegowych 96-dołkowej płytki RNAi, aby zapobiec przesuszeniu i pękaniu agarozy.
  7. Pozostaw talerze odkryte do wyschnięcia w kapturze na 4-6 godzin, regularnie sprawdzając pod kątem wysuszenia. Suche bakterie wydają się klarowne, nie mętne. Przykryj, odwróć płytki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez noc.

5. Przygotuj synchroniczną populację robaków

Dwie 10-centymetrowe płytki wypełnione wieloma robakami grawitacyjnymi są używane do przygotowania jaj na każde 6 96-dołkowych płytek RNAi. Upewnij się, że robaki nie są głodzone przez co najmniej dwa pokolenia (7 dni).

  1. Przygotuj synchroniczne populowanie L1 zgodnie z wcześniejszym opisem20. Na 20 ml roztworu wybielacza użyj 4 ml wybielacza, 1 ml NaOH (10 M), 5 ml dejonizowanegoH2Oi 10 ml buforu M9.
  2. Synchronizować robaki przez noc w 10 ml M9 w sterylnej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml obracającej się w temperaturze 20 °C.

Dzień 4

6. Dodaj robaki do płytek RNAi

  1. Jaja wirować przygotować w temperaturze 3 000 x g przez 1 minutę. Odsysać supernatant, trzymając się z dala od osadu piskląt L1. Zawiesić w 5 ml buforze M9 z 0,0005% Triton X-100. Dodatek niewielkiej ilości detergentu zapobiega przywieraniu robaków do pipety i nie ma wpływu na plamienie tłuszczu.
  2. Policz robaki pod mikroskopem. W razie potrzeby dostosuj stężenie do 10-15 robaków na mikrolitr.
  3. W okapie z przepływem laminarnym, dla każdej 96-dołkowej płytki, która ma zostać wysiana, dodać 75 μl ponownie zawieszonych robaków do każdej studzienki w jednym rzędzie płytkiego bloku testowego. Za pomocą ręcznej pipety wielokanałowej dodaj 50-75 robaków w 5 μl do każdej studzienki z 96-dołkowymi płytkami RNAi.
  4. Pozostaw talerze do wyschnięcia w okapie na 30 do 60 minut. Po wyschnięciu, pod mikroskopem, robaki powinny wydawać się pełzające, a nie miotające się.
  5. Hoduj robaki na płytkach RNAi w temperaturze 20 °C przez ~64 godziny.

Dzień 7

7. Napraw i poplam robaki na czerwono Nilu

  1. Wyjąć płytki RNAi z inkubatora. Zbadaj pod mikroskopem i zapisz zagłodzone lub młócące (mokre) studzienki, aby wykluczyć z dalszej analizy, ponieważ warunki te wpływają na masę tłuszczową.
  2. Za pomocą elektronicznego pipetora wielokrotnego dodać 150 μl PBS z 0,01% trytonem X-100 do każdego dołka płytki RNAi. Za pomocą ręcznego pipetora wielokanałowego wymieszaj i przenieś płyn ze ślimakami do odpowiedniego rzędu na 96-dołkowej płytce do PCR. Unikaj zakłócania działania agaru. Powtórz tę czynność dla łącznie 300 μl robaków w PBS na studzienkę.
  3. Po przeniesieniu czterech płytek odwirować płytki z prędkością 500 obr./min przez 1 minutę.
  4. Odessać supernatant za pomocą 96-pinowego aspiratora próżniowego, pozostawiając ~25 μl cieczy i granulki robaka na dnie studzienki.
  5. Dodaj 150 μl 40% izopropanolu do każdego dołka, aby utrwalić zwierzęta. Upewnij się, że pipetor pracuje na wystarczająco wysokiej prędkości, aby zmieszać osad robaka z 40% izopropanolem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
  6. Płytki wirówkowe odkryte przy 500 obr./min przez 1 min.
  7. Odessać supernatant za pomocą aspiratora 96-pinowego lub ręcznie, pozostawiając na dnie studzienki tylko 25 μl 40% izopropanolu + granulki robaka.
  8. Do każdej studzienki dodać 150 μl roztworu barwiącego czerwień nilową przygotowanego bezpośrednio przed użyciem: 6 μl roztworu podstawowego czerwieni nilowej o stężeniu 0,5 mg/ml w acetonie na 1 ml 40% izopropanolu.
  9. Uszczelnij płytkę niesterylną folią samoprzylepną i plamij w ciemności przez co najmniej 2 godziny.

8. Mycie i obrazowanie robaków na mikroskopie o wysokiej przepustowości

  1. Wirować z prędkością 500 obr./min przez 1 minutę i odsysać tylko 25 μl czerwonego barwnika nilowego.
  2. Do każdej studzienki dodać 150 μl PBS z 0,01% trytonem X-100 i przechowywać w ciemności przez co najmniej 30 minut.
  3. Wirować z prędkością 500 obr./min przez 1 min.
  4. Za pomocą 12-kanałowego pipetora odessać zwierzęta z dna każdej studzienki szybkimi pociągnięciami 2 x 7 μl i dozować na 96-dołkowe szkiełko podstawowe z nadrukiem teflonowym. Ostrożnie, nie usuwając robaków, usuń 9,5 μl PBS z każdej studzienki szkiełka. Jeśli szklane szkiełko nie pasuje bezpośrednio do uchwytu mikroskopu, do montażu ślimaków należy użyć niestandardowego, obrabianego maszynowo aluminiowego uchwytu szkiełka.
  5. Powoli opuść pokrywę wsuń na szkiełko 96-dołkowe. Ten krok może wymagać pewnej praktyki, aby uniknąć pęcherzyków lub krzyżowania się robaków z innymi studniami. Zabezpiecz narożniki za pomocą kleju klejącego.
  6. Szkiełko obrazu w jasnym polu i fluorescencji z filtrem GFP/FITC ustawionym na mikroskopie automatycznym. Sygnał lipidowy łatwo ulega fotowybielaniu, dlatego powinien być obrazowany w sposób systematyczny we wszystkich studzienkach, a nie ręcznie, ponieważ fotowybielanie doprowadzi do sztucznych różnic między studzienkami. Więcej informacji na temat analizy można znaleźć w sekcji Reprezentatywne wyniki i dyskusja.

9. Biochemiczne oznaczanie lipidów za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC/MS)

W celu walidacji poziomów lipidów na podstawie fluorescencji czerwieni nilowej, chromatografia gazowa, a następnie analiza spektrometrii mas (GC/MS) mogą być przeprowadzone na estrach metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) pochodzących z triacylogliceroli (TAG) i fosfolipidów (PL) z granulek robaków. Czynności związane z substancjami organicznymi należy wykonywać pod wyciągiem. Należy zadbać o to, aby lipidy były trzymane w nazocie chronionym przed światłem podczas dłuższych etapów przechowywania lub inkubacji, ponieważ są one bardzo podatne na utlenianie. Jako materiał wejściowy stosuje się granulki robaków od 2 500-5 000 zwierząt synchronicznych, przygotowane dokładnie tak, jak powyżej, z wyjątkiem tego, że zwierzęta są hodowane na 10 cm płytkach RNAi.

