Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA w celu profilowania ekspresji genów w wysokiej rozdzielczości syntezy, przetwarzania i rozpadu RNA w hodowli komórkowej

27K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50195

⸱

8 sierpnia 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max von Pettenkofer Institute, 2Department of Medicine, University of Cambridge, 3Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-University Munich

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Całkowite komórkowe RNA stanowi kiepski szablon do badania krótkoterminowych zmian w syntezie i rozpadzie RNA, jak również kinetyki przetwarzania RNA. W tym miejscu opisujemy znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA za pomocą 4-tiourydyny, a następnie biotynylację specyficzną dla tiolu i oczyszczanie nowo transkrybowanego RNA, co pozwala przezwyciężyć te ograniczenia.

Streszczenie

Rozwój mikromacierzy całego transkryptomu i sekwencjonowania nowej generacji zrewolucjonizował nasze zrozumienie złożoności ekspresji genów komórkowych. Wraz z lepszym zrozumieniem mechanizmów molekularnych związanych z tymi zjawiskami, coraz ważniejsze stają się precyzyjne pomiary kinetyki leżącej u ich podstaw. W tym przypadku te potężne metodologie napotykają poważne ograniczenia ze względu na wewnętrzne właściwości badanych próbek matrycowych, tj. całkowite komórkowe RNA. W wielu przypadkach zmiany w całkowitym komórkowym RNA zachodzą albo zbyt wolno, albo zbyt szybko, aby przedstawić leżące u ich podstaw zdarzenia molekularne i ich kinetykę z wystarczającą rozdzielczością. Ponadto udział zmian w syntezie, przetwarzaniu i rozpadzie RNA nie jest łatwy do zróżnicowania.

Niedawno opracowaliśmy profilowanie ekspresji genów o wysokiej rozdzielczości, aby przezwyciężyć te ograniczenia. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym nowo transkrybowanego RNA za pomocą 4-tiourydyny (określanym również jako znakowanie 4sU), a następnie rygorystycznym oczyszczaniu nowo transkrybowanego RNA za pomocą biotynylacji specyficznej dla tiolu i kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną. Ma zastosowanie do szerokiej gamy organizmów, w tym kręgowców, Drosophila i drożdży. Z powodzeniem zastosowaliśmy znakowanie 4sU do badania kinetyki aktywności czynników transkrypcyjnych w czasie rzeczywistym, zapewnienia precyzyjnych pomiarów okresów półtrwania RNA i uzyskania nowych informacji na temat kinetyki przetwarzania RNA. Wreszcie, modelowanie obliczeniowe można wykorzystać do wygenerowania zintegrowanej, kompleksowej analizy podstawowych mechanizmów molekularnych.

