Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zewnątrzkomórkowa identyfikacja neuronów ruchowych w puli motorycznej mięśni u Aplysia californica

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50189

⸱

25 marca 2013

 ,  , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University , 2Department of Neurosciences, Case Western Reserve University , 3Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

W tym artykule

Podsumowanie

U zwierząt z dużymi zidentyfikowanymi neuronami (np.), analiza puli motorycznej odbywa się za pomocą technik wewnątrzkomórkowych1,2,3,4. Niedawno opracowaliśmy technikę zewnątrzkomórkowej stymulacji i zapisu pojedynczych neuronów w Aplysia californica5. Opisujemy teraz protokół wykorzystania tej techniki do unikalnej identyfikacji i scharakteryzowania neuronów ruchowych w puli motorycznej.

Streszczenie

U zwierząt z dużymi zidentyfikowanymi neuronami (np.), analiza puli motorycznej odbywa się za pomocą technik wewnątrzkomórkowych1,2,3,4. Niedawno opracowaliśmy technikę zewnątrzkomórkowej stymulacji i zapisu pojedynczych neuronów w Aplysia californica5. Opisujemy teraz protokół wykorzystania tej techniki do unikalnej identyfikacji i scharakteryzowania neuronów ruchowych w puli motorycznej.

Ta technika zewnątrzkomórkowa ma zalety. Po pierwsze, elektrody zewnątrzkomórkowe mogą stymulować i rejestrować neurony przez osłonkę5, więc nie trzeba jej usuwać. W ten sposób neurony będą zdrowsze w eksperymentach zewnątrzkomórkowych niż w wewnątrzkomórkowych. Po drugie, jeśli zwoje są obracane przez odpowiednie przypięcie osłonki, elektrody zewnątrzkomórkowe mogą uzyskać dostęp do neuronów po obu stronach zwoju, co ułatwia i usprawnia identyfikację wielu neuronów w tym samym preparacie. Po trzecie, elektrody zewnątrzkomórkowe nie muszą przenikać do komórek, a zatem mogą być łatwo przenoszone tam iz powrotem między neuronami, powodując mniejsze ich uszkodzenia. Jest to szczególnie przydatne, gdy próbuje się nagrać wiele neuronów podczas powtarzających się wzorców motorycznych, które mogą utrzymywać się tylko przez kilka minut. Po czwarte, elektrody zewnątrzkomórkowe są bardziej elastyczne niż wewnątrzkomórkowe podczas ruchów mięśni. Elektrody wewnątrzkomórkowe mogą wyciągać i uszkadzać neurony podczas skurczów mięśni. W przeciwieństwie do tego, ponieważ elektrody zewnątrzkomórkowe są delikatnie dociskane do osłonki nad neuronami, zwykle pozostają nad tym samym neuronem podczas skurczów mięśni, a zatem mogą być stosowane w bardziej nienaruszonych preparatach.

Aby jednoznacznie zidentyfikować neurony ruchowe dla puli motorycznej (w szczególności mięśnia I1/I3 w Aplysia) za pomocą elektrod zewnątrzkomórkowych, można użyć cech, które nie wymagają pomiarów wewnątrzkomórkowych jako kryteriów: wielkości i lokalizacji somy, projekcji aksonalnej i unerwienia mięśni4,6,7. Dla konkretnej puli motorycznej użytej do zilustrowania techniki, zarejestrowaliśmy nerwy policzkowe 2 i 3, aby zmierzyć projekcje aksonalne i zmierzyliśmy siły skurczu mięśnia I1 / I3, aby określić wzór unerwienia mięśni dla poszczególnych neuronów ruchowych.

Pokazujemy cały proces najpierw identyfikacji neuronów ruchowych za pomocą unerwienia mięśniowego, a następnie charakteryzowania ich czasu podczas wzorców motorycznych, tworząc uproszczoną metodę diagnostyczną do szybkiej identyfikacji. Uproszczona i szybsza metoda diagnostyczna jest lepsza w przypadku bardziej nienaruszonych preparatów, np. w zawieszonym preparacie masy policzkowej8 lub in vivo9. Proces ten może być również stosowany w innych basenach motorowych10,11,12 w Aplysia lub w innych systemach zwierzęcych2,3,13,14.