  1. Umyj 2 500-5 000 robaków z każdej 10 cm płytki z 10 ml buforu M9 do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml. Granulki rozsiewać w ilości 500 x g przez jedną minutę i ponownie przemyć granulat 10 ml buforu M9. Zwierzęta na pellet po 500 x g. Odessać, pozostawiając 250 μl całkowitej objętości, i albo zamrozić na ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C w azocie do późniejszego przetwarzania, albo kontynuować bezpośrednio.
  2. Osad robaka można przenieść bezpośrednio do kroku 9.3, jeżeli masa triglicerydów ma być znormalizowana do masy fosfolipidowej8,13,21. Jednakże, jeśli badacz pragnie normalizacji zawartości białka lub zawartości DNA, osad robaka powinien być sonikowany z najwyższą intensywnością w sonikatorze kąpielowym przez 10 minut, 30 sekund włączenia, 30 sekund wyłączenia, w temperaturze 4 °C. Jeśli pożądana jest normalizacja białka lub DNA, należy usunąć podwielokrotność 5 μl i oznaczyć całkowite stężenie białka za pomocą odczynnika Bradforda lub podobną lub całkowitą zawartość DNA po oczyszczeniu kolumny za pomocą spektrofotometru UV.
  3. Dodaj robaki do 1,5 ml chloroformu:metanolu w proporcji 2:1 w gwintowanej probówce ze szkła borokrzemianowego. Wszelkie przenoszenie rozpuszczalników organicznych powinno odbywać się za pomocą szklanych pipet.
  4. Za pomocą pipety wiretrol 50 μl dodać 25 nM wzorca fosfolipidowego w 50 μl i wzorca triglicerydów 16,7 nM w 50 μl. Oba wzorce należy rozpuścić w chloroformie i metanolu w proporcji 2:1, szczelnie zamknąć i przechowywać pod azotem chronionym przed światłem w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aby uniknąć utleniania.
  5. Czapka z fenolową czapeczką i wirem. Ekstrakt przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, wirowanie co 15 minut.
  6. Wirować z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut. Przenieść dolną fazę organiczną bez tusz do probówki do hodowli borokrzemianów.
  7. Dodać 0,3 ml 0,9% NaCl, wirować i wirować z prędkością 1 000 obr./min przez 5 min.
  8. Przenieś dolną warstwę organiczną do świeżej probówki do hodowli borokrzemianów, uważając, aby nie przenieść żadnej fazy wodnej.
  9. Sucha faza organiczna pod azotem. Aby rozpocząć ekstrakcję do fazy stałej (SPE), ponownie zawiesić wysuszony lipid w 1 ml chloroformu. Alternatywnie, w celu szczegółowego oddzielenia i analizy różnych klas lipidów, w tym klas fosfolipidów, glikolipidów, sfingolipidów, diacylogliceroli, triacylogliceroli, wolnych kwasów tłuszczowych i estrów cholesterolu, zamiast SPE można zastosować chromatografię cienkowarstwową, zapoczątkowaną przez laboratorium Watts w C. elegans22. Lipidy mogą być również rozdzielane za pomocą HPLC, a frakcje analizowane przez GCMS. Można również stosować zaawansowane metody profilowania całego lipidomu metodą chromatografii cieczowej/MS (LCMS)23-26.
  10. Zamontuj krzemionkową kolumnę SPE na kolektorze SPE. Kolumnę wstępnie równoważącą z 3 ml chloroformu. Pozwolić rozpuszczalnikowi przepływać grawitacyjnie.
  11. Załadować próbkę lipidów do kolumny SPE, zbierając przepływ w gwintowanej rurce borokrzemianowej jako część pierwszej frakcji (frakcja TAG). Większość neutralnych lipidów pojawi się w tym pierwszym 1 ml przepływu. Dodać 3 ml chloroformu, aby całkowicie wymyć frakcję TAG, zbierając przepływ w probówce z frakcją TAG.
  12. Wyjmij i zakryj pierwszą probówkę zbiorczą, a następnie zastąp ją czystą probówką. Eluować glikosfingolipidy za pomocą 5 ml acetonu 9:1: metanolu. Nie analizujemy rutynowo składu kwasów tłuszczowych tej frakcji, jednak może ona zawierać cenne informacje i może być zachowana w celu przygotowania estrów metylowych i wolnych zasad sfingoidowych do dalszej analizy przy użyciu specjalistycznych procedur innych niż te dla TAG i PL, jak opisano wcześniej 27.
  13. Zastąp probówkę do pobierania glikosfingolipidów drugą gwintowaną probówką do pobierania borokrzemianów. Eluować fosfolipidy za pomocą 3 ml metanolu (frakcja PL).
  14. W tym momencie frakcje mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C, szczelnie zamknięte pod azotem. Suche oczyszczone lipidy pod azotem. Do przyspieszenia suszenia, w suchym bloku grzewczym w temperaturze 33 °C. Nigdy nie przechowuj lipidów w postaci suchej, ponieważ są one szczególnie podatne na utlenianie w stanie wysuszonym.
  15. Zawiesić wysuszone frakcje lipidowe w 2 ml 2% H2SO4 w metanolu przez wirowanie i inkubować szczelnie zamknięte przez noc w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C, aby utworzyć FAME. Należy zachować ostrożność, aby w reakcji FAME nie było absolutnie żadnej wody, ponieważ znacznie zahamuje to derywatyzację lipidów. Znaleźliśmy bardziej wydajną derywatyzację przez inkubację przez noc, a literatura sugeruje, że mniejsze utlenianie lipidów zachodzi w niższych temperaturach podczas przygotowania FAME28. Alternatywną i szybszą metodą jest użycie 2 ml 2,5% H2SO4 w metanolu i derywatyzacja przez jedną godzinę w temperaturze 70 lub 80 °C21,22,29 .
  16. Następnego ranka wyjmij z kąpieli i pozostaw do ostygnięcia. Dodać 1,5 mlH2O(w celu wygaszenia reakcji), a następnie 0,3 ml heksanu (w celu ekstrakcji FAME) do każdej frakcji TAG i PL. Wstrząsnąć energicznie i odwirować z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut.
  17. Bardzo ostrożnie usuń tylko górną warstwę heksanu za pomocą standardowej pipety lub pipety Pasteura. Dozować do probówki automatycznego podajnika próbników. Upewnij się, że nie dodajesz zakwaszonego metanolu, ponieważ spowoduje to zniszczenie kolumny GC i MSD.
  18. Zakryj i załaduj próbki do GC/MS. Próbka jest przenoszona w heksanie do fiolki Agilent z mikrowkładką zaślepioną nakrętką z PTFE-silikon-PTFE. Jest on przenoszony do Agilent GCMS model 6890/5973N wyposażonego w kolumnę kapilarną Supelcowax-10 (24079) o długości 30 metrów i grubości 250 mikronów z topionej krzemionki. Jeden mikrolitr jest wstrzykiwany do bezdzielnego wlotu ustawionego na 250 °C i 13,33 PSI. Jako gaz nośny stosuje się ultraczysty hel. Przebieg protokołu jest następujący przy stałym poziomie 1 ml na minutę:
krok polecenie Temperatura bramki 1 Przytrzymaj 2 min 150 °C cyfra arabska Rampa 10 °C na minutę 200 °C 3 Przytrzymaj 4 min 200 °C 4 Rampa 5 °C na minutę 240 °C 5 Przytrzymaj 3 min 240 °C 6 Rampa 10 °C na minutę 270 °C 7 Przytrzymaj 5 min 270 °C

A 3-minutowe opóźnienie rozpuszczalnika jest stosowane w MSD, aby zminimalizować zużycie filamentu. Następnie wykrywane są masy od 50 do 550 daltonów przy poczwórnym ustawieniu MS na 150 °C i źródle ms na 230 °C, przy pomocniczej termicznej temperaturze 270 °C.

