Optogenetyczna stymulacja zachowań ucieczkowych u Drosophila melanogaster

Podsumowanie

Genetycznie kodowane narzędzia optogenetyczne umożliwiają nieinwazyjną manipulację specyficznymi neuronami w mózgu Drosophila. Takie narzędzia mogą identyfikować neurony, których aktywacja jest wystarczająca do wywołania lub stłumienia określonych zachowań. W tym miejscu przedstawiamy metodę aktywacji rodopsyny kanałowej2, która ulega ekspresji w docelowych neuronach u swobodnie chodzących muszek.

Streszczenie

Coraz więcej genetycznie kodowanych narzędzi staje się dostępnych, które pozwalają na nieinwazyjną manipulację aktywnością neuronalną określonych neuronów u Drosophila melanogaster¹. Najważniejsze z nich to narzędzia optogenetyczne, które umożliwiają aktywację lub wyciszenie określonych neuronów w nienaruszonym i swobodnie poruszającym się zwierzęciu za pomocą jasnego światła. Rodopsyna kanałowa (ChR2) jest kanałem kationowym aktywowanym światłem, który po aktywacji przez niebieskie światło powoduje depolaryzację neuronów, które go wyrażają. ChR2 okazał się skuteczny w identyfikacji neuronów krytycznych dla określonych zachowań, takich jak unikanie CO_{2 ,} rozciąganie trąbki i reakcja na przerażenie za pośrednictwem gigantycznych włókien^2-4. Ponieważ jednak intensywne źródła światła stosowane do stymulacji ChR2 stymulują również fotoreceptory, te techniki optogenetyczne nie były wcześniej stosowane w układzie wzrokowym. Tutaj łączymy podejście optogenetyczne z mutacją, która upośledza fototransdukcję, aby wykazać, że aktywacja klastra wrażliwych na krosno neuronów w płacie wzrokowym muchy, neuronów Foma-1, może napędzać zachowanie ucieczki stosowane w celu uniknięcia kolizji. Użyliśmy allelu zerowego krytycznego składnika kaskady fototransdukcji, fosfolipazy C-β, kodowanej przez gen norpA, aby oślepić muchy, a także użyć systemu aktywatora transkrypcji Gal4-UAS do napędzania ekspresji ChR2 w neuronach Foma-1. Pojedyncze muchy są umieszczone na małej platformie otoczonej niebieskimi diodami LED. Gdy diody LED są podświetlone, muchy szybko wzbijają się w powietrze, w sposób podobny do wizualnie sterowanego zachowania ucieczki z krosna. Uważamy, że technikę tę można łatwo zaadaptować do badania innych zachowań u swobodnie poruszających się much.

Wprowadzenie

Rozwija się rosnący arsenał genetycznie kodowanych narzędzi do manipulowania aktywnością neuronalną w określonych komórkach Drosophila melanogaster¹. Narzędzia te umożliwiają nieinwazyjną aktywację lub wyciszenie określonych neuronów w nienaruszonym i swobodnie poruszającym się zwierzęciu. Wśród nich rodopsyna kanałowa2 (ChR2), kanał kationowy aktywowany światłem, oferuje kluczowe zalety, ponieważ może być kontrolowany czasowo i szybko indukowany. Kiedy neurony wyrażające ChR2 są wystawione na działanie jasnoniebieskiego (470 nm) światła, szybko depolaryzują się i wykazują podwyższoną szybkość wypalania^3-5. Taka ukierunkowana aktywacja określonych neuronów u swobodnie poruszających się zwierząt ujawniła wystarczalność określonych neuronów do zachowań^{, takich} jak unikanie CO_{2 3}, wydłużenie trąbki^2,4 i reakcje przerażenia za pośrednictwem gigantycznych włókien⁴. Ponieważ jednak intensywne źródła światła niezbędne do stymulacji ChR2 stymulują również fotoreceptory, zastosowanie technik optogenetycznych do układu wzrokowego było ograniczone. Łącząc podejście optogenetyczne z mutacją, która upośledza fototransdukcję, wykazaliśmy, że aktywacja określonego klastra neuronów w płacie wzrokowym muchy może napędzać zachowanie ucieczki używane do unikania kolizji⁶.