Protokół

1. Przygotowanie potrawy do nagrywania

  1. Podczas eksperymentów z przetwornikiem siły, zwoje policzkowe, zwój mózgowy i masa policzkowa są umieszczane w okrągłej naczyniu z Pyrexu, która jest wyspecjalizowana do badań siły.
  2. Aby wywołać wzorce podobne do spożycia w eksperymentach, musimy zastosować niehydrolizowalny agonista cholinergiczny karbachol do zwoju mózgowego15. Aby uniknąć bezpośredniego kontaktu karbacholu ze zwojami policzkowymi i masą policzkową, potrzebne są oddzielne komory do odizolowania zwoju mózgowego od zwojów policzkowych i masy policzkowej (ryc. 1).
  3. Ponieważ masa policzkowa jest znacznie grubsza niż zwoje policzkowe, nie zostaną one umieszczone na tym samym poziomie. Dlatego ta miska powinna mieć tylną komorę dla zwoju mózgowego (obszar A na rysunku 1), środkową platformę dla zwojów policzkowych (obszar C na rysunku 1) i znacznie głębszą przednią komorę dla masy policzkowej (obszar D na rysunku 1).
  4. Aby stworzyć to danie, zacznij od okrągłego naczynia Pyrex o wymiarach 100x15 (15 mm wysokości, 100 mm średnicy). Budowa naczynia będzie wymagała kilku nalewań Sylgardu. Postępuj zgodnie z instrukcjami dołączonymi do produktu Sylgard. Sylgard musi mieć możliwość zastygnięcia między różnymi nalewkami.
  5. Pierwszym nalewaniem jest wytworzenie najwyższego poziomu Sylgardu w naczyniu (obszar B na rysunku 1), który jest ścianą między środkową platformą a tylną komorą.
  6. Użyj dwóch podkładów z plasteliny, aby wyizolować obszar ściany Sylgard (obszar B na rysunku 1). Podłoża z plasteliny pokryj folią w miejscu, w którym będą stykać się z Sylgardem, aby ułatwić ich usunięcie. Upewnij się, że są szczelnie uszczelnione na krawędziach, w miejscach, w których modelina będzie stykać się z naczyniem, aby zminimalizować wyciek.
  7. Wlej Sylgard do części między dwoma podkładami z plasteliny prawie do górnej części naczynia. Pozostaw Sylgard do całkowitego zastygnięcia na noc. Trzymanie potrawy w ciepłym miejscu spowoduje szybsze wiązanie. Usuń podkłady z plasteliny i usuń wszelkie pozostałości gliny z Sylgarda.
  8. Następnie należy wylać tylną komorę (obszar A na rysunku 1) i środkową platformę (obszar C na rysunku 1).
  9. Umieść podkład z plasteliny w odległości około 5 mm od przedniej powierzchni Sylgarda dla części środkowej platformy (obszar C).
  10. Wlać Sylgard do sekcji tylnej komory (obszar A) i środkowej platformy (obszar C) do wysokości około 3-5 mm poniżej górnego poziomu pierwszej ściany Sylgard (obszar B). Powierzchnia tylnej komory Sylgard powinna być nieco niższa niż powierzchnia środkowej platformy, aby uniknąć wycieku z tylnej komory zawierającej karbachol do środkowej platformy. Ponownie pozwól Sylgardowi całkowicie związać się przez noc, a następnie usuń podkład z plasteliny.
  11. Ostatnim krokiem jest wycięcie wcięcia w środku ściany Sylgard, aby zapewnić kanał, przez który przechodzi łącznik mózgowo-policzkowy (CBC) między środkową platformą a tylną komorą. Szerokość tego wcięcia powinna wynosić około 3-4 mm, co jest wystarczająco szerokie dla CBC. Dolna część wycięcia nie powinna znajdować się niżej niż powierzchnia Sylgard środkowej platformy, aby zapobiec wyciekom. Do wycięcia nacięcia można użyć ostrza skalpela.

2. Przygotowanie elektrody

  1. Wyciągnij elektrody ze szkła zewnątrzkomórkowego z jednolufowego szkła kapilarnego za pomocą ściągacza do mikropipet Flaming-Brown, jak opisano przez McManusa i wsp.8 w sekcji 3.1. W przypadku filamentu FT345B w ściągaczu nasze typowe ustawienia programu to Heat 480, Pull 50, Velocity 13 i Time 20, ale należy pamiętać, że ustawienia będą różne dla różnych filamentów. Ten program tworzy elektrody za jednym pociągnięciem, bez etapu polerowania ogniowego. Rozmiar końcówki elektrody powinien być mniejszy niż rozmiar korpusów ogniw. W przypadku neuronów ruchowych o średnicy somy od 50 μm do 400 μm średnice wewnętrzne elektrod szkła zewnątrzkomórkowego powinny wynosić około 40 μm, a ich rezystancja powinna wynosić około 0,1 MΩ, gdy są wypełnione solą fizjologiczną Aplysia.
  2. Wyciągnij elektrody ssące z rurki polietylenowej za pomocą palnika Bunsena. Wytnij kawałek rurki polietylenowej o długości około 10 cm. Przytrzymaj rurkę na obu końcach i umieść ją bardzo blisko płomienia generowanego przez palnik Bunsena, obracając rurkę, aż stanie się miękka od ciepła. Ostrożnie rozciągnij rurkę wzdłuż jej długości, jednocześnie odsuwając ją od płomienia. Środkowa część rurki wydłuża się i zwęża w miarę ciągnięcia rurki.
  3. Przetnij rurkę na pół, aby utworzyć dwie elektrody ssące. Elektrody ssące są zwykle nakładane na przecięte końce nerwów lub mięśni, chociaż czasami można je stosować mimochodem.
  4. Utworzyć elektrody hakowe do zapisów nerwowych zgodnie z protokołem opisanym przez McManusa i wsp.8 w sekcjach 3.2-3.13. Elektrody te są szczególnie przydatne, gdy nerw lub mięsień nie jest przecięty.