Wyniki

Przykład obrazu płytki poddanego procedurze barwienia tłuszczów przedstawiono w Rysunek 1. Specyficzne kontrole dla diety wysokotłuszczowej (daf-2 RNAi receptora insulinowego), niskotłuszczowe (lpd-3 białko niezbędne do tworzenia granulek zapasów lipidów w jelitach (RNAi), mały i niskotłuszczowy (fasn-1 (RNAi syntazy kwasów tłuszczowych) oraz pustego wektora (kontrola) wykazują zmienność natężenia fluorescencji w zależności od poziomu tłuszczu u zwierząt oraz odpowiadające im ilości lipidów określone za pomocą analizy GC/MS (Rycina 2). Należy zauważyć, że inaktywacje genów prowadzące do zahamowania rozwoju i powstania małych osobników często sprawiają wrażenie, jakby zwierzęta te miały znacznie niższą zawartość tłuszczu niż dorosłe zwierzęta kontrolne, niezależnie od jakiegokolwiek związku z metabolizmem tłuszczów (Rysunek 3). Należy przeprowadzić analizy wtórne, w tym analizę barwienia oraz biochemię lipidów przy użyciu SPE-GCMS u zwierząt kontrolnych typu dzikiego na podobnym etapie rozwoju, aby zapewnić poprawność wyników w przypadku małych lub zahamowanych rozwojowo hitów pozytywnych. W przypadku fasn-1 RNAi (interferencja RNARysunek 2), zwierzęta zatrzymują się w stadium larwalnym L2 lub L3 i wykazują niższe barwienie tłuszczów niż dorosłe zwierzęta z grupy kontrolnej RNAi, jednak o intensywności zbliżonej do zwierząt z grupy kontrolnej RNAi w stadium L2-L3 (procent barwienia tłuszczów u dorosłych zwierząt z grupy kontrolnej RNAi: 49,9 ± 4,5% dla fasn-1 RNAi oraz 20,2 ± 2,1% dla kontrolnego RNAi w stadium L2 i 64,7 ± 1,3 dla kontrolnego RNAi w stadium L3). Alternatywnie, analiza biochemiczna wykazała niższy stosunek TAG/PL niż u zwierząt kontrolnych N2 w odpowiadającym stadium L2 (TAG/PL: 22,5 ± 2,9 dla fasn-1 RNAi i 46,1 ± 3,4 dla kontrolnego RNAi o odpowiadającym stadium rozwoju, P ≤ 0,05). Zatem w tym przypadku analiza biochemiczna pozwala potwierdzić, że fasn-1 odgrywa rolę w magazynowaniu lipidów, a nie powoduje jedynie specyficznego dla stadium rozwoju zmniejszenia masy tłuszczowej.

Dalsza analiza obrazów nicieni opiera się w dużej mierze na platformie obliczeniowej, takiej jak Cell Profiler z wykorzystaniem WormToolbox30. W przypadku mniejszej liczby obrazów można zastosować publicznie dostępną platformę do analizy obrazów, taką jak ImageJ, bezpłatnie udostępniana przez NIH. W naszej analizie wykorzystano specjalistyczne skrypty Matlab, najpierw do identyfikacji studzienki, a następnie do wykluczenia studzienek pustych lub zawierających pęcherzyki powietrza oraz do odróżnienia małych zanieczyszczeń od nicieni. Ręczna kontrola jakości była niezbędna w przypadku obrazów oznaczonych do wykluczenia z wyżej wymienionych powodów. Empirycznie ustalono, że 90. percentyl intensywności pikseli nicieni w studzience, znormalizowany względem powierzchni nicieni w studzience, dostarczył spójnego miernika intensywności barwienia na wszystkich etapach rozwoju nicieni (Rysunek 3). Z kolei całkowita masa tłuszczu zintegrowana po powierzchni nicienia prowadziłaby do przypisania podobnych wyników małym, jasnym nicieniom oraz dużym, ciemniejszym osobnikom. Ponieważ nasza metoda nie integruje całkowitego sygnału fluorescencyjnego po powierzchni nicienia, a zamiast tego wykorzystuje percentyl intensywności, zmiany samej wielkości nicieni nie wpływają na mierzona intensywność. Zamiast tego mierzone są różnice w rozkładzie intensywności pikseli. Niemniej jednak obserwuje się wyraźne różnice w rozkładzie intensywności pikseli barwienia między zwierzętami na różnych etapach rozwoju, dlatego ważne jest badanie efektu RNAi dla dowolnego genu w odniesieniu do zwierząt na porównywalnym etapie rozwoju (Rysunek 3). Średnia zmienność między powtórzeniami przedstawiona jest na Rysunku 4, co wskazuje na wysoką powtarzalność metody barwienia tłuszczów. Należy zauważyć, że skuteczność metody jest w dużym stopniu zależna od uzyskania wysokiej jakości obrazów dla każdej płytki, przy jednolitym oświetleniu, identycznym czasie ekspozycji oraz minimalnej ilości pęcherzyków, zanieczyszczeń lub przenoszenia się nicieni do innych studzienek.

Ekstrakcję do fazy stałej (SPE) przeprowadzono na wcześniej zmieszanych, oczyszczonych standardach, aby określić stopień, w jakim triacyloglicerole (TAG) mogą zostać oddzielone od fosfolipidów (PL) (Rycina 5A). W tej analizie osiągnięto 100% rozdzielenia TAG i PL, co objawiło się całkowitym brakiem kwasów tłuszczowych 17:0 pochodzących z PL w próbce TAG oraz odpowiadającym temu całkowitym brakiem kwasów tłuszczowych 13:0 pochodzących z TAG w próbce PL (Rycina 5A). Zatem SPE jest wysoce efektywną metodą rozdzielania klas lipidów. Analiza ta nie wskazuje, że wszystkie TAG o różnych długościach łańcucha zostaną oczyszczone za pomocą SPE w równym stopniu i wykryte przez GCMS z podobną wydajnością. Potwierdza ona jedynie, że lipidy TAG i PL jako całość są całkowicie od siebie oddzielone.

