Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Streszczenie

Nicień C. elegans stał się ważnym modelem do badania zachowanych szlaków genetycznych regulujących metabolizm tłuszczów w odniesieniu do ludzkiej otyłości i związanych z nią patologii. Kilka wcześniejszych metodologii opracowanych do wizualizacji zapasów tłuszczu bogatych w trójglicerydy C. elegans okazało się błędnych, podkreślając przedziały komórkowe inne niż kropelki lipidów. Inne metody wymagają specjalistycznego sprzętu, są czasochłonne lub dają niespójne wyniki. Wprowadzamy szybką, powtarzalną, opartą na utrwalaczu metodę barwienia czerwienią nilową w celu dokładnego i szybkiego wykrywania obojętnych kropelek lipidów u C. elegans. Krótki etap utrwalania w 40% izopropanolu sprawia, że zwierzęta są całkowicie przepuszczalne dla czerwieni nilowej, która jest następnie używana do barwienia zwierząt. Właściwości spektralne tego lipofilowego barwnika pozwalają mu silnie i selektywnie fluoryzować w żółto-zielonym widmie tylko w środowisku bogatym w lipidy, ale nie w bardziej polarnych środowiskach. W ten sposób kropelki lipidów można uwidocznić pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w prostą funkcję obrazowania GFP po zaledwie krótkim etapie barwienia czerwienią nilową w izopropanolu. Szybkość, przystępność cenowa i powtarzalność tego protokołu sprawiają, że idealnie nadaje się on do ekranów o wysokiej przepustowości. Demonstrujemy również sparowaną metodę biochemicznego oznaczania triglicerydów i fosfolipidów za pomocą chromatografii gazowej ze spektrometrią mas. Ten bardziej rygorystyczny protokół powinien być stosowany jako potwierdzenie wyników uzyskanych z mikroskopowego oznaczania lipidów czerwieni nilowej. Przewidujemy, że techniki te staną się nowymi standardami w dziedzinie badań metabolicznych C. elegans.

Wprowadzenie

Zachowanie szlaków metabolicznych między ludźmi a nicieniem Caenorhabditis elegans czyni go potężnym organizmem modelowym do badań nad otyłością. Podczas gdy C. Elegans nie mają adipocytów przeznaczonych do magazynowania tłuszczu, jak u ssaków, przechowują trójglicerydy w kropelkach^lipidów1 i posiadają wiele takich samych regulatorów magazynowania tłuszczu i zużycia energii^2,3. Aby oznaczyć poziom tłuszczu u C. elegans, zaproponowano kilka metod o różnym poziomie łatwości i skuteczności. Niegdyś powszechne stosowanie fluorescencyjnych, witalnych barwników^4-7 zostało ostatnio zakwestionowane, a odczynniki te okazały się barwić komorę odrębną od głównego magazynu tłuszczu C. elegans^1,8-11. Niefluorescencyjne barwniki na bazie utrwalacza, takie jak Sudan black i Oil-red-O, chociaż skutecznie podkreślają kropelki lipidów w robaku^12-14, nie mają tak dużego zakresu dynamicznego do oznaczania ilościowego, jak barwniki fluorescencyjne^8,13,15. Ponadto obecne metody utrwalania zarówno barwników fluorescencyjnych, jak i niefluorescencyjnych są czasochłonne i obejmują wiele etapów zamrażania i rozmrażania lub stosowania toksycznych substancji chemicznych^1,9,10 . Doniesiono, że stosowanie specyficznych analogów lipidowych znakowanych BODIPY uwydatnia kropelki lipidów po podaniu żywym robakom z krótkotrwałym znakowaniem¹⁵. Zależy to jednak od wychwytu barwnika i dlatego jest stronnicze przez obchodzenie się z C. elegans i metabolizm analogów kwasów tłuszczowych BODIPY. Uznaną alternatywą dla barwników barwiących lipidy jest bezznacznikowa, spójna mikroskopia anty-Stokesa rozpraszania Ramana (CARS) lub stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS), które wykorzystują charakterystyczne właściwości wibracyjne cząsteczek lipidów do wizualizacji zapasów tłuszczu^10,16,17 . Jednak do tej metody niezbędny jest drogi specjalistyczny sprzęt, a przepustowość jest w najlepszym razie niska.

Aby zaspokoić potrzebę szybkiej, skalowalnej analizy neutralnych zapasów lipidów w badaniach metabolicznych C. elegans, wprowadzamy nową, wysoce powtarzalną metodę barwienia czerwonych lipidów na bazie utrwalacza. Właściwości spektralne i fizykochemiczne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej indukują żółto-złote przesunięcie widmowe w jego piku wzbudzenia-emisji, umożliwiając mu fluoryzację w zielonym widmie emisyjnym tylko w środowisku bogatym w lipidy, ale nie w bardziej polarnych środowiskach^18,19 . W ten sposób kropelki lipidów można wykryć po prostym barwieniu za pomocą zestawu filtrów z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) do mikroskopii fluorescencyjnej. Łatwość i przystępność cenowa tej techniki sprawiają, że idealnie nadaje się ona do ekranów o wysokiej przepustowości. Demonstrujemy również sparowaną, rygorystyczną metodę biochemicznego oznaczania triglicerydów i fosfolipidów przy użyciu ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas. Biochemiczny pomiar lipidów koreluje z mikroskopowym oznaczaniem masy tłuszczowej C. elegans na podstawie czerwieni nilowej i powinien być stosowany jako potwierdzenie wyników uzyskanych za pomocą mikroskopowego oznaczania lipidów.

Protokół

1. Przygotowanie prostokątnych płytek agarowych Amp/Tet (A/T) LB i płytek NGM IPTG RNAi

A/T płytki powinny być przygotowane 1-4 tygodnie przed użyciem i przechowywane w ciemności w temperaturze 4 °C.

1. Na 1 l pożywki dodać 1 l wody dejonizowanej, 32 g agaru LB, 1,5 ml 2 M NaOH i 2 g agaru Bacto. Autoklaw 40 min w cyklu cieczy. Po schłodzeniu do temperatury 60 °C dodać 3 ml tetracykliny i 0,5 ml ampicyliny. Wlej 45 ml pożywki do każdej płytki.

Przygotuj 96-dołkowe płytki RNAi 3 dni do 2 tygodni wcześniej.

2. Aby wlać 25 96-dołkowych płytek RNAi, przygotuj 1 l pożywki dla nicieni (NGM): 1 l wody dejonizowanej, 3 g NaCl, 17 g agarozy i 2,5 g baktopeptonu. Cykl cieczy w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 40 minut z mieszadłem. Ostudzić, mieszając na płycie grzejnej ustawionej na 60 °C.
3. Po schłodzeniu do temperatury 60 °C dodać następujące roztwory podstawowe: 1 ml 1 M MgSO₄, 1 ml 5 mg/ml cholesterolu, 25 ml 1 M KH₂PO₄ (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl₂, 1 ml 200 mg/ml karbenicyliny i 5 ml 1 M IPTG (przepisy znajdują się w tabeli materiałów).
4. Dozować 150 μl pożywki RNAi do każdego dołka płaskodennej płytki 96-dołkowej za pomocą elektronicznego pipetora wielokanałowego. Unikaj pęcherzyków powietrza. Podczas dozowania należy przechowywać media w sterylnym pojemniku ze stali nierdzewnej zanurzonym w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C.
5. Utrzymuj płytki RNAi poziomo, aż agaroza zastygnie. Talerze można wylewać do 2 tygodni wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 °C.