Wprowadzenie

Profilowanie ekspresji genów jest kluczowym narzędziem używanym do badania procesów komórkowych i związanej z nimi złożonej sieci interakcji. Badania nad obfitością mRNA były zazwyczaj metodą z wyboru w celu uzyskania podstawowych informacji na temat podstawowych mechanizmów molekularnych. Opracowanie mikromacierzy całotranskryptomowych 1, a ostatnio sekwencjonowanie RNA nowej generacji (sekwencjonowanie RNA) 2-4 napędzało to podejście. Chociaż technologie te zrewolucjonizowały nasze zrozumienie złożoności ekspresji genów komórkowych, napotykają poważne ograniczenia ze względu na wewnętrzne właściwości ich próbki matrycowej, tj. całkowitego komórkowego RNA. Po pierwsze, krótkoterminowe zmiany w całkowitych poziomach RNA nie odpowiadają zmianom szybkości transkrypcji, ale są z natury zależne od okresu półtrwania RNA odpowiednich transkryptów. Podczas gdy pięciokrotna indukcja krótkotrwałego transkryptu, np. kodowanie czynnika transkrypcyjnego, będzie łatwo wykrywalna w całkowitym RNA w ciągu godziny, ta sama indukcja długożyciowego transkryptu, np. kodowanie enzymu metabolicznego, pozostanie praktycznie niewidoczna. Ponadto, nawet całkowite wyłączenie (>1000-krotna regulacja w dół) szybkości transkrypcji przeciętnego genu z okresem półtrwania RNA wynoszącym pięć godzin, zajmie po prostu pięć godzin, aby jego całkowity poziom RNA zmniejszył się tylko dwukrotnie. Dlatego analiza całkowitego RNA sprzyja wykrywaniu regulacji w górę krótkożyciowych transkryptów, z których wiele koduje czynniki transkrypcyjne i geny o funkcjach regulacyjnych 5. Ponadto prawdziwa kinetyczna kaskada regulacji jest zaciemniona, a pierwotnych zdarzeń sygnalizacyjnych nie można odróżnić od wtórnych. Oba te czynniki mogą z kolei prowadzić do znacznego odchylenia w dalszych analizach bioinformatycznych. Po drugie, zmiany w całkowitych poziomach RNA nie mogą być przypisane zmianom w syntezie lub rozpadzie RNA. Pomiary tych ostatnich wymagają inwazyjnych podejść komórkowych, np. blokowania transkrypcji za pomocą aktynomycyny D6 oraz rozszerzonego monitorowania trwającego rozpadu RNA w czasie. Przy średnim okresie półtrwania mRNA w komórkach ssaków wynoszącym 5 - 10 godzin 5,7, poziomy mRNA większości genów spadną tylko mniej niż dwukrotnie po kilku godzinach od zatrzymania transkrypcji. Te raczej niewielkie różnice skutkują rażąco nieprecyzyjnymi pomiarami okresów półtrwania mRNA dla większości genów komórkowych ze względu na wykładniczy charakter leżących u podstaw równań matematycznych. Wreszcie, podczas gdy sekwencjonowanie RNA całkowitego komórkowego RNA ujawniło, że około połowa naszych genów podlega alternatywnym zdarzeniom splicingu8, leżąca u podstaw kinetyka, a także dynamiczne mechanizmy kierujące specyficzną tkankowo i kontekstowo regulacją przetwarzania RNA pozostają słabo poznane. Ponadto nie ustalono jeszcze udziału przetwarzania RNA w zróżnicowanej ekspresji genów, szczególnie w przypadku niekodujących RNA. Ogólnie rzecz biorąc, ograniczenia te stanowią główną przeszkodę dla bioinformatycznego modelowania kinetycznego podstawowych mechanizmów molekularnych.

Niedawno opracowaliśmy podejście, nazwane profilowaniem ekspresji genów w wysokiej rozdzielczości, aby przezwyciężyć te problemy 5,7,9. Opiera się na znakowaniu metabolicznym nowo transkrybowanego RNA przy użyciu 4-tiourydyny (znakowanie 4sU), naturalnie występującej pochodnej urydyny, i zapewnia bezpośredni dostęp do nowo transkrybowanych transkryptów przy minimalnej ingerencji we wzrost komórek i ekspresję genów (patrz ryc. 1) 5,10-12. Narażenie komórek eukariotycznych na 4sU powoduje jego szybki wychwyt, fosforylację do 4sU-trifosforanu i włączenie do nowo transkrybowanego RNA. Po wyizolowaniu całkowitego komórkowego RNA, znakowana 4sU frakcja RNA jest biotynylowana specyficznie dla tiolu, generując wiązanie dwusiarczkowe między biotyną a nowo transkrybowanym RNA. "Całkowite komórkowe RNA" można następnie ilościowo rozdzielić na znakowane ("nowo transkrybowane") i nieznakowane ("wcześniej istniejące") RNA o wysokiej czystości za pomocą kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną. Na koniec znakowany RNA jest odzyskiwany z kulek poprzez proste dodanie środka redukującego (np. ditiotreitolu) rozszczepiającego wiązanie dwusiarczkowe i uwalniającego nowo transkrybowany RNA z kulek.