Przykładowy ślad GC-MS zwierząt typu dzikiego N2, pobrany za pomocą ekstrakcji do fazy stałej i przygotowania FAME, przedstawiono na Rysunku 5B. W przypadku zarówno TAG, jak i PL, piki można zidentyfikować na podstawie czasu retencji oraz jonów macierzystych i potomnych w widmie mas, a całkowitą powierzchnię pod zidentyfikowanymi pikami znormalizowano do powierzchni odpowiednich standardów wewnętrznych. Aby wyznaczyć znormalizowaną ilość TAG, zsumowano powierzchnie pod wszystkimi pikami chromatogramu TAG, z wyjątkiem standardu 13:0, a następnie podzielono tę sumę przez powierzchnię pod pikiem 13:0. Analogicznie, aby wyznaczyć znormalizowaną całkowitą ilość PL, zsumowano powierzchnie pod wszystkimi pikami, z wyjątkiem standardu 17:0, i podzielono przez powierzchnię pod pikiem 17:0. Znormalizowane wartości dla próbek TAG i PL są następnie wykorzystywane do obliczenia końcowego stosunku TAG/PL dla próbki:

Równanie stosunku TAG do PL; formuła analizy lipidów; obliczanie stosunku; analiza danych chromatograficznych
Należy zauważyć, że dane z SPE-GCMS pozwalają na znacznie bardziej zaawansowaną analizę kwasów tłuszczowych obecnych w każdej frakcji lipidowej niż proste obliczenie całkowitego stosunku TAG do PL. Na przykład badacz może zintegrować pojedynczy pik odpowiadający pojedynczemu kwasowi tłuszczowemu i porównać jego znormalizowaną zawartość między próbkami (np. porównując w typie dzikim N2 i w grupie RNAi daf-2 zintegrowaną powierzchnię piku 18:0 podzieloną przez pik standardu 13:0, znormalizowaną przez całkowitą masę PL podzieloną przez powierzchnię piku standardu PL 17:0):

Równanie względnej zawartości dla analizy lipidów; formuła obliczeniowa danych eksperymentalnych z powierzchniami piku.
Zależnie od preferencji badacza, możliwe jest również określenie zawartości dowolnego kwasu tłuszczowego w frakcjach TAG lub PL jako procentu całkowitej ilości oznaczonych kwasów tłuszczowych (na przykład 18:0 we frakcji TAG w nicieniach N2):

Wzór na procentową zawartość, obliczanie N2 TAG, chemia analityczna, schemat równania.

Schemat procesu przesiewowego RNAi; namnażanie kultur bakteryjnych, przenoszenie i przygotowanie testu z nicciami.
Rycina 1. Typowy przebieg całego eksperymentu. Dzień 1: zamrożone płytki biblioteki RNAi są przenoszone metodą stemplowania na płytki agarowe LB z Amp/Tet i inkubowane w 37 °C. Dzień 2: płytki Amp/Tet służą do szczepienia kultur płynnych klonów RNAi w blokach z głębokimi dołkami. Dzień 3: bakterie są zagęszczane przez wirowanie i przenoszone na 96-dołkowe płytki RNAi. Dzień 4: larwy C. elegans w stadium L1 są dodawane w formie płynnej do płytek RNAi i pozostawione do wyschnięcia. Dzień 7: zwierzęta są zbierane w cieczy, barwione Nile red w 40% izopropanolu, montowane na 96-dołkowych slajdach teflonowych i obrazowane za pomocą mikroskopu wysokoprzepustowego.

Wpływ RNAi na akumulację lipidów u C. elegans; porównanie mikroskopowe fasn-1, lpd-3, kontroli, daf-2.
Rysunek 2. Barwienie Nile red z zastosowaniem utrwalacza wykazuje główne zapasy tłuszczów C. elegans. Przedstawiono reprezentatywne obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencji GFP dla nicieni N2 karmionych klonami RNAi fasn-1 (małe, niska zawartość tłuszczu), lpd-3 (niska zawartość tłuszczu), kontrolą (pusty wektor) lub daf-2 (wysoka zawartość tłuszczu). Próbki opracowano zgodnie z protokołem (schemat na Rysunku 1). Utrwalone zwierzęta, zbarwione Nile red i poddane obrazowaniu, wykazują poziomy lipidów porównywalne z wynikami uzyskanymi z biochemicznego pomiaru lipidów. Poziomy fluorescencji Nile red w próbkach utrwalonych izopropanolem, uzyskane z co najmniej 6 powtórzeń biologicznych, przedstawiono w pierwszym rzędzie. Ilościowe poziomy triglicerydów, odzwierciedlające całkowite zapasy lipidów neutralnych po normalizacji do całkowitego poziomu fosfolipidów (TAG/PL), pobrane z 4 powtórzeń biologicznych, przedstawiono w drugim rzędzie. Należy zauważyć, że bezwzględne ilości uzyskane z barwienia Nile red z zastosowaniem utrwalacza oraz z biochemicznego oznaczania lipidów często nie są identyczne. W tym przypadku, mimo podobieństwa jakościowego, fasn-1(RNAi) wykazuje większą różnicę w masie triglicerydów względem kontroli w metodach biochemicznych niż wskazuje mikroskopia, lpd-3 wykazuje różnicę porównywalną, a daf-2(RNAi) mniejszą różnicę, choć wszystkie różnice są wysoce istotne statystycznie, a pomiary były wysoce powtarzalne. Przedstawione dane to średnia ± SEM (*, P ≤0.01; **, P ≤ 0.0001 względem kontroli, określone za pomocą nieparzystego, dwustronnego testu T przy założeniu równej wariancji).

Wykres analizy względnej intensywności; stadia rozwojowe L1-L4, dorosłe osobniki ciążne; porównanie statystyczne.
Rysunek 3. Masa tłuszczowa określona poprzez utrwalenie i barwienie Nile red na różnych stadiach larwalnych. Zwierzęta hodowano na bakteriach OP50 i zbierano w stadiach rozwojowych L1, L2, L3, L4 oraz u dorosłych osobników ciążnych. Obrazy wykonano po utrwaleniu i barwieniu, a następnie przeanalizowano za pomocą dostosowanego skryptu Matlab, aby wyznaczyć 90ty percentyl intensywności pikseli w obrębie zidentyfikowanego obszaru nicienia. Należy zauważyć, że poziom lipidów u zwierząt znacznie wzrasta w miarę rozwoju od stadium L2 do L4, a następnie nieznacznie spada, gdy zwierzę zaczyna przekierowywać kalorie na proliferację linii zarodkowej w stadium dorosłym. Przedstawione dane stanowią średnią ± SEM dla 6-8 powtórzeń (**, P ≤ 0,0001 względem dorosłych osobników ciążnych, wyznaczono za pomocą nieparzystego dwustronnego testu T).

Wykres efektu wyciszania genów; grupy traktowane RNAi w porównaniu z kontrolą, analiza względnej intensywności.
Rycina 4. Wysoka powtarzalność w niezależnych powtórzeniach biologicznych. Przedstawiono wykres rozrzutu intensywności fluorescencji czerwonego Nilu w powtórzeniach biologicznych (n = 6-8). Dla każdego powtórzenia wszystkie wartości znormalizowano do średniej intensywności kontroli z pustym wektorem. Przedstawione dane to średnia ± SEM (**, P ≤ 0.0001 względem kontroli, określone za pomocą nieparametrycznego, dwustronnego testu T przy założeniu równości wariancji).