3. Mocowanie elektrody hakowej

  1. Rozciąć zwierzę i usunąć masę policzkową zgodnie z protokołem opisanym w McManus i wsp.8 Sekcja 4.
  2. W celu nagrywania i stymulacji elektrody hakowe można przymocować do wielu różnych nerwów.
  3. Aby scharakteryzować wzorce, tak jak to zostało zrobione in vivo przez Cullinsa i Chiela9, należy uzyskać zapisy z nerwu i mięśnia I2, które wskazują na fazę protrakcyjną karmienia16, nerwu radnego (RN), który wskazuje na zamknięcie chwytaka pokarmowego17, nerwu policzkowego 2 (BN2) i nerwu policzkowego 3 (BN3), które wskazują na fazę retrakcji17,18. Mocowanie elektrod hakowych odbywa się zgodnie z procedurą podobną do opisanej przez McManus i wsp. 8, sekcja 5.
  4. Lokalizacje tych nerwów odnoszą się do schematu aparatu żywieniowego Aplysia pokazanego na rycinie 2 McManusa i wsp. 8. Zauważ, że BN2 rozdziela się na gałęzie a, b i c, zanim przejdzie pod mięsień I1 w bocznym rowku. Gałąź a jest pierwszą gałęzią, która oddziela się od głównego pnia i przylega do BN3.
  5. Nomenklatura gałęzi a, b i c była używana przez Warmana i Chiela18. Gałęzie a, b i c odpowiadają odpowiednio gałęziom 3, 2 i 1 w nomenklaturze używanej przez Nargeot i wsp.19. Ponadto RN, BN1, BN2 i BN3 odpowiadają odpowiednio nerwom 1, 6, 5 i 4 w nomenklaturze używanej przezKandela 20 i Scotta i wsp.21
  6. Aby zbadać unerwienie mięśni I1/I3, wszystkie nerwy z wyjątkiem nerwów policzkowych 2 zostaną odcięte od masy policzkowej podczas eksperymentów. W związku z tym użyliśmy elektrody hakowej do nagrywania z BN2.
  7. Ponieważ nerw I2 i RN nie będą przyczepione do masy policzkowej i są bardzo trudno dostępne za pomocą elektrod hakowych, lepiej jest zamiast tego zastosować elektrody ssące, aby nagrywać z nich. Zastosowanie elektrod ssących opiszemy w rozdziale 7.
  8. Do nagrywania z BN3 należy użyć elektrody hakowej lub elektrody ssącej, ponieważ jest ona łatwo dostępna przy użyciu obu rodzajów elektrod. Zdecydowaliśmy się na użycie elektrody hakowej do nagrań BN3, aby zminimalizować liczbę manipulatorów do przytrzymywania elektrod ssących i zaoszczędzić miejsce na inne manipulatory lub sprzęt.
  9. Przymocuj elektrodę hakową do gałęzi a BN2 (BN2-a), aby zainicjować wzorce podobne do odrzucenia podczas eksperymentów. Przydatne jest przymocowanie dodatkowej elektrody hakowej do BN2-a po drugiej stronie, ponieważ niektóre neurony reagują inaczej na stymulację ipsilateralną i przeciwległą BN2-a.
  10. Aby pomóc w rozróżnieniu neuronów z projekcjami jednostronnymi i dwustronnymi, przydatne jest również przymocowanie elektrod hakowych do BN2 i BN3 po drugiej stronie zwojów policzkowych.