Nowo transkrybowane RNA przedstawia aktywność transkrypcyjną każdego genu w czasie ekspozycji na 4sU. Znakowanie 4sU w skali minutowej daje więc migawkowy obraz ekspresji genów eukariotycznych i idealny szablon do dalszych analiz bioinformatycznych (np. analizy promotora). W przypadkach, w których można założyć warunki stanu stacjonarnego, proporcje nowo transkrybowanego/całkowitego, nowo transkrybowanego/nieznakowanego i nieznakowanego/całkowitego RNA zapewniają nieinwazyjny dostęp do precyzyjnych okresów półtrwania RNA 7,13. Ponadto ważne jest, aby pamiętać, że nowo transkrybowane RNA oczyszczone już po 5 minutach znakowania 4sU (5 minut 4sU-RNA) jest młodsze niż 15 i 60 minut 4sU-RNA. Podczas wykonywania zarówno ultrakrótkiego, jak i stopniowo wydłużającego znakowania 4sU w jednym środowisku eksperymentalnym w połączeniu z sekwencją RNA, kinetyka przetwarzania RNA ujawnia się przy rozdzielczości nukleotydów 9. Wreszcie, analizy przebiegu czasowego nowo transkrybowanego i całkowitego RNA w połączeniu z modelowaniem obliczeniowym pozwalają na zintegrowaną analizę syntezy i rozpadu RNA 14.

Podsumowując, to podejście pozwala na bezpośrednią analizę dynamiki syntezy, przetwarzania i degradacji RNA w komórkach eukariotycznych. Ma zastosowanie we wszystkich głównych organizmach modelowych, w tym ssakach, owadach (Drosophila), (Xenopus) i drożdżach 5,15,16. Jest bezpośrednio kompatybilny z analizą mikromacierzy 5,17, sekwencją RNA 9,13,14 i ma zastosowanie in vivo12,15. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metodologię znakowania, izolowania i oczyszczania nowo transkrybowanego RNA w hodowanych komórkach ssaków. Ponadto omawiane są potencjalne problemy i pułapki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiourydyny

Zrób szczegółowy plan eksperymentalnego harmonogramu, np. kiedy dodać 4sU do hodowli komórkowej i kiedy pobrać próbki. Zaplanuj co najmniej 5 minut między każdym warunkiem. Traktuj tylko komórki jednego schorzenia na raz. Obsługa maksymalnie 3 - 5 naczyń w danym czasie. Z komórkami należy obchodzić się tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować zmiany temperatury i poziomu CO2 . Unikaj wystawiania komórek na jasne światło po dodaniu 4sU, ponieważ może to spowodować sieciowanie RNA znakowanego 4sU z białkami komórkowymi.

Początek etykietowania

  1. Rozmrozić 4-tiourydynę (4sU) tuż przed użyciem i odpipetować wymaganą ilość 4sU dla każdego stanu do sterylnej probówki Falcon.
  2. Zdejmij wymaganą ilość pożywki do hodowli komórkowych (5 ml na 10 cm naczynie) z szalek i dodaj do probówki Falcon zawierającej 4sU i dokładnie wymieszaj. Wyjmij i wyrzuć pozostałe podłoże z naczyń.
  3. Nałóż pożywkę zawierającą 4sU z powrotem na naczynia.

Koniec etykietowania

  1. Usuń pożywkę do hodowli komórkowych z komórek. Do każdej płytki dodać 5 ml leku Trizol. W przypadku złożonych eksperymentów obejmujących wiele punktów czasowych lub warunków, ten krok najlepiej wykonać dwie osoby, z których jedna usuwa pożywkę, a druga dodaje Trizol i zbiera lizat.
  2. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu całkowitej lizy komórek.
  3. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml dokładnie przepłukać płytkę dodanym Trizolem. Pomaga to w całkowitej lizie komórek i odzyskaniu próbki. Należy obchodzić się z nim ostrożnie, ponieważ kontakt ze skórą lub oczami jest niezwykle niebezpieczny! Należy mieć pod ręką antidotum na oparzenia fenolowe (np. glikol polietylenowy 300 lub 400 w przemysłowych spirytusach metylowych (70:30)). Przenieść próbki do probówek polipropylenowych. Należy pamiętać, że standardowe rurki Falcon nie wytrzymują tych dużych sił g). Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej jeden miesiąc, aż do przygotowania całkowitego RNA.