Dzień 1

2. Stempluj zamrożone tabliczki biblioteczne na prostokątnych płytkach agarowych Amp/Tet (A/T) LB

1. Podgrzej płyty A/T do temperatury pokojowej, trzymając je w ciemności.
2. Przenieś 96-dołkowe płytki biblioteczne RNAi z temperatury -80 °C na suchy lód. Otwórz aluminiową płytkę w pobliżu palnika Bunsena.
3. Wysterylizuj 96-pinowy replikator, zanurzając szpilki szeregowo (po 10 sekund każdy) w 10% wybielaczu, dejonizowanym_H2Oi 70% EtOH, a następnie przepuszczając szpilki przez płomień. Powtórz krok EtOH i płomienia.
4. Nałożyć replikator na zamrożony 96-dołkowy zapas glicerolu RNAi, upewniając się, że każdy szpilka styka się z powierzchnią każdego dołka.
5. Stempluj na płytce A/T, rysując małe kółko każdym kołkiem bez uszkadzania powierzchni agaru.
6. Ponownie uszczelnić i zwrócić płytki biblioteczne do temperatury -80 °C. Inkubować wytłoczone płytki A/T w temperaturze 37 °C przez noc w celu rozwoju bakterii.

Dzień 2

3. Hoduj klony bakterii RNAi przez noc w blokach głębokich studni

1. Wyjąć płytki A/T z temperatury 37 °C i potwierdzić rozwój bakterii.
2. Napełnij każdą studzienkę 96-dołkowego bloku studni 1,5 ml LB z 200 μg/ml karbenicyliny.
3. Wysterylizuj 96-pinowy replikator (patrz krok 2.3).
4. Nałożyć replikator na górną część płytki A/T, upewniając się, że kołki stykają się z każdym klonem bakteryjnego RNAi. Podnieś replikator i zanurz kołki w bloku studni głębinowej. Obracaj i powoli usuwaj, uważając, aby nie zanieczyścić sąsiednich studzienek.
5. Blok uszczelniający z folią ułatwiającą oddychanie. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z mieszaniem (preferowane 950 obr./min w wytrząsarce MT Infors Microtiteron II lub 250 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem o rozkładzie 25 mm).

Dzień 3

4. Klony bakteryjne RNAi na 96-dołkowych płytkach RNAi NGM

1. Wyjąć 96-dołkowe płytki RNAi z 4 °C i ogrzać do temperatury pokojowej.
2. Usunąć bloki studni głębinowej i odwirować przez 10 minut przy 4 000 x g.
3. Szybko odwróć bloki do zlewu, aby odsączyć media, i stempluj odwrócone na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar mediów.
4. Pod okapem z przepływem laminarnym dodać 40 μl LB z 200 μg/ml karbenicyliny do każdej studzienki i zamknąć sterylną folią.
5. Włóż bloki do wytrząsarki bakteryjnej o temperaturze pokojowej na 10 minut, aby ponownie zawiesić granulki, lub ręcznie ponownie zawiesić granulki, ostrożnie pipetując.
6. W okapie z przepływem laminarnym usuń sterylny film i przenieś bakterie z bloków głębokiej studzienki na 96-dołkowe płytki RNAi. Dodać 40 μl zawieszonych bakterii do rzędów "A" i "H" oraz 35 μl ze wszystkich pozostałych rzędów. Więcej płynu dodaje się do studzienek brzegowych 96-dołkowej płytki RNAi, aby zapobiec przesuszeniu i pękaniu agarozy.
7. Pozostaw talerze odkryte do wyschnięcia w kapturze na 4-6 godzin, regularnie sprawdzając pod kątem wysuszenia. Suche bakterie wydają się klarowne, nie mętne. Przykryj, odwróć płytki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez noc.

5. Przygotuj synchroniczną populację robaków

Dwie 10-centymetrowe płytki wypełnione wieloma robakami grawitacyjnymi są używane do przygotowania jaj na każde 6 96-dołkowych płytek RNAi. Upewnij się, że robaki nie są głodzone przez co najmniej dwa pokolenia (7 dni).

1. Przygotuj synchroniczne populowanie L1 zgodnie z wcześniejszym opisem²⁰. Na 20 ml roztworu wybielacza użyj 4 ml wybielacza, 1 ml NaOH (10 M), 5 ml dejonizowanego_H2Oi 10 ml buforu M9.
2. Synchronizować robaki przez noc w 10 ml M9 w sterylnej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml obracającej się w temperaturze 20 °C.

Dzień 4

6. Dodaj robaki do płytek RNAi

1. Jaja wirować przygotować w temperaturze 3 000 x g przez 1 minutę. Odsysać supernatant, trzymając się z dala od osadu piskląt L1. Zawiesić w 5 ml buforze M9 z 0,0005% Triton X-100. Dodatek niewielkiej ilości detergentu zapobiega przywieraniu robaków do pipety i nie ma wpływu na plamienie tłuszczu.
2. Policz robaki pod mikroskopem. W razie potrzeby dostosuj stężenie do 10-15 robaków na mikrolitr.
3. W okapie z przepływem laminarnym, dla każdej 96-dołkowej płytki, która ma zostać wysiana, dodać 75 μl ponownie zawieszonych robaków do każdej studzienki w jednym rzędzie płytkiego bloku testowego. Za pomocą ręcznej pipety wielokanałowej dodaj 50-75 robaków w 5 μl do każdej studzienki z 96-dołkowymi płytkami RNAi.
4. Pozostaw talerze do wyschnięcia w okapie na 30 do 60 minut. Po wyschnięciu, pod mikroskopem, robaki powinny wydawać się pełzające, a nie miotające się.
5. Hoduj robaki na płytkach RNAi w temperaturze 20 °C przez ~64 godziny.

Dzień 7

7. Napraw i poplam robaki na czerwono Nilu

1. Wyjąć płytki RNAi z inkubatora. Zbadaj pod mikroskopem i zapisz zagłodzone lub młócące (mokre) studzienki, aby wykluczyć z dalszej analizy, ponieważ warunki te wpływają na masę tłuszczową.
2. Za pomocą elektronicznego pipetora wielokrotnego dodać 150 μl PBS z 0,01% trytonem X-100 do każdego dołka płytki RNAi. Za pomocą ręcznego pipetora wielokanałowego wymieszaj i przenieś płyn ze ślimakami do odpowiedniego rzędu na 96-dołkowej płytce do PCR. Unikaj zakłócania działania agaru. Powtórz tę czynność dla łącznie 300 μl robaków w PBS na studzienkę.
3. Po przeniesieniu czterech płytek odwirować płytki z prędkością 500 obr./min przez 1 minutę.
4. Odessać supernatant za pomocą 96-pinowego aspiratora próżniowego, pozostawiając ~25 μl cieczy i granulki robaka na dnie studzienki.
5. Dodaj 150 μl 40% izopropanolu do każdego dołka, aby utrwalić zwierzęta. Upewnij się, że pipetor pracuje na wystarczająco wysokiej prędkości, aby zmieszać osad robaka z 40% izopropanolem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
6. Płytki wirówkowe odkryte przy 500 obr./min przez 1 min.
7. Odessać supernatant za pomocą aspiratora 96-pinowego lub ręcznie, pozostawiając na dnie studzienki tylko 25 μl 40% izopropanolu + granulki robaka.
8. Do każdej studzienki dodać 150 μl roztworu barwiącego czerwień nilową przygotowanego bezpośrednio przed użyciem: 6 μl roztworu podstawowego czerwieni nilowej o stężeniu 0,5 mg/ml w acetonie na 1 ml 40% izopropanolu.
9. Uszczelnij płytkę niesterylną folią samoprzylepną i plamij w ciemności przez co najmniej 2 godziny.