4. Przygotowanie zwojów i mięśni

  1. Zwoje policzkowe, zwoje mózgowe i masa policzkowa zostaną przygotowane do eksperymentów z przetwornikiem siły, w których zwój mózgowy jest przyłączony do zwojów policzkowych za pośrednictwem morfologii krwi, a masa policzkowa jest przyłączona do zwojów policzkowych tylko za pomocą BN2.
  2. Po zamocowaniu elektrod hakowych przeciąć nerw policzkowy 1 (BN1) i nerw przełykowy (EN) obustronnie, przecinając w miejscu mocowania do masy policzkowej.
  3. Pociągnij zwój mózgowy do przodu, aby usunąć go z drogi mięśnia I2. Wykonaj nacięcie w mięśniu I2 nad workiem radularnym, rozciągnij cięcie na boki i do przodu w obu kierunkach i pociągnij płat mięśnia I2 do przodu, aby odsłonić nerw radularny. Odetnij dwie gałęzie RN i upewnij się, że gałęzie są wystarczająco długie, aby można było zamocować elektrodę ssącą.
  4. Kontynuuj cięcie I2 w szerokim okręgu wokół zwojów policzkowych, uważając, aby nie przeciąć BN2 lub BN3, aż zwoje policzkowe i przyczepiona część mięśnia I2 będą mogły zostać całkowicie oddzielone od masy policzkowej. Przeciąć obustronne BN3 w punkcie mocowania do masy policzkowej, poza mocowaniem elektrody hakowej.
  5. Nałóż cienką warstwę smaru próżniowego na wcięcie w opisanym powyżej naczyniu do nagrywania, które łączy tylną komorę i środkową platformę, używając końcówki pipety, aby zebrać kulkę tłuszczu próżniowego i rozprowadzić ją po wcięciu.
  6. Nałóż cienką warstwę super kleju Quick-Gel na szklane dno przedniej komory, w której zostanie umieszczona masa policzkowa, tuż przed podstawą Sylgard środkowej platformy.
  7. Ostrożnie przenieś zwój mózgowy, zwoje policzkowe i masę policzkową do naczynia rejestrującego (ryc. 1) opisanego w sekcji 2, upewniając się, że żadna z elektrod haczykowych nie jest mocno naciągnięta, co mogłoby uszkodzić nerwy.
  8. Ostrożnie umieść masę policzkową na kleju w przedniej komorze naczynia do nagrywania, aby upewnić się, że jej brzuszna powierzchnia jest przyklejona do dna naczynia. Upewnij się, że zwoje nerwowe i elektrody nie dotykają kleju. Do naczynia dodać sól fizjologiczną Aplysia 8 (460 mM NaCl, 10 mM KCl, 22 mM MgCl2, 33 mM MgSO4, 10 mM CaCl2, 10 mM glukozy, 10 mM MOPS, pH 7,4-7,5) do naczynia, co spowoduje związanie kleju.
  9. Jeśli naczynie musi zostać przeniesione do innego mikroskopu w celu przygotowania zwojów policzkowych do zewnątrzkomórkowych zapisów somy, należy bardzo uważać na elektrody haczykowe. Zgrupuj elektrody po jednej stronie masy policzkowej razem, a także zgrupuj elektrody po drugiej stronie masy policzkowej. Ostrożnie przytrzymaj elektrody, chwytając taśmę laboratoryjną zakrywającą styki złącza, ponownie upewniając się, że żadna z elektrod nie jest mocno napięta.
  10. Gdy naczynie zostanie umieszczone pod mikroskopem, elektrody należy delikatnie zawiesić na bokach naczynia i spocząć na platformie obok naczynia.
  11. W przerwach i między etapami eksperymentu należy napowietrzać sól fizjologiczną w komorze masy policzkowej za pomocą napowietrzacza akwariowego.
  12. Użyj kleszczy, aby chwycić pochewkę zwoju mózgowego i wciągnąć go do tylnej komory, upewniając się, że CBC przechodzą przez wcięcie. Przypnij zwój mózgowy za pomocą nerwów innych niż CBC, aby uniknąć uszkodzenia nienaruszonych CBC.
  13. Nałóż więcej tłuszczu próżniowego na CBC, a następnie dodaj więcej soli fizjologicznej Aplysia do obu komór naczynia, tak aby zwoje były całkowicie zanurzone. Upewnij się, że górna część smaru próżniowego znajduje się nieco wyżej niż ścianka Sylgard, aby nie doszło do wycieku między komorami.
  14. Aby ustabilizować zwoje policzkowe, najpierw przypnij końce BN3, a następnie BN1 i EN na podstawie Sylgarda środkowej platformy (ryc. 2). Ponieważ BN3 będą rejestrowane za pomocą elektrod hakowych, kołki powinny być umieszczone bardziej dystalnie niż punkty mocowania elektrod hakowych.
  15. Użyj dwóch kołków, wygiętych pod kątem 90 stopni, jako haków, aby rozciągnąć i zakotwiczyć CBC, aby CBC nie zostały uszkodzone (Rysunek 2).
  16. Przypnij gałęzie RN między tylną komorą a zwojami policzkowymi. Wtedy mięsień I2 znajdzie się na szczycie RN. Aby odsłonić nerw I2, użyj kleszczy, aby chwycić mięsień I2 i przeciągnij go przez zwoje policzkowe. Przypnij dwa rogi mięśnia I2, aby uniknąć uszkodzenia nerwu I2.
  17. Przetnij nerw I2 dystalnie do punktu, w którym jego dwie gałęzie łączą się z mięśniem I2. Upewnij się, że mięsień jest nadal unerwiony, aby był porównywalny z nagraniami in vivo. Odetnij resztę mięśnia I2 i odwróć nerw I2 z powrotem i przygwoźdź go między dwiema gałęziami RN (patrz rysunek 2, wstawka).
  18. Dostosuj położenie szpilek, aby rozciągnąć i zwiększyć napięcie, jeśli nerw jest zbyt luźny, lub aby uwolnić napięcie, jeśli nerw jest zbyt napięty. Aby jeszcze bardziej ustabilizować zwoje policzkowe, dodaj więcej szpilek na osłonce między nerwami.
  19. Ponieważ zwoje policzkowe są umieszczone ogonową stroną do góry, obróć zwoje policzkowe, jeśli interesujące neurony znajdują się po stronie rostralnej. Aby obrócić jeden z dwóch zwojów policzkowych, użyj cienkich kleszczy, aby złapać nadmiar osłonki CBC w miejscu, w którym znajduje się blisko zwojów policzkowych i przygwoździć ją między BN2 i BN3. W niektórych zwojach jajowych wygodniej jest umieścić go między CBC a BN3.
  20. Dodaj dodatkowy szpilkę na osłonce zwoju policzkowego po stronie blisko przedniej komory, aby zminimalizować ruch zwoju policzkowego.
  21. Aby przyciąć osłonkę zakrywającą zwoje policzkowe, użyj cienkich kleszczy, aby chwycić osłonkę po stronie blisko tylnej komory, a następnie odetnij nadmiar osłony cienkimi nożyczkami, nie odsłaniając ciał komórek. Aby zminimalizować uszkodzenia, usuń tylko minimalną ilość osłony niezbędną do zobaczenia ciał komórek.
  22. Po przycięciu pochewki zwojów policzkowych pociągnij nerw I2 i RN nad zwojami policzkowymi i przypnij je między zwojami policzkowymi a przednią komorą, aby dalej obracać zwoje policzkowe. (Patrz rysunek 2).
  23. Aby wypłukać pozostały chlorek magnezu8, który został użyty do znieczulenia zwierzęcia przed sekcją, zastąp sól fizjologiczną Aplysia w naczyniu świeżą solą fizjologiczną Aplysia.