2. Przygotowanie RNA przy użyciu zmodyfikowanego protokołu Trizol

  1. Dodać 1 ml chloroformu (0,2 ml na ml Trizolu) i energicznie wstrząsać przez 15 sekund. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 - 3 minuty.
  2. Wirować w temperaturze 13 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Przenieść górną fazę wodną (zawierającą RNA) do nowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml.
  4. Dodać 1/2 objętości reakcyjnej zarówno buforu strącającego RNA, jak i izopropanolu (np. do 3 ml supernatantu dodać 1,5 ml buforu wytrącającego RNA i 1,5 ml izopropanolu).
  5. Dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  6. Odwirować w temperaturze 13 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  7. Odwirować krótko (5 000 × g przez 30 sekund) i usunąć resztki izopropanolu za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  8. Dodaj równą objętość 75% etanolu i potrząsaj rurką, aż granulka się odczepi. Unikaj rozbijania go na wiele małych kawałków, ponieważ może to utrudnić usunięcie resztek etanolu.
  9. Odwirować w temperaturze 13 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  10. Odkręć na chwilę RNA i usuń pozostały etanol za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Powtórz krok i usuń pozostały etanol za pomocą pipety o pojemności 20 μl. Po tych dwóch krokach nie należy wykonywać dalszego suszenia granulatu.
  11. Dodać 100 μlH2Ona 100 μg oczekiwanego plonu RNA i dobrze wymieszać, pipetując w górę iw dół 5-6 razy, aby pomóc w rozpuszczeniu RNA.
  12. Rozpuścić i zdenaturować RNA poprzez ogrzewanie do temperatury 65 °C przez 10 minut (wytrząsanie) i natychmiast umieścić na lodzie.
  13. Zmierz stężenie RNA przy 260 nm za pomocą spektrofotometru NanoDrop, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Ten RNA może być przechowywany w temperaturze -80 °C przez co najmniej jeden miesiąc.

3. Specyficzna dla tiolu biotynylacja nowo transkrybowanego RNA

  1. Zacznij od 60 - 80 μg całkowitego komórkowego RNA.
  2. Stanowią reakcję etykietowania. Odpipetować w następującej kolejności (na μg RNA):
    1. 1 μl 10x bufor biotynylacyjny
    2. 7 μl RNA (zawierające 1 μg RNA rozcieńczonego w H2Owolnym od nukleaz)
    3. 2 μl biotyny-HPDP (1 mg/ml DMF)

Zawsze dodawaj biotynę-HPDP na końcu i natychmiast mieszaj pipetując. W przypadku wytrącenia się biotyny, zawartość DMF można zwiększyć do końcowego stężenia 40%.

  1. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny z rotacją.
  2. Dodać równą objętość chloroformu. Mieszaj energicznie. Inkubuj przez 2-3 minuty, aż fazy zaczną się rozdzielać, a pęcherzyki zaczną znikać.
  3. Wirować przy 20 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie przenieść górną fazę wodną do nowej probówki.
  4. Powtórz kroki 3.4 i 3.5 raz. Możesz wykonać ten krok w 2 ml ciężkich probówkach Phase Lock Gel, aby zmniejszyć utratę RNA.
  5. Wytrącanie RNA: dodać 1/10 objętości 5 M NaCl i równą objętość izopropanolu do fazy wodnej.
  6. Odwirować w temperaturze 20 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  7. Dodać równą objętość 75% etanolu, odwirować przy 20 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant.
  8. Krótko odwirować i usunąć resztki etanolu za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  9. Krótko odwirować i usunąć resztki etanolu za pomocą pipety o pojemności 20 μl.
  10. Nie dopuścić do wyschnięcia RNA. Ponownie zawiesić go w 50 - 100 μl H2O (~1 μl na 1 μg wejściowego RNA). Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół 5-6 razy.
  11. Sprawdź jakość RNA za pomocą analizy elektroforetycznej, aby wykluczyć degradację RNA.