8. Mycie i obrazowanie robaków na mikroskopie o wysokiej przepustowości

1. Wirować z prędkością 500 obr./min przez 1 minutę i odsysać tylko 25 μl czerwonego barwnika nilowego.
2. Do każdej studzienki dodać 150 μl PBS z 0,01% trytonem X-100 i przechowywać w ciemności przez co najmniej 30 minut.
3. Wirować z prędkością 500 obr./min przez 1 min.
4. Za pomocą 12-kanałowego pipetora odessać zwierzęta z dna każdej studzienki szybkimi pociągnięciami 2 x 7 μl i dozować na 96-dołkowe szkiełko podstawowe z nadrukiem teflonowym. Ostrożnie, nie usuwając robaków, usuń 9,5 μl PBS z każdej studzienki szkiełka. Jeśli szklane szkiełko nie pasuje bezpośrednio do uchwytu mikroskopu, do montażu ślimaków należy użyć niestandardowego, obrabianego maszynowo aluminiowego uchwytu szkiełka.
5. Powoli opuść pokrywę wsuń na szkiełko 96-dołkowe. Ten krok może wymagać pewnej praktyki, aby uniknąć pęcherzyków lub krzyżowania się robaków z innymi studniami. Zabezpiecz narożniki za pomocą kleju klejącego.
6. Szkiełko obrazu w jasnym polu i fluorescencji z filtrem GFP/FITC ustawionym na mikroskopie automatycznym. Sygnał lipidowy łatwo ulega fotowybielaniu, dlatego powinien być obrazowany w sposób systematyczny we wszystkich studzienkach, a nie ręcznie, ponieważ fotowybielanie doprowadzi do sztucznych różnic między studzienkami. Więcej informacji na temat analizy można znaleźć w sekcji Reprezentatywne wyniki i dyskusja.

9. Biochemiczne oznaczanie lipidów za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC/MS)

W celu walidacji poziomów lipidów na podstawie fluorescencji czerwieni nilowej, chromatografia gazowa, a następnie analiza spektrometrii mas (GC/MS) mogą być przeprowadzone na estrach metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) pochodzących z triacylogliceroli (TAG) i fosfolipidów (PL) z granulek robaków. Czynności związane z substancjami organicznymi należy wykonywać pod wyciągiem. Należy zadbać o to, aby lipidy były trzymane w nazocie chronionym przed światłem podczas dłuższych etapów przechowywania lub inkubacji, ponieważ są one bardzo podatne na utlenianie. Jako materiał wejściowy stosuje się granulki robaków od 2 500-5 000 zwierząt synchronicznych, przygotowane dokładnie tak, jak powyżej, z wyjątkiem tego, że zwierzęta są hodowane na 10 cm płytkach RNAi.

1. Umyj 2 500-5 000 robaków z każdej 10 cm płytki z 10 ml buforu M9 do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml. Granulki rozsiewać w ilości 500 x g przez jedną minutę i ponownie przemyć granulat 10 ml buforu M9. Zwierzęta na pellet po 500 x g. Odessać, pozostawiając 250 μl całkowitej objętości, i albo zamrozić na ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C w azocie do późniejszego przetwarzania, albo kontynuować bezpośrednio.
2. Osad robaka można przenieść bezpośrednio do kroku 9.3, jeżeli masa triglicerydów ma być znormalizowana do masy fosfolipidowej^8,13,21. Jednakże, jeśli badacz pragnie normalizacji zawartości białka lub zawartości DNA, osad robaka powinien być sonikowany z najwyższą intensywnością w sonikatorze kąpielowym przez 10 minut, 30 sekund włączenia, 30 sekund wyłączenia, w temperaturze 4 °C. Jeśli pożądana jest normalizacja białka lub DNA, należy usunąć podwielokrotność 5 μl i oznaczyć całkowite stężenie białka za pomocą odczynnika Bradforda lub podobną lub całkowitą zawartość DNA po oczyszczeniu kolumny za pomocą spektrofotometru UV.
3. Dodaj robaki do 1,5 ml chloroformu:metanolu w proporcji 2:1 w gwintowanej probówce ze szkła borokrzemianowego. Wszelkie przenoszenie rozpuszczalników organicznych powinno odbywać się za pomocą szklanych pipet.
4. Za pomocą pipety wiretrol 50 μl dodać 25 nM wzorca fosfolipidowego w 50 μl i wzorca triglicerydów 16,7 nM w 50 μl. Oba wzorce należy rozpuścić w chloroformie i metanolu w proporcji 2:1, szczelnie zamknąć i przechowywać pod azotem chronionym przed światłem w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aby uniknąć utleniania.
5. Czapka z fenolową czapeczką i wirem. Ekstrakt przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, wirowanie co 15 minut.
6. Wirować z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut. Przenieść dolną fazę organiczną bez tusz do probówki do hodowli borokrzemianów.
7. Dodać 0,3 ml 0,9% NaCl, wirować i wirować z prędkością 1 000 obr./min przez 5 min.
8. Przenieś dolną warstwę organiczną do świeżej probówki do hodowli borokrzemianów, uważając, aby nie przenieść żadnej fazy wodnej.
9. Sucha faza organiczna pod azotem. Aby rozpocząć ekstrakcję do fazy stałej (SPE), ponownie zawiesić wysuszony lipid w 1 ml chloroformu. Alternatywnie, w celu szczegółowego oddzielenia i analizy różnych klas lipidów, w tym klas fosfolipidów, glikolipidów, sfingolipidów, diacylogliceroli, triacylogliceroli, wolnych kwasów tłuszczowych i estrów cholesterolu, zamiast SPE można zastosować chromatografię cienkowarstwową, zapoczątkowaną przez laboratorium Watts w C. elegans²². Lipidy mogą być również rozdzielane za pomocą HPLC, a frakcje analizowane przez GCMS. Można również stosować zaawansowane metody profilowania całego lipidomu metodą chromatografii cieczowej/MS (LCMS)^23-26.
10. Zamontuj krzemionkową kolumnę SPE na kolektorze SPE. Kolumnę wstępnie równoważącą z 3 ml chloroformu. Pozwolić rozpuszczalnikowi przepływać grawitacyjnie.
11. Załadować próbkę lipidów do kolumny SPE, zbierając przepływ w gwintowanej rurce borokrzemianowej jako część pierwszej frakcji (frakcja TAG). Większość neutralnych lipidów pojawi się w tym pierwszym 1 ml przepływu. Dodać 3 ml chloroformu, aby całkowicie wymyć frakcję TAG, zbierając przepływ w probówce z frakcją TAG.
12. Wyjmij i zakryj pierwszą probówkę zbiorczą, a następnie zastąp ją czystą probówką. Eluować glikosfingolipidy za pomocą 5 ml acetonu 9:1: metanolu. Nie analizujemy rutynowo składu kwasów tłuszczowych tej frakcji, jednak może ona zawierać cenne informacje i może być zachowana w celu przygotowania estrów metylowych i wolnych zasad sfingoidowych do dalszej analizy przy użyciu specjalistycznych procedur innych niż te dla TAG i PL, jak opisano wcześniej ²⁷.
13. Zastąp probówkę do pobierania glikosfingolipidów drugą gwintowaną probówką do pobierania borokrzemianów. Eluować fosfolipidy za pomocą 3 ml metanolu (frakcja PL).
14. W tym momencie frakcje mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C, szczelnie zamknięte pod azotem. Suche oczyszczone lipidy pod azotem. Do przyspieszenia suszenia, w suchym bloku grzewczym w temperaturze 33 °C. Nigdy nie przechowuj lipidów w postaci suchej, ponieważ są one szczególnie podatne na utlenianie w stanie wysuszonym.
15. Zawiesić wysuszone frakcje lipidowe w 2 ml 2% H_2SO4 w metanolu przez wirowanie i inkubować szczelnie zamknięte przez noc w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C, aby utworzyć FAME. Należy zachować ostrożność, aby w reakcji FAME nie było absolutnie żadnej wody, ponieważ znacznie zahamuje to derywatyzację lipidów. Znaleźliśmy bardziej wydajną derywatyzację przez inkubację przez noc, a literatura sugeruje, że mniejsze utlenianie lipidów zachodzi w niższych temperaturach podczas przygotowania FAME²⁸. Alternatywną i szybszą metodą jest użycie 2 ml 2,5% H_2SO4 w metanolu i derywatyzacja przez jedną godzinę w temperaturze 70 lub 80 °C^21,22,29 .
16. Następnego ranka wyjmij z kąpieli i pozostaw do ostygnięcia. Dodać 1,5 ml_H2O(w celu wygaszenia reakcji), a następnie 0,3 ml heksanu (w celu ekstrakcji FAME) do każdej frakcji TAG i PL. Wstrząsnąć energicznie i odwirować z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut.
17. Bardzo ostrożnie usuń tylko górną warstwę heksanu za pomocą standardowej pipety lub pipety Pasteura. Dozować do probówki automatycznego podajnika próbników. Upewnij się, że nie dodajesz zakwaszonego metanolu, ponieważ spowoduje to zniszczenie kolumny GC i MSD.
18. Zakryj i załaduj próbki do GC/MS. Próbka jest przenoszona w heksanie do fiolki Agilent z mikrowkładką zaślepioną nakrętką z PTFE-silikon-PTFE. Jest on przenoszony do Agilent GCMS model 6890/5973N wyposażonego w kolumnę kapilarną Supelcowax-10 (24079) o długości 30 metrów i grubości 250 mikronów z topionej krzemionki. Jeden mikrolitr jest wstrzykiwany do bezdzielnego wlotu ustawionego na 250 °C i 13,33 PSI. Jako gaz nośny stosuje się ultraczysty hel. Przebieg protokołu jest następujący przy stałym poziomie 1 ml na minutę:

krok polecenie Temperatura bramki 1 Przytrzymaj 2 min 150 °C cyfra arabska Rampa 10 °C na minutę 200 °C 3 Przytrzymaj 4 min 200 °C 4 Rampa 5 °C na minutę 240 °C 5 Przytrzymaj 3 min 240 °C 6 Rampa 10 °C na minutę 270 °C 7 Przytrzymaj 5 min 270 °C

A 3-minutowe opóźnienie rozpuszczalnika jest stosowane w MSD, aby zminimalizować zużycie filamentu. Następnie wykrywane są masy od 50 do 550 daltonów przy poczwórnym ustawieniu MS na 150 °C i źródle ms na 230 °C, przy pomocniczej termicznej temperaturze 270 °C.

Wyniki

Przykład zobrazowanej płytki, która została poddana procesowi barwienia tłuszczu, jest pokazany na rysunku 1. Specyficzne kontrole dla wysokotłuszczowych (receptor insuliny daf-2 RNAi), niskotłuszczowych (białko lpd-3 wymagane do granulek magazynujących lipidy w RNAi jelitowym), małych i niskotłuszczowych (RNAi syntazy kwasów tłuszczowych fasn-1) i pustego wektora (kontrola) pokazują zmiany intensywności fluorescencji w zależności od poziomu tłuszczu zwierząt i odpowiadających im ilości lipidów określonych za pomocą analizy GC/MS (Rysunek 2). Należy zauważyć, że inaktywacje genów prowadzące do zatrzymania rozwoju małych zwierząt często wydają się mieć znacznie niższą zawartość tłuszczu niż dorosłe zwierzęta kontrolne, niezależnie od jakiegokolwiek związku z metabolizmem tłuszczów (ryc. 3). Analizy wtórne, w tym analiza barwienia i biochemia lipidów za pomocą SPE-GCMS zwierząt kontrolnych typu dzikiego o podobnym stadium rozwojowym, muszą być przeprowadzone w celu zapewnienia ważności małych lub zatrzymanych rozwojowo dodatnich trafień. W przypadku fasn-1 RNAi (ryc. 2), zwierzęta zatrzymują się w stadium larwalnym L2 lub L3 i mają zabarwienie tłuszczu niższe niż dorosłe kontrolne RNAi, ale podobne pod względem liczebności do kontrolnych RNAi w stadium L2-L3 (procent zabarwienia tłuszczu w kontrolnym RNAi dorosłego osobnika: 49,9 ± 4,5% dla RNAi fasn-1 i 20,2 ± 2,1% dla RNAi kontrolnego L2, i 64,7 ± 1,3 dla kontrolnego RNAi L3). Alternatywnie, analiza biochemiczna wykazała niższy stosunek TAG/PL niż u zwierząt kontrolnych N2 dopasowanych do stadium L2 (TAG/PL: 22,5 ± 2,9 dla fasn-1 RNAi i 46,1 ± 3,4 dla kontrolnego RNAi dopasowanego do etapu, P ≤ 0,05). Tak więc w tym przypadku można potwierdzić za pomocą analizy biochemicznej, że fasn-1 odgrywa rolę w magazynowaniu lipidów, a nie tylko w specyficznej dla danego etapu redukcji masy tłuszczowej.