5. Elektrycznie łączące elektrody hakowe

  1. Po przygotowaniu zwojów i mięśni ostrożnie przenieś naczynie na stół do izolacji drgań w celu przeprowadzenia eksperymentów.
  2. Podłącz wszystkie piny elektrod do ich gniazd na BNC, które łączą się ze wzmacniaczami (A-M Systems model 1700 amplifier). Ponownie upewnij się, że elektrody nie są mocno naciągnięte podczas wykonywania tej czynności. Upewnij się, że elektrody są prawidłowo podłączone do odpowiednich i że polaryzacja jest prawidłowa.

6. Ustawianie szklanych elektrod zewnątrzkomórkowych do nagrań somy

  1. Napełnij elektrodę solą fizjologiczną Aplysia za pomocą strzykawki przymocowanej do kawałka rurki polietylenowej o długości około 15-20 cm. Przymocuj wolny koniec rurki polietylenowej do końca elektrody szklanej. Pociągnąć za tłok strzykawki, aby napełnić elektrodę solą fizjologiczną Aplysia.
  2. Umieść napełnioną elektrodę ze szkła zewnątrzkomórkowego w wycięciu uchwytu na manipulatorze. Użyj manipulatora, aby umieścić końcówkę elektrody w soli fizjologicznej Aplysia zawierającej zwoje policzkowe.
  3. Włóż przewód srebrny/chlorku srebra przylutowany do męskiego złotego złącza do elektrody, aby służył jako przewód nagrywający. Umieść kolejny drut srebrno-chlorkowy przylutowany do męskiego złotego złącza bezpośrednio do soli fizjologicznej Aplysia w sekcji naczynia nagrywającego zawierającej zwoje policzkowe, aby działał jako przewód odniesienia. Podłącz zarówno przewód nagrywający, jak i referencyjny do BNC, który łączy się ze wzmacniaczem.
  4. Jeśli jest wystarczająco dużo miejsca dla większej liczby manipulatorów, można dodać dodatkowe zewnątrzkomórkowe szklane elektrody, aby rejestrować wiele neuronów jednocześnie.