Większość, jeśli nie wszystkie, zwierzęta wizualne zachowują się jak zwierzęta uciekające, aby uniknąć kolizji z nadjeżdżającymi obiektami. Muchy kroczące lub nieruchome, gdy znajdują się w obliczu zbliżającej się kolizji, wzbijają się w lot, oddalając się od nadjeżdżającej kolizji^7-9. Starty te charakteryzują się podniesionymi skrzydłami przed startem i niestabilną trajektorią lotu^10,11. Ta reakcja różni się od reakcji na przestraszenie za pośrednictwem gigantycznego włókna, skoków, które nie są poprzedzone uniesionymi skrzydłami i zwykle kończą się swobodnym spadaniem^4,9 . Po zidentyfikowaniu specyficznego skupiska neuronów wrażliwych na krosno w płacie wzrokowym, neuronów Foma-1, które są unikalnie dostrojone do kodowania zbliżających się obiektów, staraliśmy się zbadać ich udział w zachowaniu ucieczki muchy. Tutaj pokazujemy zastosowanie optogenetyki do selektywnej aktywacji tych neuronów i wywołania zachowania ucieczki muchy.

Używamy systemu aktywatora transkrypcji Gal4-UAS do sterowania ekspresją ChR2 w neuronach Foma-1. ChR2 wymaga kofaktora all-trans-retinal, a ponieważ występuje on w niskich ilościach w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila, musi być uzupełniany w diecie muszek. ^3,4 Ponieważ jasne światło jest używane do aktywacji ChR2, a muchy wykazują silne zachowania fototaktyczne¹², staraliśmy się wyeliminować możliwość wizualnej odpowiedzi na bodziec. W tym celu wykorzystaliśmy zwierzęta, które były homozygotycznymi mutantami pod względem allelu zerowego genu norpA, który koduje krytyczny składnik kaskady fototransdukcji, fosfolipazę C-β. Fotoreceptory u takich zmutowanych much nie są w stanie reagować na światło¹³. Aby przetestować optogenetyczną stymulację reakcji ucieczki, musimy wyizolować pojedynczą muchę i wykąpać ją w jasnoniebieskim świetle. W tym celu umieszczamy pojedyncze muchy w końcówkach pipet. Jedna końcówka pipety jest umieszczona w niestandardowym uchwycie, dzięki czemu mucha geotaktycznie przejdzie w górę końcówki i wyjdzie na prostokątną platformę. Mucha jest w stanie swobodnie chodzić po szczycie tej platformy. Platforma jest otoczona czterema niebieskimi diodami LED, z których każda zawiera 3 diody LED, skupione na górnej części platformy. Po tym, jak mucha znajdzie się na platformie, diody LED są podświetlane, a reakcja muchy jest rejestrowana za pomocą szybkiej kamery⁶.

Protokół

1. Generuj muchy Channelrhodopsin

1. Cross UAS-ChR2 leci z wybranym przez Ciebie sterownikiem Gal4, używamy G105-Gal4, który ulega ekspresji w neuronach Foma-1 w płacie wzrokowym.
2. Aby wyeliminować możliwość wizualnej reakcji na stymulację światłem niebieskim, obie linie muchowe znajdują się na tle w⁺norpA.
3. Efekt końcowy: w⁺norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. Po zbliżeniu się dorosłych muszek należy umieścić wybrane samice na świeżym pokarmie, uzupełnionym 10 μM all-trans-retinalem (kofaktor wymagany dla ChR2) i chronionym przed światłem, przez 3 dni przed wykonaniem testu behawioralnego.

2. Przygotuj 10 μM Całkowicie Trans-Retinal Enhanced Food

1. Rozpuść 100 mg all-trans-retinalu w 17,6 ml 95% etanolu, aby uzyskać 20 mM siatkówki. Utrzymuj all-trans-retinal chroniony przed światłem przez cały czas.
2. Rozpuść standardowy pokarm na muchy z mąki kukurydzianej w kuchence mikrofalowej i ostudź do ciepła
.
3. Wymieszać 50 μl 20 mM all-trans-retinal z fiolkami zawierającymi 10 ml pokarmu dla much.
4. Pozostawić fiolki do ostygnięcia i chronić przed światłem.