Późniejsza analiza obrazowanych robaków opiera się w dużej mierze na platformie obliczeniowej, takiej jak Cell Profiler przy użyciu WormToolbox³⁰. W przypadku mniejszej liczby obrazów można skorzystać z publicznie dostępnej platformy analizy obrazu, takiej jak ImageJ, dostępnej bezpłatnie w NIH. Do naszej analizy wykorzystano najpierw unikalne skrypty Matlaba do identyfikacji studni, a następnie do wykluczenia pustych studni lub tych z pęcherzykami oraz odróżnienia małych śmieci od robaków. Ręczna kontrola jakości była konieczna w przypadku obrazów oznaczonych do wykluczenia z powodów wymienionych powyżej. Odkryliśmy empirycznie, że intensywność 90. percentyla pikseli robaka w studzience, znormalizowana do obszaru robaka w studzience, zapewniła spójną metrykę intensywności barwienia na wszystkich etapach rozwoju robaka (ryc. 3). Wręcz przeciwnie, integracja całkowitej masy tłuszczowej na obszarze robaka miałaby tendencję do nacinania małych jasnych robaków na równi z dużymi, ciemnymi robakami. Ponieważ nasza metoda nie integruje całkowitego sygnału fluorescencyjnego na obszarze robaka, biorąc percentyl intensywności, zmiany w rozmiarze robaka same w sobie nie wpływają na zmierzoną intensywność. Zamiast tego mierzone są różnice w rozkładzie intensywności pikseli. Jednak pomimo tego obserwuje się wyraźne różnice w rozkładzie intensywności barwienia pikseli między zwierzętami na różnych etapach rozwoju, dlatego ważne jest, aby zbadać wpływ RNAi na dowolny gen przeciwko zwierzętom o porównywalnym stadium rozwojowym (ryc. 3). Średnia zmienność między kontrpróbami jest pokazana na rysunku 4, co wskazuje na wysoką odtwarzalność metody barwienia tłuszczu. Należy zauważyć, że siła metody jest w dużym stopniu zależna od uzyskania wysokiej jakości obrazów dla każdej płytki, w jednolitych warunkach oświetleniowych, przy użyciu identycznych czasów naświetlania i przy minimalnej ilości pęcherzyków, zanieczyszczeń lub krzyżowania się robaków z innymi studzienkami.

SPE zostało przeprowadzone na wstępnie zmieszanych, oczyszczonych wzorcach, aby określić stopień, w jakim TAGi mogą być oddzielone od PL (Rysunek 5A). W tej analizie osiągnęliśmy 100% separację TAG i PL, wskazywaną jako całkowity brak kwasów tłuszczowych 17:0 pochodzących z PL w próbce TAG i odpowiadający jej całkowity brak 13:0 kwasów tłuszczowych pochodzących z TAG w próbce PL (rysunek 5A). W ten sposób SPE jest wysoce skuteczny w rozdzielaniu klas lipidów. Analiza ta nie wskazuje, że wszystkie TAGi o różnych długościach łańcuchów będą oczyszczane w równym stopniu przez SPE i wykrywane przez GCMS z podobną wydajnością. Zapewnia jedynie, że lipidy TAG i PL w sumie są całkowicie oddzielone od siebie.

Próbka GC-MS zwierząt dzikich typu N2 pobrana przez ekstrakcję do fazy stałej i przygotowanie FAME jest pokazana na rysunku 5B. Zarówno dla TAG, jak i PL piki można zidentyfikować na podstawie czasu retencji oraz jonów macierzystych i potomnych w widmie masowym, a całkowity obszar pod zidentyfikowanymi pikami znormalizowany do obszaru odpowiednich wzorców wewnętrznych. W celu określenia znormalizowanej ilości TAG, obszar pod wszystkimi pikami chromatogramu TAG, z wyjątkiem wzorca 13:0, został zsumowany i podzielony przez obszar pod pikiem 13:0. Podobnie, aby określić znormalizowaną całkowitą ilość PL, obszar pod wszystkimi szczytami, z wyjątkiem normy 17:0, został zsumowany i podzielony przez obszar pod szczytem 17:0. Znormalizowane wartości dla próbek TAG i PL są następnie wykorzystywane do obliczenia końcowego stosunku TAG/PL dla próbki:

Należy zauważyć, że dane z SPE-GCMS pozwalają na znacznie bardziej wyrafinowaną analizę kwasów tłuszczowych obecnych w każdej frakcji lipidowej niż proste obliczenie całkowitego stosunku TAG do PL. Na przykład, badacz może zintegrować pojedynczy pik odpowiadający pojedynczemu kwasowi tłuszczowemu i porównać jego znormalizowaną obfitość w próbkach (np. porównując w N2 RNAi typu dzikiego i daf-2 zintegrowaną powierzchnię piku 18:0 podzieloną przez pik wzorcowy 13:0, znormalizowaną do całkowitej masy PL podzieloną przez standardową powierzchnię piku PL 17:0):

Jeśli badacz zechce, możliwe będzie również określenie procentowej zawartości danego kwasu tłuszczowego we frakcjach TAG lub PL jako procentu całkowitej ilości kwasów tłuszczowych oznaczonych ilościowo (na przykład 18:0 we frakcji TAG u robaków N2):

Rysunek 1. Typowy przepływ pracy dla całego eksperymentu. Dzień 1, zamrożone płytki biblioteczne RNAi są stemplowane na płytkach agarowych Amp/Tet LB i inkubowane w temperaturze 37 °C. Dzień 2, płytki Amp/Tet są używane do wysiewu płynnych kultur klonów RNAi w blokach studni głębinowych. Dzień 3, bakterie są zagęszczane przez wirowanie i przenoszone na 96-dołkowe płytki RNAi. Dzień 4, pisklę L1 C. elegans dodaje się do płytek RNAi w płynie i pozostawia do wyschnięcia. Dzień 7, zwierzęta są zbierane w płynie, barwione czerwienią nilową w 40% izopropanolu, umieszczane na 96-dołkowych szkiełkach teflonowych i obrazowane za pomocą mikroskopu o wysokiej przepustowości.

Rysunek 2. Czerwień nilowa na bazie utrwalacza główne zapasy tłuszczu C. elegans. Pokazano reprezentatywne obrazy fluorescencji w jasnym polu i GFP robaków N2 karmionych klonami RNAi FASN-1 (małe, niskotłuszczowe), lpd-3 (niskotłuszczowe), kontrolne (pusty wektor) lub daf-2 (wysokotłuszczowe). Próbki zostały przetworzone zgodnie z protokołem (schemat na rysunku 1). Zwierzęta utrwalone, zabarwione czerwienią nilową i zobrazowane dają porównywalne poziomy lipidów, jak uzyskano z biochemicznego pomiaru lipidów. Poziomy fluorescencji czerwieni nilowej utrwalone izopropanolem, uzyskane z co najmniej 6 kontrprób biologicznych, pokazano w pierwszym rzędzie. Ilościowe poziomy trójglicerydów, odzwierciedlające ogólne neutralne zapasy lipidów po znormalizowaniu do ogólnych poziomów fosfolipidów (TAG / PL), pobrane z 4 kontrprób biologicznych, przedstawiono w drugim rzędzie. Ważne jest, aby pamiętać, że bezwzględna ocena ilościowa uzyskana dzięki utrwalającemu barwieniu czerwienią nilową i biochemicznemu oznaczaniu lipidów często nie pasuje idealnie. W tym przypadku, choć jakościowo podobny, fasn-1 (RNAi) ma więcej różnej masy trójglicerydów w porównaniu z kontrolą metodami biochemicznymi, niż wskazuje na to mikroskopia, lpd-3 jest porównywalnie inny, a daf-2 (RNAi) jest mniej różny, chociaż wszystkie różnice są wysoce istotne statystycznie, a pomiary były wysoce powtarzalne. Przedstawione dane są średnimi ± SEM (*, P ≤0,01; **, P ≤ 0,0001 względem kontroli, wyznaczonymi za pomocą niesparowanego, dwustronnego testu T przy założeniu równej wariancji).