7. Ustawianie elektrod ssących dla nagrań nerwowych

  1. Przytnij wąski koniec końcówki elektrody ssącej, aby dopasować go do średnicy nerwu. Wewnętrzna średnica końcówki elektrody powinna być podobna lub nieco mniejsza niż średnica nerwu, aby zapewnić ścisłe ssanie.
  2. Ponieważ nerw I2 i RN znajdują się bardzo blisko siebie, ich elektrody mogą być trzymane przez ten sam manipulator, aby zaoszczędzić miejsce. Umieść dwie elektrody w dwóch nacięciach tego samego uchwytu. Obróć dwie elektrody i upewnij się, że ich końcówki są blisko siebie. Wybierz jeden z nich do nagrania nerwu I2, drugi do nagrania RN.
  3. Umieść końcówkę elektrody w soli fizjologicznej Aplysia w naczyniu rejestrującym zawierającym zwoje policzkowe. Przymocuj wolny koniec rurki polietylenowej na strzykawce do elektrody ssącej. Za pomocą strzykawki napełnić elektrodę solą fizjologiczną Aplysia. Przesuń końcówkę elektrody blisko końca nerwu docelowego, tj. nerwu I2, i użyj strzykawki, aby zassać nerw do elektrody. Długość nerwu w elektrodzie powinna wynosić około 0,5-1,0 mm, aby zapewnić szczelne uszczelnienie.
  4. Powtórz ssanie dla elektrody, która zostanie przymocowana do RN.
  5. Podłącz elektrody do odpowiednich BNC zgodnie z opisem w rozdziale 6.3.

8. Ustawianie przetwornika siły do pomiaru skurczu mięśni I1/I3

  1. Aby przymocować przetworniki siły do mięśnia, użyj szwów jedwabnych. Zegnij zakrzywioną igłę każdego szwu i przywiąż szew do przetwornika siły. Delikatnie chwyć i podnieś niewielką ilość mięśnia za pomocą kleszczy i, trzymając igłę w innym zestawie kleszczy, wprowadź igłę przez mięsień aż do zgiętego punktu w igle (ryc. 1).
  2. Przetworniki mogą być przymocowane grzbietowo lub bocznie do mięśnia I1/I3. Przyczep grzbietowy umożliwia pomiar skurczów wywołanych aktywacją lewej lub prawej strony mięśnia. Przyczepienie boczne będzie wykazywać silniejsze siły dla większości neuronów, ale pozwoli na pomiar skurczu tylko po stronie, do której przymocowany jest przetwornik.
  3. Aby pomóc w identyfikacji neuronów, które mogą aktywować przedni, tylny lub oba regiony I1 / I3, przymocuj przetwornik siły do tylnej części mięśnia, tuż przed tkanką gardła, i podłącz inny przetwornik siły do przedniej części mięśnia, w szczękach (ryc. 1; zwróć uwagę na haczyki).
  4. Podnieś przetworniki siły, aż szwy zostaną napięte, ale nie rozciągaj nadmiernie. Aby to sprawdzić, view pomiar z przetwornika siły, gdy szew ma w sobie pewien luz, a następnie podnieś przetwornik, aż pomiar znajdzie się nieco powyżej tego poziomu podstawowego.