4. Analiza punktowa inkorporacji 4sU (opcjonalnie)

może być łatwo określona przez analizę dot blot biotynylowanego RNA. Jest to opcjonalny krok, który umożliwia rozwiązywanie problemów i oszacowanie wskaźników inkorporacji 4sU w stosunku do kontroli oligonucyklotydów biotynylowanego DNA. Do tego testu zalecamy użycie jodoacetylo-biotyny zamiast biotyny-HPDP do biotynylacji RNA znakowanego 4sU w kroku 3.2. Powoduje to nieodwracalną biotynylację 4sU-RNA. W związku z tym metody oparte na kolumnach (np. RNeasy) mogą być stosowane do odzyskiwania znacznie mniejszych ilości biotynylowanego RNA (np. 5 μg). Podczas gdy RNA biotynylowane przy użyciu biotyny-HPDP jest również odpowiednie do tego testu, uzyskany sygnał jest słabszy, a stosunek sygnału do szumu mniej korzystny (ryc. 3).

  1. Postępuj zgodnie z protokołem znakowania 4sU i izolacji całkowitego komórkowego RNA, jak opisano w sekcjach 1 i 2.
  2. RNA znakowane biotytylanem 4sU, zgodnie z opisem w sekcji 3, zastępując biotynę-HPDP jodoacetylobiotyną i wykonaj dwie ekstrakcje chloroformem w celu całkowitego usunięcia nadmiaru pozostałości jodoacetylo-biotyny.
  3. Odzyskać biotynylowane RNA przez wytrącanie izopropanolu/etanolu zgodnie z opisem lub przy użyciu podejścia kolumnowego (np. RNeasy) w przypadku stosowania niewielkich ilości RNA (<10 μg).
  4. Inkubować błonę Zeta w wodzie wolnej od nukleaz z kołysaniem przez 10 minut.
  5. Wyjmij membranę z wody wolnej od nukleaz i usuń nadmiar płynów, umieszczając membranę między dwoma czystymi ręcznikami papierowymi i mocno dociskając. Suszenie membrany na powietrzu przez 5 minut spowoduje uzyskanie ładniejszych kropek.
  6. Dla każdej próbki należy przygotować 20 μl 200 ng/μl RNA, używając lodowatego buforu wiążącego kropki (10 mM NaOH, 1 mM EDTA). Nanieść 5 μl tego rozcieńczenia (tj. 1 μg RNA), jak również trzy kolejne 10-krotne rozcieńczenia (tj. odpowiednio 100, 10 i 1 ng RNA) na błonę Zeta za pomocą pipetowania. Pipetowanie przez pusty stojak z końcówkami do pipet może być stosowane w celu zapewnienia równomiernie rozłożonych odstępów. Alternatywnie można użyć aparatu do usuwania kropek zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Nanieść 5 μl oligonugolaktykum DNA znakowanego biotyną w stężeniach od 20 ng/μl do 20 pg/μl (tj. 100 do 0,1 ng oligonugolakotyny) jako kontrolę pozytywną do błony przez pipetowanie. Użyj biotynylowanej próbki niezakażonej 4sU jako kontroli ujemnej.
  8. Suszyć membranę na powietrzu przez 5 minut.
  9. Inkubować błonę przez 30 minut w 40 ml buforze blokującym z kołysaniem.
  10. Inkubować błonę z 10 ml 1:1 000 peroksydazy streptawidynowo-chrzanowej przez 15 minut (5 ml PBS + 5 ml 20% SDS + 10 μl streptawidyny i peroksydazy chrzanowej)
  11. Przemyć membranę dwukrotnie w 40 ml PBS + 10% SDS (20 ml PBS + 20 ml 20% SDS) przez 5 min.
  12. Przemyć membranę dwukrotnie w 40 ml PBS + 1% SDS (38 ml PBS + 2 ml 20% SDS) przez 5 min.
  13. Przemyć membranę dwukrotnie w 40 ml PBS + 0,1% SDS (40 ml PBS + 200 μl 20% SDS) przez 5 min.
  14. Usuń nadmiar płynu, umieszczając membranę między dwoma czystymi ręcznikami papierowymi i mocno je dociskając.
  15. Wizualizacja HRP związanego z błoną za pomocą ECL zgodnie z instrukcjami producenta.
  16. Umieść membranę w plastikowej folii/torbie, usuń pęcherzyki powietrza i inkubuj przez 2 minuty w ciemności.
  17. Wystaw membranę na folię na 1 - 5 minut.