Rysunek 3. Masa tłuszczowa określona przez utrwalenie czerwieni nilowej w różnych stadiach larwalnych. Zwierzęta hodowano na bakteriach OP50 i zbierano w stadium rozwoju L1, L2, L3, L4 i gravid dorosłego osobnika. Obrazy zostały przechwycone po barwieniu fiksacyjnym i przeanalizowane przy użyciu dostosowanego skryptu Matlab w celu określenia 90^{. percentyla} intensywności pikseli w zidentyfikowanym obszarze robaka. Należy zauważyć, że poziom lipidów u zwierząt znacznie wzrasta, gdy zwierzę rozwija się od etapu L2 do L4, a następnie nieznacznie spada, gdy zwierzę zaczyna kierować kalorie w kierunku proliferacji linii zarodkowej w stadium dorosłym. Przedstawione dane są średnimi ± SEM dla 6-8 powtórzeń (**, P ≤ 0,0001 w stosunku do ciężaru dorosłego osobnika, określone za pomocą niesparowanego, dwustronnego testu T).

Rysunek 4. Wysoka odtwarzalność w niezależnych kontrpróbach biologicznych. Pokazano wykres punktowy intensywności fluorescencji czerwieni nilowej w replikacjach biologicznych (n = 6-8). Dla każdej repliki wszystkie wartości są normalizowane do średniej intensywności pustych kontrolek wektorowych. Przedstawione dane są średnimi ± SEM (**, P ≤ 0,0001 względem kontroli, wyznaczonymi za pomocą niesparowanego, dwustronnego testu T przy założeniu równej wariancji).

Rysunek 5. Chromatogramy GC-MS z oddzielonymi wzorcami SPE i obfitością TAG i PL typu dzikiego. (A) Przedstawiono ślady GC-MS separacji SPE norm TAG i PL. Należy zwrócić uwagę na całkowity brak kwasu tłuszczowego 13:0 w śladzie PL i odpowiadający mu brak kwasu tłuszczowego 17:0 w śladzie TAG, co wskazuje na całkowite oddzielenie TAG (tritridekaniny) od PL (1,2-diheptadecanoilo-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol)). (B) Reprezentatywne pełne spektrum TAG i PL z próbki zwierząt typu dzikiego N2 karmionych RNAi kontrolnym wektorem (bakterie HT115 z L4440 pustym wektorem RNAi). Jeden mikrolitr próbki wstrzyknięto do Agilent 6890/5973N GCMS zgodnie z protokołem, a poszczególne piki zidentyfikowano na podstawie czasu retencji i odpowiadających im widm masowych. Skróty: cyklo, cyklopropan kwas tłuszczowy; ISO: izometylowy kwas tłuszczowy o rozgałęzionych łańcuchach; GLA, kwas gamma-linolenowy; ALA, kwas alfa-linolenowy; DGLA, kwas dihomo-gamma-linolenowy; EPA, kwas eikozapentaenowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Dyskusja

Przedstawiony protokół pozwala na szybkie, zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe poziomu lipidów u C. elegans, które można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. W przeciwieństwie do wcześniej stosowanych metod, które obejmują długi etap utrwalania w paraformaldehydzie, po którym następuje kilka cykli zamrażania i rozmrażania^8,10 , nasz protokół wymaga prostego 3-minutowego utrwalania w izopropanolu. Odkryliśmy, że poprzez barwienie C. eleganów w 40% izopropanolu, stają się swobodnie przepuszczalne dla czerwieni nilowej, bez użycia dodatkowych etapów zamrażania-rozmrażania czy utrwalania. Ponadto, ponieważ czerwień nilowa selektywnie fluoryzuje w przedziałach hydrofobowych w zielonym widmie^18,19,31 , odbarwienie nie jest konieczne. W sumie zwierzęta można pobrać z płytek RNAi do wybarwionych i gotowych do obrazowania zwierząt w nieco ponad 2,5 godziny. Metodę tę można wykonać stosunkowo niedrogo i z wysoką powtarzalnością. Metoda ta nie zależy od zdolności C. elegans do wchłaniania lub koncentracji barwnika, a zatem nie ma takich samych ograniczeń, jak metody oparte na żywieniu z użyciem barwników witalnych. Biorąc pod uwagę powtarzalność i precyzję pomiarów, metoda ta nadaje się do badań przesiewowych dużej liczby inaktywacji genów przez RNAi. Jeśli pożądane jest ilościowe określenie poziomu lipidów na podstawie utrwalającego barwienia czerwienią nilową, zalecamy użycie 4-6 powtórzeń biologicznych z odpowiednimi kontrolami i zastosowanymi testami statystycznymi.

Jest prawdopodobne, że wiele inaktywacji genów prowadzących do małych zwierząt (z powodu klonów RNAi powodujących opóźniony lub zatrzymany rozwój) wyjdzie z badania przesiewowego pod kątem regulatorów tłuszczu, niezależnie od jakiegokolwiek związku z metabolizmem tłuszczów. Podczas gdy zastosowany przez nas program do analizy obrazu uwzględnia robaki o różnych rozmiarach poprzez normalizację intensywności fluorescencji w obszarze robaka, poszczególni badacze mogą również rozważyć porównanie poziomów zabarwienia tłuszczem małych zwierząt ze zwierzętami typu dzikiego o podobnym etapie rozwoju. W przypadku małych lub zatrzymanych w rozwoju zwierząt o pozornie niskiej masie tłuszczowej sugerujemy, że żadna pojedyncza modalność nie jest wystarczająca, aby wykazać zmieniony metabolizm lipidów. Konieczne może być przeprowadzenie kilku eksperymentów uzupełniających, w tym SPE-GCMS, w celu ustalenia funkcji regulatora lipidów tych genów. W przypadku znanego regulatora metabolizmu fasn-1, analiza SPE-GCMS w porównaniu z dopasowanymi rozwojowo zwierzętami kontrolnymi N2 L2 była konieczna, aby potwierdzić pozorny fenotyp o niskiej zawartości tłuszczu stwierdzony w porównaniu z dorosłymi zwierzętami kontrolnymi. Podczas gdy barwienie czerwonym tłuszczem nilowym wskazywało na niższy poziom tłuszczu w porównaniu z kontrolnym dorosłym RNAi, w porównaniu z dopasowanymi do etapu zwierzętami kontrolnymi L2 RNAi, nie zaobserwowano widocznej różnicy. W związku z tym konieczne było zastosowanie drugiej metody, tj. biochemicznej kwantyfikacji stosunku TAG/PL w celu ustalenia, że fasn-1 jest prawdziwym regulatorem masy tłuszczowej, ponieważ fasn-1 RNAi jest biochemicznie odróżnialny od zwierząt kontrolnych L2 RNAi dopasowanych w stadium.