Wykres chromatograficzny; rozdział triglicerydów i fosfolipidów według czasu retencji, wykres względnej zawartości.
Rysunek 5. Chromatogramy GC-MS standardów rozdzielonych metodą SPE oraz zawartość TAG i PL w typie dzikim. (A) Przedstawiono ślady GC-MS z rozdzielania standardów TAG i PL metodą SPE. Zwróć uwagę na całkowity brak kwasu tłuszczowego 13:0 w śladzie PL oraz odpowiadający mu brak kwasu tłuszczowego 17:0 w śladzie TAG, co wskazuje na całkowite rozdzielenie TAG (trytridekanoina) od PL (1,2-diheptadekanoylo-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol)). (B) Reprezentatywne pełne widmo TAG i PL z próbki zwierząt typu dzikiego N2 karmionych kontrolnym RNAi wektorem (bakterie HT115 z pustym wektorem RNAi L4440). Zgodnie z protokołem, do urządzenia Agilent 6890/5973N GCMS wstrzyknięto 1 µL próbki, a poszczególne piki zidentyfikowano na podstawie czasu retencji oraz ich odpowiednich widm masowych. Skróty: cyclo, kwas tłuszczowy cyklopropanowy; iso: kwas tłuszczowy z rozgałęzieniem izometylowym; GLA, kwas gamma-linolenowy; ALA, kwas alfa-linolenowy; DGLA, kwas dihapomo gamma-linolenowy; EPA, kwas eikozapentaenowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dyskusja

Przedstawiony protokół pozwala na szybkie, zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe poziomu lipidów u C. elegans, które można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. W przeciwieństwie do wcześniej stosowanych metod, które obejmują długi etap utrwalania w paraformaldehydzie, po którym następuje kilka cykli zamrażania i rozmrażania8,10 , nasz protokół wymaga prostego 3-minutowego utrwalania w izopropanolu. Odkryliśmy, że poprzez barwienie C. eleganów w 40% izopropanolu, stają się swobodnie przepuszczalne dla czerwieni nilowej, bez użycia dodatkowych etapów zamrażania-rozmrażania czy utrwalania. Ponadto, ponieważ czerwień nilowa selektywnie fluoryzuje w przedziałach hydrofobowych w zielonym widmie18,19,31 , odbarwienie nie jest konieczne. W sumie zwierzęta można pobrać z płytek RNAi do wybarwionych i gotowych do obrazowania zwierząt w nieco ponad 2,5 godziny. Metodę tę można wykonać stosunkowo niedrogo i z wysoką powtarzalnością. Metoda ta nie zależy od zdolności C. elegans do wchłaniania lub koncentracji barwnika, a zatem nie ma takich samych ograniczeń, jak metody oparte na żywieniu z użyciem barwników witalnych. Biorąc pod uwagę powtarzalność i precyzję pomiarów, metoda ta nadaje się do badań przesiewowych dużej liczby inaktywacji genów przez RNAi. Jeśli pożądane jest ilościowe określenie poziomu lipidów na podstawie utrwalającego barwienia czerwienią nilową, zalecamy użycie 4-6 powtórzeń biologicznych z odpowiednimi kontrolami i zastosowanymi testami statystycznymi.

Jest prawdopodobne, że wiele inaktywacji genów prowadzących do małych zwierząt (z powodu klonów RNAi powodujących opóźniony lub zatrzymany rozwój) wyjdzie z badania przesiewowego pod kątem regulatorów tłuszczu, niezależnie od jakiegokolwiek związku z metabolizmem tłuszczów. Podczas gdy zastosowany przez nas program do analizy obrazu uwzględnia robaki o różnych rozmiarach poprzez normalizację intensywności fluorescencji w obszarze robaka, poszczególni badacze mogą również rozważyć porównanie poziomów zabarwienia tłuszczem małych zwierząt ze zwierzętami typu dzikiego o podobnym etapie rozwoju. W przypadku małych lub zatrzymanych w rozwoju zwierząt o pozornie niskiej masie tłuszczowej sugerujemy, że żadna pojedyncza modalność nie jest wystarczająca, aby wykazać zmieniony metabolizm lipidów. Konieczne może być przeprowadzenie kilku eksperymentów uzupełniających, w tym SPE-GCMS, w celu ustalenia funkcji regulatora lipidów tych genów. W przypadku znanego regulatora metabolizmu fasn-1, analiza SPE-GCMS w porównaniu z dopasowanymi rozwojowo zwierzętami kontrolnymi N2 L2 była konieczna, aby potwierdzić pozorny fenotyp o niskiej zawartości tłuszczu stwierdzony w porównaniu z dorosłymi zwierzętami kontrolnymi. Podczas gdy barwienie czerwonym tłuszczem nilowym wskazywało na niższy poziom tłuszczu w porównaniu z kontrolnym dorosłym RNAi, w porównaniu z dopasowanymi do etapu zwierzętami kontrolnymi L2 RNAi, nie zaobserwowano widocznej różnicy. W związku z tym konieczne było zastosowanie drugiej metody, tj. biochemicznej kwantyfikacji stosunku TAG/PL w celu ustalenia, że fasn-1 jest prawdziwym regulatorem masy tłuszczowej, ponieważ fasn-1 RNAi jest biochemicznie odróżnialny od zwierząt kontrolnych L2 RNAi dopasowanych w stadium.

Podczas gdy prezentujemy obrazowanie i przetwarzanie dla platformy o wysokiej przepustowości, konwencjonalny mikroskop pionowy może być z łatwością używany do przechwytywania obrazów z robaków zamontowanych na podkładkach agarozowych20 lub na konwencjonalnych szkiełkach mikroskopowych o rozmiarach teflonowych od 8 do 12 dołków. Jedynym ograniczeniem jest to, że ponieważ zielona fluorescencja kropelek lipidów barwionych czerwienią nilową szybko ulega fotowybielaniu, należy stosować systematyczne, jednolite warunki ekspozycji, aby zapewnić porównywalność obrazów. Okazuje się, że w pełni zautomatyzowany mikroskop z jednolitymi warunkami akwizycji obrazu najlepiej sprawdza się w tym celu.

Jedną z największych zalet tego protokołu jest to, że po zebraniu obrazów można je zapisać do ponownej analizy w przyszłości. Te same obrazy można wykorzystać do określenia wielkości ciała oprócz zawartości tłuszczu. Co więcej, w miarę jak programy obliczeniowe stają się coraz bardziej zaawansowane, pojawia się perspektywa analizy pojedynczego robaka, generującej statystycznie istotne wyniki z pojedynczego odwiertu. Tak więc nasza metoda, która wykorzystuje mikroskopię wysokoprzepustową, ma pewne zalety w porównaniu z opublikowanymi metodologiami przesiewowymi, które wykorzystują Copas Biosort do ilościowego oznaczania sygnałów fluorescencyjnych32,33 . Jednak metodologie są zdecydowanie komplementarne.