3. Wyposażenie

1. Końcówki do pipet: Standardowe końcówki do pipet o pojemności 1 000 μl są nacinane w pobliżu końcówki, tworząc pory o średnicy ~2,25 mm.
2. Platforma (zob. rysunek 1).
   1. Podstawa Delrin o wymiarach 17 cm x 25 cm została skonstruowana z gwintowanymi otworami w każdym rogu, aby dopasować złącza węży płynu chłodzącego 1/4" NPT.
   2. Pionowy uchwyt, wykonany z Delrin, jest przymocowany do środka podstawy. Wymiary całkowite to 25 mm X 40 mm X 65 mm (szerokość X głębokość X wysokość). Rowek o szerokości 10 mm biegnie przez całą długość uchwytu, ze śrubą skrzydełkową na dole. Do górnej części uchwytu przymocowana jest platforma o wymiarach 25 mm X 40 mm X 10 mm z otworem o średnicy 3,5 mm wyrównanym z rowkiem w uchwycie.
3. Tablice LED (patrz rysunek 1).
   1. Cztery ramiona węża płynu chłodzącego o długości ~18 cm są przymocowane do podstawy platformy za pomocą złącza węża płynu chłodzącego. Wąż płynu chłodzącego służy tylko jako podpora konstrukcyjna i nie służy do chłodzenia.
   2. Odpowiednio rozmieszczone rowki są wycinane w ostatnim kawałku węża chłodziwa każdego ramienia, aby przymocować radiator do końca każdego ramienia.
   3. Niebieska dioda LED Rebel Tri-Stars jest montowana do każdego radiatora za pomocą wstępnie przyciętej termicznej taśmy klejącej. Do każdej Tri-Star przymocowana jest soczewka Carclo 18 ° Tri-Spot.
   4. Diody LED Tri-Stars są podłączone do sterowników prądu stałego BuckPuck i zasilacza zgodnie ze specyfikacją. Ustaliliśmy naszą konfigurację tak, aby każdy BuckPuck zasilał szeregowo dwie Tri-Stary.
   5. Oświetlenie wszystkich czterech diod LED Tri-Stars o natężeniu 700 mA dało natężenie promieniowania na poziomie 713 W/^m2 na naszej platformie.
4. Kamera: Kamera jest zamontowana na małym statywie i skupia się na górnej części platformy.

4. Test behawioralny

1. Krótko znieczulić muchy na lodzie.
2. Umieść pojedyncze muchy w końcówkach pipet, używając taśmy do zamknięcia obu końcówek końcówki.
3. Po tym, jak muchy się obudzą i będą aktywnie badać końcówkę pipety, usuń taśmę i umieść pipetę w rowku w pionowym uchwycie. Śruba skrzydełkowa służy do zamocowania końcówki pipety na miejscu i zamknięcia dolnej części końcówki.
4. Gdy mucha bada końcówkę pipety (zwykle 30 - 60 sekund), rozpocznij nagrywanie z kamery tuż przed tym, jak mucha wynurzy się z końcówki na platformę.
5. Po tym, jak mucha pojawi się na platformie, odczekaj 1-2 seco i włącz niebieskie diody LED. Użyj timera, aby ręcznie zmierzyć czas, aż mucha rozpocznie lot.

Wyniki

ślepe muchy wykazujące ekspresję jedynie ChR2 lub samego drivera G105 wykazują niski wskaźnik startu po naświetleniu jasnym niebieskim światłem. ślepe muchy wykazywały ten sam wskaźnik startu niezależnie od naświetlania (Rysunek 2), co sugeruje, że starty te były spontaniczne, a nie wynikały z naświetlania niebieskim światłem. Jednak gdy ChR2 jest wyrażany w neuronach Foma1, naświetlanie niebieskim światłem wywołuje reakcję ucieczki. Ponad 50% badanych much wystartowało w ciągu 1 sec od naświetlenia, a 7...

Dyskusja

Wykazaliśmy optogenetyczną stymulację zachowań ucieczkowych poprzez kąpiel swobodnie chodzących much w jasnym niebieskim świetle. To podejście można łatwo dostosować do badania innych zachowań u swobodnie chodzących much i można je skalować do większych platform, po prostu układając tablice LED, których używaliśmy, na większym obszarze. Korzystając z niedrogiej kamery, którą opisujemy, lub innych dostępnych systemów kamer, użytkownik może dostosować liczbę klatek na sekundę i rozdzielczość przestrzenną pozyskiwanych obra...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reagent
All-trans Retinal	Advance Scientific Chemical Inc	R3041
Equipment
Radiator 9.2 C/W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm kwadrat X 30 mm wysoki
Carclo 18 ° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Niebieska dioda Rebel LED na trzonku Tri-Star	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC Driver	Luxeonstar	3021-D-E-700
Wiązka przewodów do sterownika BuckPuck	Luxeonstar	3021-HE
Wstępnie przycięta termiczna taśma klejąca	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm
Wąż chłodzący Snap-Loc z podstawą sześciokątną, ¼ " ID	McMaster-Carr	5307K49
Złącze węża płynu chłodzącego Snap-Loc	McMaster-Carr	5307K39	¼ " NPT męski
tryb przełączania klasy laboratoryjnej Programowalny zasilacz prądu stałego	BK Precision	1698
Exilim kamera	Casio	EX-FH20