9. Rozpoznawanie neuronów ruchowych w puli motorycznej

  1. Protokół ten opisuje proces zewnątrzkomórkowej identyfikacji neuronów ruchowych w puli motorycznej. Wykorzystaliśmy oprogramowanie AxoGraph do monitorowania aktywności pojedynczych neuronów, wielu nerwów i mięśni (sygnał EMG lub siły skurczu). W tym protokole użyliśmy sił skurczu mięśnia jako ilustracji procesu identyfikacji neuronów ruchowych; w innych eksperymentach również używaliśmy EMG, a konfiguracja dla takich eksperymentów jest bardzo podobna (patrz Dyskusja).
  2. Aby zlokalizować neuron kandydujący, użyj manipulatora, aby delikatnie docisnąć końcówkę zewnątrzkomórkowej szklanej elektrody w dół do osłonki nad środkiem neuronu soma5 (ryc. 3), która jest najlepszym miejscem do stymulacji i rejestrowania selektywności5. Ponieważ prąd progowy do aktywacji neuronu wzrasta liniowo wraz z odległością elektrody od somy5, selektywność stymulacji pogorszy się, gdy elektroda zostanie odsunięta od środka neuronu docelowego w kierunku sąsiedniego neuronu.
  3. Aby zidentyfikować neuron ruchowy, najpierw bezpośrednio stymuluj neuron za pomocą zewnątrzkomórkowej szklanej elektrody, aby upewnić się, że tylko ten neuron odpala, i sprawdź, czy unerwia mięsień. Następnie zapis zewnątrzkomórkowy z tego neuronu, aby ustalić relację jeden do jednego między zapisem somy zewnątrzkomórkowej a nagraniami nerwowymi, co jest również kluczowe dla identyfikacji neuronów.
  4. Ponieważ większość wzmacniaczy zewnątrzkomórkowych nie pozwala na jednoczesną stymulację i nagrywanie w kanale, ustaw kanał używany do stymulacji i zapisu somy (kanał soma) w tryb stymulacji i przyłóż krótki prąd anodowy (np. 6 ms dla neuronów Aplysia 5) do somy (rysunki 4A, 5A; zwróć uwagę na strzałki 1 na obu rysunkach), zaczynając od niskiego prądu (np. 200 μA), i stopniowo zwiększając prąd, aż neuron pęknie.
  5. Gdy neuron zostanie aktywowany do pęknięcia, należy natychmiast przełączyć kanał soma z trybu stymulacji na tryb nagrywania (ryc. 4A, 5A; zwróć uwagę na strzałki 2 na obu rysunkach). Jednak nadal będą występować opóźnienia między stymulacją somy a rejestracją z powodu opóźnień w reakcji człowieka.
  6. Jeśli neuron odpala przez rozsądny czas, powinno być możliwe zaobserwowanie odpowiednich potencjałów czynnościowych jeden do jednego z zapisu somy i na nerwie (nerwach), przez które neuron przechodzi (ryc. 4B, 5B; zwróć uwagę na linie przerywane), a także siły generowane przez neuron (ryc. 4A, 5A; zwróć uwagę na niebieskie pola). Jeśli neuron przestanie strzelać przed rozpoczęciem zapisu somy, zwiększ prąd, aby aktywować go na dłuższy czas.
  7. Stosunek sygnału do szumu w nagraniach zewnątrzkomórkowych zależy od lokalizacji elektrody i wielkości somy. Zapis zewnątrzkomórkowy będzie się powiększał wraz ze wzrostem wielkości somy i zmniejszaniem się odległości elektroda od somy. Ponieważ szum zmienia się tylko w wąskim zakresie, stosunek sygnału do szumu będzie również wzrastał wraz ze wzrostem rozmiaru somy i zmniejszaniem się odległości między elektrodami a somą. Najczęściej spotykany zakres stosunku sygnału do szumu wynosi od 4:1 do 8:1.
  8. Neurony ruchowe można zidentyfikować na podstawie ich cech, takich jak lokalizacja somy, projekcja nerwów i unerwienie mięśni4,6,7. Ponieważ tylko dwa BN2 są przyłączone do masy policzkowej, monitorując aktywność BN2, można zapewnić, że siła skurczu mięśni jest spowodowana tylko przez neuron aktywowany przez stymulację zewnątrzkomórkową.
  9. Na przykład B3 jest dużym neuronem ruchowym dla mięśnia I1 / I3 (300-400 μm średnicy somy u zwierząt o wadze od 200 do 350 gramów), znajdującym się po stronie rostralnej zwoju policzkowego (ryc. 3). Wystaje tylko przez ipsilateralny BN2 i unerwia zarówno przednią, jak i tylną część mięśnia I1/I3. W większości przypadków aktywacja go generuje większą siłę przednią niż tylną (8 z 9 eksperymentów).
  10. Po zidentyfikowaniu neuronu, jego aktywność może być rejestrowana w różnych zachowaniach podobnych do karmienia za pośrednictwem zewnątrzkomórkowej elektrody szklanej (ryc. 4 i 5), które można wywołać w sposób opisany poniżej. Zapis zewnątrzkomórkowy na somie będzie znacznie bardziej szczegółowy niż zapisy nerwowe, które obejmują aktywność wielu różnych neuronów.
  11. Aby wywołać egestywne programy motoryczne, stymuluj BN2-a za pomocą 1-2 minut impulsów19 (2Hz, każdy impuls to 1 ms). Ta stymulacja niezawodnie generuje wzorce egzekucyjne w tym ustawieniu. Przy wystarczającym natężeniu prądu (np. 300 μA) wzorce mogą utrzymywać się przez cały czas trwania stymulacji. Czasami pojawi się jeszcze jeden wzorzec, który pojawia się wkrótce po zakończeniu stymulacji.
  12. Aby wywołać programy motoryczne podobne do połknięcia, umieść kilka kryształów stałego karbacholu bezpośrednio na osłonce zwoju mózgowego15. Jeśli ktoś chce kontrolować poziom ekspozycji na karbachol, powinien użyć roztworu od 1 do 10 mM karbacholu w soli fizjologicznej Aplysia. Wyższe stężenia z większym prawdopodobieństwem wywołają odpowiedzi. Powtarzające się wzorce zwykle zaczynają się w ciągu pięciu minut i mogą trwać około dziesięciu do piętnastu minut, zanim zaczną się kończyć.
  13. Po kilkukrotnym wypłukaniu karbacholu i odczekaniu co najmniej 30 minut, kolejne zastosowanie karbacholu można dodać do zwoju mózgowego, aby wywołać wzorce motoryczne podobne do spożycia.
  14. Po zidentyfikowaniu i scharakteryzowaniu wielu neuronów ruchowych dla danej puli motorycznej podczas programów motorycznych, można opracować znacznie uproszczoną metodę diagnostyczną, która wymaga minimalnej ilości informacji do szybkiej identyfikacji tych neuronów w przyszłych pracach (ryc. 6), np. w zawieszonych preparatach masy policzkowej lub in vivo. Kryteria mogą obejmować wielkość i lokalizację somy, projekcję nerwów, wielkość jednostki na nerwach i czas aktywności podczas wzorców motorycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunki 4 i 5 przedstawiają typowe wyniki wykorzystywane do identyfikacji dwóch neuronów ruchowych I1/I3. Rysunek 4 pokazuje rejestracje z somy dużego neuronu ruchowego B3 podczas wzorców przypominających egestję i ingestję (Rysunki 4C, 4D). Jedno-do-jednej odpowiadające impulsy w kanale somy i w ipsilateralnym kanale BN2 (Rysunek 4E) wykazują, że specyficzność rejestracji z somy B3 została zachowana podczas wzorców. B3 wyładowuje w środ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