Precyzyjne, biochemiczne oznaczanie zawartości lipidów za pomocą SPE i GC/MS potwierdza zabarwienie czerwienią nilową głównych zapasów tłuszczu u C. elegans. Chociaż bezwzględna ocena ilościowa uzyskana dzięki utrwalającemu barwieniu czerwienią nilową i biochemicznemu oznaczaniu lipidów często nie jest idealnie dopasowana, obie metody dają wysoce powtarzalne, statystycznie istotne wyniki, które zgadzają się jakościowo. Ponadto metoda ta może być dostosowana do specyficznych potrzeb poszczególnych badaczy, którzy mogą wymagać dalszej analizy poszczególnych klas glikosfingolipidów, fosfolipidów lub trójglicerydów obecnych w różnych próbkach. Należy zauważyć, że inne grupy stosowały technologię inną niż SPE do wyodrębnienia klas lipidów przed GC/MS22. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) i wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC) mają przewagę nad SPE w tym, że mogą być w stanie lepiej oddzielić odrębne obojętne lipidy (np. TAG, diacyloglicerole, wolne kwasy tłuszczowe i estry cholesterolu) od polarnych lipidów (fosfatydylocholiny, fosfatydyloetanoloaminy) i glikolowo-sfingolipidów. Wybieramy SPE, ponieważ wymaga minimum materiału wyjściowego (2 500-5 000 robaków), kładzie nacisk na główne długoterminowe magazyny energii, TAG, które stanowią większość neutralnej frakcji lipidowej4 i jest szybki, nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani płytek. Należy podkreślić, że w oparciu o standardowe mieszaniny, SPE całkowicie oddziela TAG od PL i jest wysoce powtarzalne i niezawodne (patrz rysunek 5A). Podczas gdy kwantyfikacja i analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych wymaga GC/MS, sprzęt ten jest powszechnie dostępny, a jeśli nie lokalnie, próbki mogą być generowane jak powyżej i przechowywane w temperaturze -80 °C w azocie do czasu zorganizowania analizy przez współpracownika lub komercyjną usługę GC/MS.

Dane wyjściowe GCMS zawierają dane o wysokiej rozdzielczości dotyczące każdego kwasu tłuszczowego w każdym gatunku lipidów. Pozwala to na określenie szczegółowych różnic między porównywanymi próbkami. Na przykład badacz może określić, czy poziomy niektórych kwasów tłuszczowych uległy zmianie w obfitości bardziej znacząco niż inne w przypadku daf-2, lpd-3 lub fasn-1 RNAi w porównaniu z kontrolą wektorową. To niezwykle potężne narzędzie może zatem dostarczyć szczegółowych informacji na temat tego, które gatunki lipidów są obficie zmieniane przy każdej eksperymentalnej manipulacji.

Na potrzeby naszej analizy najczęściej normalizujemy masę TAG do masy PL. Podczas gdy białko lub DNA mogą być również używane do normalizacji masy lipidowej po oznaczeniu z podwielokrotności sonikowanego osadu robaka, okazuje się, że metody te są podatne na błędy ludzkie podczas wszystkich etapów pipetowania i odzyskiwania próbki z każdej ekstrakcji. Z tego powodu zdecydowaliśmy się zamiast tego użyć masy PL jako naszego współczynnika normalizacji. Nienaturalne wzorce wprowadzone na początku protokołu (tritridekanina dla TAG, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) dla PL) są przeprowadzane przez wszystkie etapy ekstrakcji do fazy stałej i przygotowania FAME i gwarantują ilościowy i reprezentatywny odzysk zarówno frakcji TAG, jak i PL. Takiej samej gwarancji nie można udzielić, jeśli badacze używają białka lub DNA do normalizacji masy TAG. Uważamy, że PL jest najsolidniejszym wskaźnikiem, za pomocą którego można porównać poziomy TAG w różnych próbach, ponieważ wcześniej wykazano, że PL jest tylko nieznacznie zmieniany przez ten sam bodziec powodujący duże przesunięcia masowe w poziomach TAG, np. przedłużający się głód lub zwiększony wysiłek fizyczny34-36. Uważa się, że PL odgrywają rolę strukturalną, zapewniając płynność błony i integralność komórkową oraz role sygnalizacyjne, a nie jako magazyn energii37-39. W naszych rękach stosunek TAG/PL najbardziej odpowiada temu, co uzyskuje się przez utrwalanie lipidów czerwienią nilową i zgadza się z tym znalezionym przez inne grupy21. Alternatywną strategię stosuje laboratorium Wattsa, w którym oblicza się procent lipidowego TAG w stosunku do całkowitych lipidów9,22,29 .

Zastosowanie nierodzimych typów wzorca TAG i PL gwarantuje, że w obliczeniach normalizacyjnych nie zostaną uwzględnione żadne natywne kwasy tłuszczowe. Wybór długości łańcucha opiera się wyłącznie na potrzebie tych wzorców, aby nie zakłócać widm masowych natywnych kwasów tłuszczowych. Odkryliśmy, że kwasy tłuszczowe 13:0 i 17:0 najlepiej służą temu celowi. Biorąc pod uwagę różne właściwości chemiczne krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, możliwe jest, że nasze nienaturalne standardy kwasów tłuszczowych mogą nie być reprezentatywne dla odzyskiwania wszystkich kwasów tłuszczowych o długości łańcucha lub łańcuchów o różnych wskaźnikach nasycenia. W związku z tym możliwe jest, że podczas SPE lub GCMS możemy zaobserwować różnice w skuteczności oczyszczania lub detekcji między lipidami o różnych długościach łańcuchów. Na tej podstawie oraz różnej jonizacji różnych kwasów tłuszczowych w GCMS nie jest możliwe jednoznaczne stwierdzenie obfitości danego kwasu tłuszczowego. Dlatego porównujemy tylko próbki w ramach jednego eksperymentu obfitości danego kwasu tłuszczowego. Jeśli ktoś chciałby bezwzględnie określić ilościowo kwas tłuszczowy, jednym ze sposobów, w jaki można by to osiągnąć, byłoby przeprowadzenie próbki przygotowanej w sposób opisany powyżej wzbogaconą znaną ilością stabilnie izotopowo znakowanej wersji 13C tego lub podobnego kwasu tłuszczowego, tak aby można ją było rozróżnić na podstawie masy jonu macierzystego w MSD. na przykład. Biorąc pod uwagę, że porównujemy tylko względne ilości klas lipidów lub dowolnego danego kwasu tłuszczowego, nasze standardy 13:0 TAG i 17:0 PL służą temu celowi odpowiednio, przy minimalnych kosztach, aby zapewnić odpowiedni i reprezentatywny odzysk każdej klasy lipidów.

Do tej pory nie było konsensusu co do interpretacji niektórych wyników uzyskanych za pomocą różnych metodologii oraz co do tego, jakie powinny być dominujące metodologie. Ogólnie rzecz biorąc, należy zauważyć, że żadna metoda w izolacji nie jest idealnie odpowiednia do badania metabolizmu tłuszczów u C. elegans. Jednak stosując wiele metod badań przesiewowych i walidacji, można uzyskać pewność co do uzyskanych danych dotyczących genów regulatorowych lipidów. W związku z tym chcemy, aby nasz protokół służył jako punkt odniesienia dla przyszłych prac w dziedzinie badań nad tłuszczami C. elegans .