5. Separacja znakowanego i nieznakowanego RNA za pomocą kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną

  1. Podgrzać bufor do przemywania (3 ml na próbkę) do temperatury 65 °C w łaźni wodnej.
  2. Przygotować świeży 100 mM ditiotreitol (DTT) w H2O wolnym od nukleaz. W tym celu należy zdekantować 15 - 30 mg proszku DTT do czystej probówki Falcon o pojemności 50 ml umieszczonej na bardzo drobnej skali. Zważyć i dodać wymaganą ilość H2O wolnego od nukleaz.
  3. Podgrzewać próbki biotynylowanego RNA do temperatury 65 °C przez 10 minut w celu denaturacji i natychmiast umieścić na lodzie.
  4. Umieść kolumny μMac w stojaku magnetycznym. Zalecamy, aby nie przetwarzać więcej niż 12 próbek na raz (optymalne jest 6 - 8 próbek).
  5. Wstępnie zrównoważyć kolumny Miltenyi za pomocą 1 ml buforu do przemywania o temperaturze pokojowej. Zajmie to około 15 minut.
  6. W międzyczasie dodaj 100 μl kulek streptawidyny do 50 - 100 μl biotynylowanego RNA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut z rotacją.
  7. Jeśli którakolwiek z kolumn nie rozpoczęła do tej pory opróżniania, można to ułatwić, delikatnie naciskając na górną część kolumny palcem w rękawiczce. Po rozpoczęciu przepływu kolumny łatwo opróżniają się.
  8. Nałóż RNA/kulki na kolumny. Odrzuć przepływ, chyba że chcesz odzyskać nieznakowaną frakcję RNA (patrz punkt 7).
  9. Przemyć trzykrotnie 0,9 ml buforu do przemywania o temperaturze 65 °C (końcówki do pipet o pojemności 1 ml kurczą się podczas pipetowania w temperaturze 65 °C).
  10. Przemyć trzykrotnie 0,9 ml buforu myjącego o temperaturze pokojowej.
  11. Odpipetować 700 μl buforu RLT (RNeasy MinElute Cleanup Kit, Qiagen) do nowych probówek o pojemności 2 ml i umieścić je pod kolumnami.
  12. Nowo transkrybowany RNA należy wypłukać do bufora RLT, dodając do kolumn 100 μl 100 mM DTT.
  13. Wykonaj drugą rundę elucji 3 minuty później do tej samej probówki, dodając kolejne 100 μl 100 mM DTT.

6. Odzyskiwanie nowo przepisanego RNA

Kontynuuj korzystanie z protokołu RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. Elute w 25 μl H2O, wolnym od nukleaz. Zmierz stężenia RNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop. Aby uniknąć konieczności rozmrażania i ponownego zamrażania RNA przed poddaniem go testowi wysokoprzepustowemu, zalecamy przygotowanie cDNA natychmiast po oczyszczeniu nowo transkrybowanego RNA. Użyj 2,5 μl nowo transkrybowanego RNA w 20 μl mieszanki syntezy cDNA do syntezy cDNA zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj kontrole qRT-PCR przy użyciu rozcieńczeń mieszaniny cDNA w stosunku 1:10. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.

7. Odzyskiwanie nieoznakowanego, niezwiązanego RNA (opcjonalnie)

W przypadku, gdy konieczne jest odzyskanie niezwiązanego RNA; zebrać i połączyć przepływ (po dodaniu roztworu kulek RNA-streptawidyny do kolumn) i pierwsze płukanie w celu późniejszego wytrącenia. Zwykle wystarczy wytrącić tylko 50% niezwiązanego RNA, ponieważ będzie on zawierał >80% materiału wyjściowego.