Podczas gdy prezentujemy obrazowanie i przetwarzanie dla platformy o wysokiej przepustowości, konwencjonalny mikroskop pionowy może być z łatwością używany do przechwytywania obrazów z robaków zamontowanych na podkładkach agarozowych²⁰ lub na konwencjonalnych szkiełkach mikroskopowych o rozmiarach teflonowych od 8 do 12 dołków. Jedynym ograniczeniem jest to, że ponieważ zielona fluorescencja kropelek lipidów barwionych czerwienią nilową szybko ulega fotowybielaniu, należy stosować systematyczne, jednolite warunki ekspozycji, aby zapewnić porównywalność obrazów. Okazuje się, że w pełni zautomatyzowany mikroskop z jednolitymi warunkami akwizycji obrazu najlepiej sprawdza się w tym celu.

Jedną z największych zalet tego protokołu jest to, że po zebraniu obrazów można je zapisać do ponownej analizy w przyszłości. Te same obrazy można wykorzystać do określenia wielkości ciała oprócz zawartości tłuszczu. Co więcej, w miarę jak programy obliczeniowe stają się coraz bardziej zaawansowane, pojawia się perspektywa analizy pojedynczego robaka, generującej statystycznie istotne wyniki z pojedynczego odwiertu. Tak więc nasza metoda, która wykorzystuje mikroskopię wysokoprzepustową, ma pewne zalety w porównaniu z opublikowanymi metodologiami przesiewowymi, które wykorzystują Copas Biosort do ilościowego oznaczania sygnałów fluorescencyjnych^32,33 . Jednak metodologie są zdecydowanie komplementarne.

Precyzyjne, biochemiczne oznaczanie zawartości lipidów za pomocą SPE i GC/MS potwierdza zabarwienie czerwienią nilową głównych zapasów tłuszczu u C. elegans. Chociaż bezwzględna ocena ilościowa uzyskana dzięki utrwalającemu barwieniu czerwienią nilową i biochemicznemu oznaczaniu lipidów często nie jest idealnie dopasowana, obie metody dają wysoce powtarzalne, statystycznie istotne wyniki, które zgadzają się jakościowo. Ponadto metoda ta może być dostosowana do specyficznych potrzeb poszczególnych badaczy, którzy mogą wymagać dalszej analizy poszczególnych klas glikosfingolipidów, fosfolipidów lub trójglicerydów obecnych w różnych próbkach. Należy zauważyć, że inne grupy stosowały technologię inną niż SPE do wyodrębnienia klas lipidów przed GC/MS²². Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) i wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC) mają przewagę nad SPE w tym, że mogą być w stanie lepiej oddzielić odrębne obojętne lipidy (np. TAG, diacyloglicerole, wolne kwasy tłuszczowe i estry cholesterolu) od polarnych lipidów (fosfatydylocholiny, fosfatydyloetanoloaminy) i glikolowo-sfingolipidów. Wybieramy SPE, ponieważ wymaga minimum materiału wyjściowego (2 500-5 000 robaków), kładzie nacisk na główne długoterminowe magazyny energii, TAG, które stanowią większość neutralnej frakcji lipidowej⁴ i jest szybki, nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani płytek. Należy podkreślić, że w oparciu o standardowe mieszaniny, SPE całkowicie oddziela TAG od PL i jest wysoce powtarzalne i niezawodne (patrz rysunek 5A). Podczas gdy kwantyfikacja i analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych wymaga GC/MS, sprzęt ten jest powszechnie dostępny, a jeśli nie lokalnie, próbki mogą być generowane jak powyżej i przechowywane w temperaturze -80 °C w azocie do czasu zorganizowania analizy przez współpracownika lub komercyjną usługę GC/MS.

Dane wyjściowe GCMS zawierają dane o wysokiej rozdzielczości dotyczące każdego kwasu tłuszczowego w każdym gatunku lipidów. Pozwala to na określenie szczegółowych różnic między porównywanymi próbkami. Na przykład badacz może określić, czy poziomy niektórych kwasów tłuszczowych uległy zmianie w obfitości bardziej znacząco niż inne w przypadku daf-2, lpd-3 lub fasn-1 RNAi w porównaniu z kontrolą wektorową. To niezwykle potężne narzędzie może zatem dostarczyć szczegółowych informacji na temat tego, które gatunki lipidów są obficie zmieniane przy każdej eksperymentalnej manipulacji.

Na potrzeby naszej analizy najczęściej normalizujemy masę TAG do masy PL. Podczas gdy białko lub DNA mogą być również używane do normalizacji masy lipidowej po oznaczeniu z podwielokrotności sonikowanego osadu robaka, okazuje się, że metody te są podatne na błędy ludzkie podczas wszystkich etapów pipetowania i odzyskiwania próbki z każdej ekstrakcji. Z tego powodu zdecydowaliśmy się zamiast tego użyć masy PL jako naszego współczynnika normalizacji. Nienaturalne wzorce wprowadzone na początku protokołu (tritridekanina dla TAG, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) dla PL) są przeprowadzane przez wszystkie etapy ekstrakcji do fazy stałej i przygotowania FAME i gwarantują ilościowy i reprezentatywny odzysk zarówno frakcji TAG, jak i PL. Takiej samej gwarancji nie można udzielić, jeśli badacze używają białka lub DNA do normalizacji masy TAG. Uważamy, że PL jest najsolidniejszym wskaźnikiem, za pomocą którego można porównać poziomy TAG w różnych próbach, ponieważ wcześniej wykazano, że PL jest tylko nieznacznie zmieniany przez ten sam bodziec powodujący duże przesunięcia masowe w poziomach TAG, np. przedłużający się głód lub zwiększony wysiłek fizyczny^34-36. Uważa się, że PL odgrywają rolę strukturalną, zapewniając płynność błony i integralność komórkową oraz role sygnalizacyjne, a nie jako magazyn energii^37-39. W naszych rękach stosunek TAG/PL najbardziej odpowiada temu, co uzyskuje się przez utrwalanie lipidów czerwienią nilową i zgadza się z tym znalezionym przez inne grupy²¹. Alternatywną strategię stosuje laboratorium Wattsa, w którym oblicza się procent lipidowego TAG w stosunku do całkowitych lipidów^9,22,29 .

Zastosowanie nierodzimych typów wzorca TAG i PL gwarantuje, że w obliczeniach normalizacyjnych nie zostaną uwzględnione żadne natywne kwasy tłuszczowe. Wybór długości łańcucha opiera się wyłącznie na potrzebie tych wzorców, aby nie zakłócać widm masowych natywnych kwasów tłuszczowych. Odkryliśmy, że kwasy tłuszczowe 13:0 i 17:0 najlepiej służą temu celowi. Biorąc pod uwagę różne właściwości chemiczne krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, możliwe jest, że nasze nienaturalne standardy kwasów tłuszczowych mogą nie być reprezentatywne dla odzyskiwania wszystkich kwasów tłuszczowych o długości łańcucha lub łańcuchów o różnych wskaźnikach nasycenia. W związku z tym możliwe jest, że podczas SPE lub GCMS możemy zaobserwować różnice w skuteczności oczyszczania lub detekcji między lipidami o różnych długościach łańcuchów. Na tej podstawie oraz różnej jonizacji różnych kwasów tłuszczowych w GCMS nie jest możliwe jednoznaczne stwierdzenie obfitości danego kwasu tłuszczowego. Dlatego porównujemy tylko próbki w ramach jednego eksperymentu obfitości danego kwasu tłuszczowego. Jeśli ktoś chciałby bezwzględnie określić ilościowo kwas tłuszczowy, jednym ze sposobów, w jaki można by to osiągnąć, byłoby przeprowadzenie próbki przygotowanej w sposób opisany powyżej wzbogaconą znaną ilością stabilnie izotopowo znakowanej ^{wersji 13}C tego lub podobnego kwasu tłuszczowego, tak aby można ją było rozróżnić na podstawie masy jonu macierzystego w MSD. na przykład. Biorąc pod uwagę, że porównujemy tylko względne ilości klas lipidów lub dowolnego danego kwasu tłuszczowego, nasze standardy 13:0 TAG i 17:0 PL służą temu celowi odpowiednio, przy minimalnych kosztach, aby zapewnić odpowiedni i reprezentatywny odzysk każdej klasy lipidów.