U zwierząt z dużymi zidentyfikowanymi neuronami, takich jak (na przykład Lymnaea, Helix i Aplysia), analiza puli motorycznej jest zwykle wykonywana przy użyciu zapisu wewnątrzkomórkowego1,2,3,4. W tym protokole opisujemy proces jednoznacznej identyfikacji neuronów ruchowych dla puli motorycznej przy użyciu techniki zewnątrzkomórkowej. Jako ilustrację tego procesu posłużyliśmy się pomiarami siły. Można również użyć EMG do pomiaru unerwienia mięśni. Krótko mówiąc, aby to zrobić, protok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez NS047073 grantów NIH i granty NSF DMS1010434.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek soduFisher ScientificS671Biologiczny, certyfikowany
chlorek potasuFisher ScientificP217Certyfikowany ACS
Sześciowodny chlorek magnezuAcros Organics1975399%
siedmiowodny siarczan magnezuFisher ScientificM63Certyfikowany ACS
Dwuwodnychlorek wapniaFisher ScientifcC79Certyfikowany ACS
Glukoza (dekstroza)Sigma-AldrichG7528
Bufor BioXtra MOPSAcros Organics1726399%
CarbacholAcros Organics1082499%
Wodorotlenek soduFisher ScientificSS255Certyfikowany
kwas solnyFisher ScientificSA49Certyfikowany
jednolufowy ściągacz dojednolufowych A-M Systems6150
Flaming-Brown model P-80/PCSutter InstrumentsZastosowany filament: FT345B
Drut ze stali nierdzewnej pokryty emaliąCalifornia Fine Wire0,001D, powłoka h
Klej do silikonu domowego II GE
Duro Quick-Gel superglue Henkel Corp.
Wzmacniacz A-M Systems model 1700 SystemyUstawienia filtra: 10-500 Hz dla nerwu/mięśnia I2; 300-500 Hz dla wszystkich pozostałych nerwów
Wielokanałowy stymulator PulsemasterWorld Precision InstrumentsA300
World Precision InstrumentsA360
AxoGraph XOprogramowanie naukoweAxoGraph dla nagrania
Złote piny złączaBulginSA3148/1
Złote gniazda złączyBulginSA3149/1
Sylgard 184 Elastomer silikonowyDow Corning
100 x 15 mm Naczynie krystalizującePyrex
Smar wysokopróżniowyDow Corning
Końcówki do pipetFisher Scientific21-375D
Szpilki MinutienNarzędzia do nauki26002-10
ModelinaSargent Art22-4400
Pompa powietrza WhisperTetra77849
Rurki akwarioweEheim778312/16 mm
Elite AirstoneHagenA962
Vannas Nożyczki sprężynoweNarzędzia do nauki15000-08
Dumont #5 Kleszcze do drobnychnarzędzi naukowych11254-20
ChusteczkiKimberly-Clark34155
mikropipet AM Izolator bodźców

Bibliografia

  1. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  2. Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).
  3. Peters, M., Altrup, U. Motor organization in pharynx of Helix pomatia. J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).
  4. Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).
  5. Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).
  6. Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).
  7. Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).
  8. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320(2012).
  9. Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J Vis. Exp. (40), e1791(2010).
  10. Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia. J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).
  11. Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica. J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).
  12. Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).
  13. Iles, J. F. Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).
  14. Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
  15. Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).
  16. Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).
  17. Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).
  18. Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).
  19. Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).
  20. Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
  21. Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).
  22. Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons. J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).
  23. Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).
  24. Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).
  25. Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia. J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).
  26. Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).
  27. Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips. J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).
  28. Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior. J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).
  29. Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).
  30. Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -H., Möller, A. On Micro-Electrode Array Revival. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. Baudry, M., Taketani, M. , Springer Press. New York. 24-37 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Stymulacja zewn trzkom rkowaidentyfikacja neuron w ruchowychzwoje szcz koweelektrody ss ceelektrody szklaneunerwienie mi niprojekcja aksonalnatransdukcja si yrejestracja elektrofizjologiczna
Zewnątrzkomórkowa identyfikacja neuronów ruchowych w puli motorycznej mięśni u Aplysia californica
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.