  1. Dodać równą objętość izopropanolu (nie trzeba dodawać soli, ponieważ bufor myjący zawiera już 1 M NaCl).
  2. Odwirować w temperaturze 20 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  3. Dodać równą objętość 75% etanolu, odwirować przy 20 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant.
  4. Krótko odwirować i usunąć resztki etanolu za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  5. Krótko odwirować i usunąć resztki etanolu za pomocą pipety o pojemności 20 μl.
  6. Nie dopuścić do wyschnięcia RNA. Zawiesić go ponownie w 100 μl H2O. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół 5 - 6 razy. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut, wstrząsając i przenieść bezpośrednio do lodu.
  7. Sprawdź jakość RNA za pomocą analizy elektroforetycznej, aby wykluczyć degradację RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

1. Materiał wyjściowy i spodziewane wydajności

Po 1 godzinie (hr) ekspozycji na 4sU nowo syntetyzowane RNA stanowi około 1 - 4% całkowitego RNA komórkowego. Wartość ta będzie niższa w komórkach z zahamowanym wzrostem, ponieważ nie syntetyzują one już RNA niezbędnego do wzrostu i replikacji komórek. Przy znakowaniu trwającym 1 hr zalecamy rozpoczęcie analizy od 60 - 80 μg całkowitego RNA. Zastosowanie mniej niż 30 μg całkowitego RNA prowadzi do powstania małych osadów RNA, które są trudne do zauwa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA znacznie zwiększa moc technologii o wysokiej przepustowości, takich jak mikromacierze i sekwencjonowanie RNA, zapewniając bardziej odpowiednie matryce do odpowiedzi na interesujące pytanie biologiczne. Obecny protokół został poddany szeroko zakrojonej optymalizacji. Pozwala na >1000-krotne wzbogacenie nowo transkrybowanego RNA i zapewnia wysoce powtarzalne wyniki.