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Michaelowi Kacergisowi za pomoc techniczną i Lianfengowi Wu za dyskusję i przeczytanie manuskryptu. Praca ta została wsparta nagrodą za rozwój kariery od NIH/NIDDK (K08DK087941 do AAS), grantem szkoleniowym NIH/NIDDK (5T32DK007028 do ECP), nagrodą Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (dla AAS) oraz nagrodą za badania nad zdrowiem dziecka Fundacji Charlesa H. Hooda (dla AAS).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-pinowy replikatorNunc250520
LB AgarUS BiologicalsL1500
AgarozaInvitrogen16500500
Pipety mechaniczneBiohit M LineM10, M100, M300
Pipeta elektronicznaBiohit E LineE1200
1 M KH2PO4SigmaP0662pH 6,0 Sterylizowane w autoklawie
1 M MgSO4SigmaM2643Sterylizowane w autoklawie
1 M CaCl2SigmaC2661Sterylizowane w autoklawie
NaClSigmaS5886
5 mg / ml CholesterolSigmaC8667W 100% etanolu
200 mg / ml CarbenicillinUS BiologicalsC1100Filtr sterylizowany 0,2 i mu;
1 M IPTGUS BiologicalsI8500Filtr sterylizowany 0,2 i mu;
100 mg / ml Filtr ampicylinysterylizowany 0,2 i mu;
5 mg / ml Tetracyklinaw 100% etanolu
Bacto AgarBD214040
96-dołkowe płytki TCBD-Falcon353072Do 96-dołkowych RNAi
Prostokątne płytki A/TThermo Scientific242811Do tłoczenia RNAi
LB MediaUS BiologicalsL1530Przygotowane zgodnie z instrukcjami producenta
96- dobrze Bloki testowe głębokich studniCorningCostar 3960Prostokątny blok testowy z dnem w kształcie litery V
96-dołkowy blok testowy płytkich studniCorningCostar 3956Okrągły blok testowy z dnem w kształcie litery V
Sterylna folia uszczelniającaVWR89134-432
Aluminiowa folia uszczelniającaCorningCostar 6570Thermowell Taśma uszczelniająca do płytek 96-dołkowych
BuforM9Zobacz Hope et al.20Zobacz przepis poniżej
Triton X-100Bio-Rad161-0407
Czerwień nilowaInvitrogenN-1142
IsopropanolFisherBP2632-4
96-pinowy aspiratorVP ScientificVP177A-1
96-dołkowe teflonowe maskowane szkiełka mikroskopoweThermo ScientificCustomMoże również zamówić Trevigen 96-dołkowe
szkiełka nakrywkowe Cometslide 96-dołkowe Gold-SealThermo ScientificCustomMożna również użyć drugiej 96-dołkowej płytki Cometslide
Deep-well PCRVWR89049-178
Niesterylna folia samoprzylepnaVWR60941-070
Mikroskop o wysokiej przepustowościLeicaDM6000 w pełni zautomatyzowany z Prior 96- Etap studzienkowyZ zestawem filtrów Chroma 49002 GFP i 2x obiektywem
Sonikator do kąpieliDiagenodeBioruptor XL
ChloroformSigma366927-4L
MetanolFisherOptima F456-4
Fosfolipid StandardAvanti Polar Lipids830456P1,2-diheptadekanoilo-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glicerol)
Triglicerydy StandardNuChek PrepT-135tritridekanoina
Wiretrol 50 μ l PipetFisher21-176-3ADrummond Scientfic
AcetonSigma320110-4L
Kwas siarkowyFisherA300-500
HeksanFisher Optima H306-1
SPE Kolumna krzemionkowaThermo Scientific60108-317Hypersep SI, złoże żywicy 100 mg
Kolektor chromatografii fazy stałejSigma57265Supelco Visiprep 24-DL
Fisher13-678-27FPipety
borokrzemianowe Pasteura o rozmiarzeFisher13-678-8B
Probówki borokrzemianoweFisher14-961-27
Rurki borokrzemianowe z gwintemVWR14235-460Pojemność 8 ml
Nakrętki fenolowe do probówek hodowlanychFisher14-823-211
Fiolki do automatycznego pobierania próbek GC/MSAgilent5188-6592
Nakrętki do fiolek z automatycznym sampleremAgilent5185-5861
GC/MSAgilent6890 GC / 5973 MSDWyposażone w kolumnę Supelcowax-10

Pożywka do wzrostu nicieni (NGM): na 25 96-dołkowych płytek RNAi przygotuj 1 l NGM:

Odczynnik Ilość
Woda dejonizowana1 L
NaCl3 g
Agaroza17 g
pepton Bacto2,5 g
Cykl cieczy w autoklawie 121 ° C przez 40 min z mieszadłem. Pozostawić do ostygnięcia do 60 stopni C mieszając na płycie grzejnej ustawionej na 60 stopni C. Następnie dodaj następujące elementy:
1 M MgSO41 ml
5 mg/ml cholesterolu1 ml
1 M KH2PO4 (pH 6,0)25 ml
1 M CaCl21 ml
200 mg/ml karbenicyliny 1 ml
1 M IPTG5 ml
Dozować do 96-dołkowych płytek RNAi. Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C do użycia, do 2 tygodni.

ReagentIlość
Woda dejonizowana1 L
LB agar (US Biologicals)32 g
2 M NaOH1,5 ml
Agar Bacto2,5 g
Cykl cieczy w autoklawie 121 ° C przez 40 min z mieszadłem. Pozostawić do ostygnięcia do 60 stopni C mieszając na płycie grzejnej ustawionej na 60 stopni C. Następnie dodaj następujące ilości:
Tetracyklina3 ml
100 mg/ml Ampicylina0,5 ml
Dozuj 45 ml do każdej płytki. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 stopni; C do użycia, do 4 tygodni.
Pipety borokrzemianowe 10 ml

LB bakteryjne podłoże wzrostowe: na 4 L, wystarczające do wzrostu i ponownego zawieszenia 25 96-dołkowych bloków

Wymieszaj 62 g proszku LB (US Biologicals), 4 l wody destylowanej i 4,8 ml 2 M NaOH. Autoklaw w podwielokrotnościach 1 l lub 0,5 l, cykl cieczowy, 40 min. Może być przechowywany do 1 roku w hermetycznych butelkach w temperaturze pokojowej. Wyrzuć, jeśli jest mętny.

100 mg/ml Ampicillin

Zmieszaj 5 g ampicyliny w proszku i wodę dejonizowaną do całkowitej objętości 50 ml. Filtr sterylizować 0,2 μ, dozować w 1 ml porcji i zamrażać w temperaturze -20 &; C do użycia.

5 mg/ml Tetracyklina

Dodaj 1,25 g tetracykliny w proszku do 250 ml 100% etanolu. Dobrze wymieszać aż do całkowitego rozpuszczenia i przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C w światłoszczelnym pojemniku.

200 mg/ml Carbenicillin

Wymieszaj 10 g karbenicyliny w proszku i wody dejonizowanej do całkowitej objętości 50 ml. Filtr sterylizować 0,2 μ, dozować w 1 ml porcji i zamrażać w temperaturze -20 &; C do momentu użycia.

5 mg/ml Cholesterol

Dodaj 1,25 g cholesterolu do 250 ml 100% etanolu. Dobrze wymieszaj i przechowuj w temperaturze 4 stopni; C przez okres do 6 miesięcy.

