Optogenetyczna stymulacja zachowań ucieczkowych u Drosophila melanogaster

Podsumowanie

Genetycznie kodowane narzędzia optogenetyczne umożliwiają nieinwazyjną manipulację specyficznymi neuronami w mózgu Drosophila. Takie narzędzia mogą identyfikować neurony, których aktywacja jest wystarczająca do wywołania lub stłumienia określonych zachowań. W tym miejscu przedstawiamy metodę aktywacji rodopsyny kanałowej2, która ulega ekspresji w docelowych neuronach u swobodnie chodzących muszek.

Streszczenie

Coraz więcej genetycznie kodowanych narzędzi staje się dostępnych, które pozwalają na nieinwazyjną manipulację aktywnością neuronalną określonych neuronów u Drosophila melanogaster¹. Najważniejsze z nich to narzędzia optogenetyczne, które umożliwiają aktywację lub wyciszenie określonych neuronów w nienaruszonym i swobodnie poruszającym się zwierzęciu za pomocą jasnego światła. Rodopsyna kanałowa (ChR2) jest kanałem kationowym aktywowanym światłem, który po aktywacji przez niebieskie światło powoduje depolaryzację neuronów, które go wyrażają. ChR2 okazał się skuteczny w identyfikacji neuronów krytycznych dla określonych zachowań, takich jak unikanie CO_{2 ,} rozciąganie trąbki i reakcja na przerażenie za pośrednictwem gigantycznych włókien^2-4. Ponieważ jednak intensywne źródła światła stosowane do stymulacji ChR2 stymulują również fotoreceptory, te techniki optogenetyczne nie były wcześniej stosowane w układzie wzrokowym. Tutaj łączymy podejście optogenetyczne z mutacją, która upośledza fototransdukcję, aby wykazać, że aktywacja klastra wrażliwych na krosno neuronów w płacie wzrokowym muchy, neuronów Foma-1, może napędzać zachowanie ucieczki stosowane w celu uniknięcia kolizji. Użyliśmy allelu zerowego krytycznego składnika kaskady fototransdukcji, fosfolipazy C-β, kodowanej przez gen norpA, aby oślepić muchy, a także użyć systemu aktywatora transkrypcji Gal4-UAS do napędzania ekspresji ChR2 w neuronach Foma-1. Pojedyncze muchy są umieszczone na małej platformie otoczonej niebieskimi diodami LED. Gdy diody LED są podświetlone, muchy szybko wzbijają się w powietrze, w sposób podobny do wizualnie sterowanego zachowania ucieczki z krosna. Uważamy, że technikę tę można łatwo zaadaptować do badania innych zachowań u swobodnie poruszających się much.

Wprowadzenie

Rozwija się rosnący arsenał genetycznie kodowanych narzędzi do manipulowania aktywnością neuronalną w określonych komórkach Drosophila melanogaster¹. Narzędzia te umożliwiają nieinwazyjną aktywację lub wyciszenie określonych neuronów w nienaruszonym i swobodnie poruszającym się zwierzęciu. Wśród nich rodopsyna kanałowa2 (ChR2), kanał kationowy aktywowany światłem, oferuje kluczowe zalety, ponieważ może być kontrolowany czasowo i szybko indukowany. Kiedy neurony wyrażające ChR2 są wystawione na działanie jasnoniebieskiego (470 nm) światła, szybko depolaryzują się i wykazują podwyższoną szybkość wypalania^3-5. Taka ukierunkowana aktywacja o....

Protokół

1. Generuj muchy Channelrhodopsin

1. Cross UAS-ChR2 leci z wybranym przez Ciebie sterownikiem Gal4, używamy G105-Gal4, który ulega ekspresji w neuronach Foma-1 w płacie wzrokowym.
2. Aby wyeliminować możliwość wizualnej reakcji na stymulację światłem niebieskim, obie linie muchowe znajdują się na tle w⁺norpA.
3. Efekt końcowy: w⁺norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. Po zbliżeniu się dorosłych muszek należy umieścić wybrane samice na świeżym pokarmie, uzupełnionym 10 μM all-trans-retinalem (kofaktor wymagany dla ChR2) i chronionym przed światłem, przez 3 dni przed wykonaniem testu behawioralnego.

Wyniki

ślepe muchy wykazujące ekspresję jedynie ChR2 lub samego drivera G105 wykazują niski wskaźnik startu po naświetleniu jasnym niebieskim światłem. ślepe muchy wykazywały ten sam wskaźnik startu niezależnie od naświetlania (Rysunek 2), co sugeruje, że starty te były spontaniczne, a nie wynikały z naświetlania niebieskim światłem. Jednak gdy ChR2 jest wyrażany w neuronach Foma1, naświetlanie niebieskim światłem wywołuje reakcję ucieczki. Ponad 50% badanych much wystartowało w ciągu 1 sec od naświetlenia, a 7.......

Dyskusja

Wykazaliśmy optogenetyczną stymulację zachowań ucieczkowych poprzez kąpiel swobodnie chodzących much w jasnym niebieskim świetle. To podejście można łatwo dostosować do badania innych zachowań u swobodnie chodzących much i można je skalować do większych platform, po prostu układając tablice LED, których używaliśmy, na większym obszarze. Korzystając z niedrogiej kamery, którą opisujemy, lub innych dostępnych systemów kamer, użytkownik może dostosować liczbę klatek na sekundę i rozdzielczość przestrzenną pozyskiwanych obra.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reagent
All-trans Retinal	Advance Scientific Chemical Inc	R3041
Equipment
Radiator 9.2 C/W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm kwadrat X 30 mm wysoki
Carclo 18 ° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Niebieska dioda Rebel LED na trzonku Tri-Star	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC Driver	Luxeonstar	3021-D-E-700
Wiązka przewodów do sterownika BuckPuck	Luxeonstar	3021-HE
Wstępnie przycięta termiczna taśma klejąca	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm
Wąż chłodzący Snap-Loc z podstawą sześciokątną, ¼ " ID	McMaster-Carr	5307K49
Złącze węża płynu chłodzącego Snap-Loc	McMaster-Carr	5307K39	¼ " NPT męski
tryb przełączania klasy laboratoryjnej Programowalny zasilacz prądu stałego	BK Precision	1698
Exilim kamera	Casio	EX-FH20