Do tej pory nie było konsensusu co do interpretacji niektórych wyników uzyskanych za pomocą różnych metodologii oraz co do tego, jakie powinny być dominujące metodologie. Ogólnie rzecz biorąc, należy zauważyć, że żadna metoda w izolacji nie jest idealnie odpowiednia do badania metabolizmu tłuszczów u C. elegans. Jednak stosując wiele metod badań przesiewowych i walidacji, można uzyskać pewność co do uzyskanych danych dotyczących genów regulatorowych lipidów. W związku z tym chcemy, aby nasz protokół służył jako punkt odniesienia dla przyszłych prac w dziedzinie badań nad tłuszczami C. elegans .

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96-pinowy replikator	Nunc	250520
LB Agar	US Biologicals	L1500
Agaroza	Invitrogen	16500500
Pipety mechaniczne	Biohit M Line	M10, M100, M300
Pipeta elektroniczna	Biohit E Line	E1200
1 M KH2PO4	Sigma	P0662	pH 6,0 Sterylizowane w autoklawie
1 M MgSO4	Sigma	M2643	Sterylizowane w autoklawie
1 M CaCl2	Sigma	C2661	Sterylizowane w autoklawie
NaCl	Sigma	S5886
5 mg / ml Cholesterol	Sigma	C8667	W 100% etanolu
200 mg / ml Carbenicillin	US Biologicals	C1100	Filtr sterylizowany 0,2 i mu;
1 M IPTG	US Biologicals	I8500	Filtr sterylizowany 0,2 i mu;
100 mg / ml Filtr ampicyliny			sterylizowany 0,2 i mu;
5 mg / ml Tetracyklina			w 100% etanolu
Bacto Agar	BD	214040
96-dołkowe płytki TC	BD-Falcon	353072	Do 96-dołkowych RNAi
Prostokątne płytki A/T	Thermo Scientific	242811	Do tłoczenia RNAi
LB Media	US Biologicals	L1530	Przygotowane zgodnie z instrukcjami producenta
96- dobrze Bloki testowe głębokich studni	Corning	Costar 3960	Prostokątny blok testowy z dnem w kształcie litery V
96-dołkowy blok testowy płytkich studni	Corning	Costar 3956	Okrągły blok testowy z dnem w kształcie litery V
Sterylna folia uszczelniająca	VWR	89134-432
Aluminiowa folia uszczelniająca	Corning	Costar 6570	Thermowell Taśma uszczelniająca do płytek 96-dołkowych
Bufor	M9Zobacz Hope et al.20		Zobacz przepis poniżej
Triton X-100	Bio-Rad	161-0407
Czerwień nilowa	Invitrogen	N-1142
Isopropanol	Fisher	BP2632-4
96-pinowy aspirator	VP Scientific	VP177A-1
96-dołkowe teflonowe maskowane szkiełka mikroskopowe	Thermo Scientific	Custom	Może również zamówić Trevigen 96-dołkowe
szkiełka nakrywkowe Cometslide 96-dołkowe Gold-Seal	Thermo Scientific	Custom	Można również użyć drugiej 96-dołkowej płytki Cometslide
Deep-well PCR	VWR	89049-178
Niesterylna folia samoprzylepna	VWR	60941-070
Mikroskop o wysokiej przepustowości	Leica	DM6000 w pełni zautomatyzowany z Prior 96- Etap studzienkowy	Z zestawem filtrów Chroma 49002 GFP i 2x obiektywem
Sonikator do kąpieli	Diagenode	Bioruptor XL
Chloroform	Sigma	366927-4L
Metanol	Fisher	Optima F456-4
Fosfolipid Standard	Avanti Polar Lipids	830456P	1,2-diheptadekanoilo-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glicerol)
Triglicerydy Standard	NuChek Prep	T-135	tritridekanoina
Wiretrol 50 μ l Pipet	Fisher	21-176-3A	Drummond Scientfic
Aceton	Sigma	320110-4L
Kwas siarkowy	Fisher	A300-500
Heksan		Fisher Optima H306-1
SPE Kolumna krzemionkowa	Thermo Scientific	60108-317	Hypersep SI, złoże żywicy 100 mg
Kolektor chromatografii fazy stałej	Sigma	57265	Supelco Visiprep 24-DL
	Fisher	13-678-27F	Pipety
borokrzemianowe Pasteura o rozmiarze	Fisher	13-678-8B
Probówki borokrzemianowe	Fisher	14-961-27
Rurki borokrzemianowe z gwintem	VWR	14235-460	Pojemność 8 ml
Nakrętki fenolowe do probówek hodowlanych	Fisher	14-823-211
Fiolki do automatycznego pobierania próbek GC/MS	Agilent	5188-6592
Nakrętki do fiolek z automatycznym samplerem	Agilent	5185-5861
GC/MS	Agilent	6890 GC / 5973 MSD	Wyposażone w kolumnę Supelcowax-10
Pożywka do wzrostu nicieni (NGM): na 25 96-dołkowych płytek RNAi przygotuj 1 l NGM: Odczynnik Ilość Woda dejonizowana 1 L NaCl 3 g Agaroza 17 g pepton Bacto 2,5 g Cykl cieczy w autoklawie 121 ° C przez 40 min z mieszadłem. Pozostawić do ostygnięcia do 60 stopni C mieszając na płycie grzejnej ustawionej na 60 stopni C. Następnie dodaj następujące elementy: 1 M MgSO4 1 ml 5 mg/ml cholesterolu 1 ml 1 M KH2PO4 (pH 6,0) 25 ml 1 M CaCl2 1 ml 200 mg/ml karbenicyliny 1 ml 1 M IPTG 5 ml Dozować do 96-dołkowych płytek RNAi. Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C do użycia, do 2 tygodni.
Reagent	Ilość
Woda dejonizowana	1 L
LB agar (US Biologicals)	32 g
2 M NaOH	1,5 ml
Agar Bacto	2,5 g
Cykl cieczy w autoklawie 121 ° C przez 40 min z mieszadłem. Pozostawić do ostygnięcia do 60 stopni C mieszając na płycie grzejnej ustawionej na 60 stopni C. Następnie dodaj następujące ilości:
Tetracyklina	3 ml
100 mg/ml Ampicylina	0,5 ml
Dozuj 45 ml do każdej płytki. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 stopni; C do użycia, do 4 tygodni.