1 M MgSO4

Rozpuść 120,37 g MgSO4 w 800 ml wody dejonizowanej. Doprowadzić końcową objętość do 1 l. Autoklaw 40-minutowy cykl cieczy i przechowywać w temperaturze pokojowej.

1 M CaCl2

Rozpuść 110,98 g CaCl2 w 800 ml wody dejonizowanej. Doprowadzić końcową objętość do 1 l. Autoklaw 40 min cykl cieczy i przechowywać w temperaturze pokojowej.

1 M KH2PO4, pH 6,0

Rozpuść 136.09 g KH2 PO4 w 800 ml wody dejonizowanej. pH do 6,0 i doprowadzić końcową objętość do 1 L. Autoklaw 40-minutowy cykl cieczy i przechowywać w temperaturze pokojowej.

M9 Buffer: dla 1 L— rutynowo robimy partie 8-10 L

Rozpuść 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 w 900 ml. Doprowadzić końcową objętość do 1 l. Podwielokrotność umieścić w butelkach o pojemności 100-500 ml i autoklawować przez 40 minut w cyklu płynnym i przechowywać w temperaturze pokojowej.

10 N NaOH

Rozpuść 400 g NaOH w 800 ml wody dejonizowanej, Pozostawić do ostygnięcia i doprowadzić do końcowej objętości 1 l. Przechowywać w probówkach o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej.

1 M IPTG

Dodać 23,81 g IPTG do wody dejonizowanej i zwiększyć całkowitą objętość do 100 ml. Filtr sterylizować 0,2 μ, dozować w 1 ml porcji i zamrażać w temperaturze -20 &; C do użycia.

Przygotowanie jaj Wybielacz/roztwór NaOH: 20 ml wystarczające na przygotowanie jednego jajka

Dodaj 4 ml wybielacza, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, i 10 ml buforu M9 do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml. Przygotuj bezpośrednio przed użyciem.

roztwór podstawowy czerwieni nilowej

Dodaj 50 ml 100% acetonu do 25 mg czerwonego proszku nilowego. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze pokojowej w światłoszczelnym pojemniku z parafolią. Może być przechowywany w ten sposób przez wiele miesięcy.

roztwór do barwienia czerwienią nilową: na 500 ml, wystarczający do barwienia płytek 30 x 96-dołkowych

Dodaj 3 ml roztworu podstawowego czerwieni nilowej do 500 ml 40% v/v izopropanolu. Przechowywać w temperaturze pokojowej w szklanej butelce owiniętej folią. Przygotować bezpośrednio przed użyciem.

Phospholipid Standard

Waż 7,6 mg wzorca fosfolipidowego, 1,2-diheptadecanoilo-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), w szklanej zlewce. Rozpuścić w 20 ml chloroformu:metanolu w proporcji 2:1 (25 nanomoli na 50 μ Przechowywać przykryte folią aluminiową do czasu użycia. Standard może być również utrzymywany na poziomie -80 ° C w hermetycznej szklanej fiolce z fenolowym kapturkiem przez 1 rok.

Triglyceride Standard

Zważ 6,8 mg wzorca trójglicerydów, tritridekaniny, do szklanej zlewki. Rozpuścić w 30 ml chloroformu:metanolu w proporcji 2:1 (16,7 nanomoli na 50 μ Przechowywać przykryte folią aluminiową do czasu użycia. Standard może być również utrzymywany na poziomie -80 ° C w hermetycznej szklanej fiolce z fenolowym wieczkiem przez 1 rok.

Bibliografia

  1. Zhang, S. O., Trimble, R., Guo, F., Mak, H. Y. Lipid droplets as ubiquitous fat storage organelles in C. elegans. BMC Cell. 11, 96(2010).
  2. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).
  3. Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official. Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).
  4. Ashrafi, K., et al. Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes. Nature. 421, 268-272 (2003).
  5. Arda, H. E., et al. Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network. Mol. Syst. Biol. 6, 367(2010).
  6. Mak, H. Y., Nelson, L. S., Basson, M., Johnson, C. D., Ruvkun, G. Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage. Nature Genetics. 38, 363-368 (2006).
  7. Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322, 957-960 (2008).
  8. O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, 430-435 (2009).
  9. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLoS ONE. 4, e7545(2009).
  10. Yen, K., et al. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PLoS ONE. 5, (2010).
  11. Rabbitts, B. M., et al. glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis. Genetics. 180, 857-871 (2008).
  12. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277, 942-946 (1997).
  13. Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes Dev. 23, 496-511 (2009).
  14. McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage. Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).
  15. Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).
  16. Hellerer, T., et al. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).
  17. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).
  18. Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red. 33, 833-836 (1985).
  19. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
  20. Hope, I. L. C. elegans: A Practical Approach. , Oxford University Press. New York. 304(1999).
  21. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Developmental Biology. 292, 381-392 (2006).
  23. Wang, T. J., et al. Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nature medicine. 17, 448-453 (2011).
  24. Rhee, E. P., et al. Lipid profiling identifies a triacylglycerol signature of insulin resistance and improves diabetes prediction in humans. The Journal of Clinical Investigation. 121, 1402-1411 (2011).
  25. Lewis, G. D., et al. Metabolic signatures of exercise in human plasma. Science translational medicine. 2, 33-37 (2010).
  26. Rhee, E. P., et al. Metabolite profiling identifies markers of uremia. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 21, 1041-1051 (2010).
  27. Gerdt, S., Lochnit, G., Dennis, R. D., Geyer, R. Isolation and structural analysis of three neutral glycosphingolipids from a mixed population of Caenorhabditis elegans (Nematoda:Rhabditida). Glycobiology. 7, 265-275 (1997).
  28. Christie, W. W. Advances in Lipid Methodology - Two. , Oily Press. 69-111 (1993).
  29. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
  30. Wahlby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nat. Methods. , (2012).
  31. Fowler, S. D., Brown, W. J., Warfel, J., Greenspan, P. Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms. J. Lipid Res. 28, 1225-1232 (1987).
  32. Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448(2012).
  33. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains. J. Vis. Exp. (51), e2745(2011).
  34. Comizio, R., et al. Total body lipid and triglyceride response to energy deficit: relevance to body composition models. The American journal of physiology. 274, E860-E866 (1998).
  35. Lee, R. F., Paffenhofer, G. A., Nevenzel, J. C., Benson, A. A. The metabolism of wax ters and other lipids by the marine copepod, Calanus helgolandicus. J. Lipid Res. 11, 237-240 (1970).
  36. Lee, S. S., et al. Requirement of PPARalpha in maintaining phospholipid and triacylglycerol homeostasis during energy deprivation. J. Lipid Res. 45, 2025-2037 (2004).
  37. Singer, S. J. A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 195, 16-23 (1972).
  38. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
  39. Turkish, A. R., Sturley, S. L. The genetics of neutral lipid biosynthesis: an evolutionary perspective. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E19-E27 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Masa tłuszczowa C. elegansbarwienie Nile Redwykrywanie triglicerydówchromatografia gazowa ze spektrometrią maswysokoprzepustowe przesiewaniewizualizacja kropel lipidowychprotokół oparty na utrwalaniumikroskopia fluorescencyjnabadania nad metabolizmem tłuszczówanaliza lipidów neutralnych
Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.