Projekt eksperymentalny eksperymentu znakowania 4sU ma kluczowe znaczenie, poniew...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Amie Regan za uważne przeczytanie manuskryptu. Praca ta była wspierana przez grant NGFN Plus #01GS0801, grant stypendialny MRC G1002523 oraz grant NHSBT WP11-05 dla L.D. oraz grant DFG FR2938/1-1 dla C.C.F.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-tiourydynaCarbosynthT4509Przygotować 50 mM zapasu w sterylnym H2O, przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w podwielokrotnościach 50-500 μ l, wyrzuć niewykorzystany odczynnik, nie zamrażaj ponownie.
TrizolInvitrogen15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)OSTRZEŻENIE - i NIEBEZPIECZNY DLA ZDROWIA! Zapewnij natychmiastowy dostęp do antidotum fenolowego (PEG-Metanol); Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
ChloroformSigma372978OSTRZEŻENIE - NIEBEZPIECZNE DLA ZDROWIA
IsopropanolSigma650447
Cytrynian sodu, wolny od nukleazSigmaC8532Przygotować 1,6 M roztwór podstawowy, używając wody wolnej od nukleaz.
5M bez nukleaz NaClSigma71386Roztwór podstawowy
Bez nukleaz H2OSigmaW4502Przygotuj 1 ml porcji w probówkach bez nukleaz.
wytrącający RNA1,2 M NaCl, 0,8 M cytrynian sodu w wodzie wolnej od nukleaz. Przygotuj się z wyprzedzeniem w warunkach ściśle wolnych od nukleaz. Przechowywać w temperaturze pokojowej w probówkach Falcon o pojemności 50 ml.
EtanolSigma 459844Stosować z wodą wolną od nukleaz do przygotowania 80% etanolu, przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
1 M wolny od nukleaz Tris Cl, pH 7,5Lonza51237Roztwór podstawowy
500 mM EDTA wolny od nukleaz, pH 8,0Invitrogen15575-020Roztwór podstawowy
10x Bufor biotynylacyjny (BB)100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA w wodzie wolnej od nukleaz, zrobić podwielokrotności 1 ml.
Dimetyloformamid (DMF)SigmaD4551
EZ-Link biotyna-HPDPPierce21341Przygotować 1 mg/ml roztworu podstawowego, rozpuszczając 50 mg biotyny-HPDP w 50 ml DMF. Delikatne ocieplenie wspomaga solubilizację. Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C w podwielokrotnościach 1 ml.
Ciężkie probówki Phase Lock Gel 2,0 mlEppendorf0032 005.152Opcjonalnie do etapu ekstrakcji chloroformem.
Membrana ZetaBIORAD162-0153
10x Bufor100 mM NaOH, 10 mM EDTA
Biotyna-oligo5'-biotyna, 25 nukleotydów, dowolna sekwencja
Dodecylosiarczan soduFisherBPE9738Dla 100 ml 20% roztworu podstawowego dodać 20 g SDS do 80 ml PBS pH 7-8 i dostosować objętość do 100 ml. Utrzymuj wszystkie wysokoprocentowe roztwory SDS powyżej 20 stopni C. Ciepły roztwory nieznacznie powinny wytrącić SDS.
EZ-Link Iodoacetyl-LC-BiotinPierce21333Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml rozpuszczając 50 mg jodoacetylobiotyny w 50 ml DMF. Delikatne ocieplenie wspomaga solubilizację. Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C w podwielokrotnościach 1 ml. Generuje nieodwracalną, specyficzną dla tiolu biotynylację.
Bufor fosforanowysoli fizjologicznej Gibco10010-015
Buforblot Wymieszać 20 ml 20% SDS z 20 ml 1 x PBS pH 7-8 i dodać EDTA do końcowego stężenia 1 mM.
Peroksydaza streptawidyno-chrzanowa Vector LaboratoriesSA5004Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Wymieszać 10 ml 20% SDS z 10 ml 1 x PBS. Dodaj 20 μ l Streptawidyna-HRP przed użyciem.
Odczynnik ECLGE HealthcareRNP2109stosować zgodnie z instrukcjami producenta.
Super RX, X-RA Film, 18x24 cmFujifilm47410 19236
μ Macs Streptavidin KitMiltenyi130-074-101Przechowuj koraliki w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Tween 20SigmaP1379
Bufor100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween 20 w stanie wolnym od nukleaz H2O.
Ditiothreitol (DTT)Sigma43817Przygotować jako 100 mM DTT w wolnym od nukleaz H2O, zawsze przygotowywać świeże przed użyciem.
RNeasy MinElute KitQiagen74204Przechowuj kolumny pod kątem 4 stopni; C, pozostałe elementy zestawu w temperaturze pokojowej.
Probówki polipropylenowe 1,5 ml z gwintemSarstedt72.692.005Kompatybilne z dimetyloformamidem
Probówki polipropylenowe 2,0 ml z gwintemSarstedt72.694.005Kompatybilne z dimetyloformamidem
Probówki 15 mlBD Falcon352096Kompatybilne z dimetyloformamidem
Probówki 50 mlBD Falcon352070Kompatybilne z dimetyloformamidem
Wszystkie roztwory/odczynniki powinny być przechowywane w temperaturze pokojowej, chyba że określono inaczej.
Equipment
Spektrofotometr UV/VISThermo ScientificNanoDrop 1000Lub równoważny. Użyj małej głośności (1-2 μ l) do pomiarów niskich stężeń RNA w celu uniknięcia nadmiernej utraty próbki.
Probówki wirówkowe z polipropylenu 15 mlVWR International525-0153W przeciwieństwie do standardowych probówek o pojemności 15 ml, te tolerują do 15 000 × g
Wirówka szybkoobrotowaBeckman CoulterAvanti J-25Lub równoważny sprzęt o pojemności 13 000× g
Wirnik szybkoobrotowyBeckman CoulterJLA-16250Lub równoważny sprzęt zdolny do osiągnięcia 13 000× g
Adaptery do probówek 15 mlLaborgerä te Beranek356964Lub równoważny sprzęt zdolny do osiągnięcia 13 000× g
Wirówka stołowa z chłodzeniemEppendorf5430 RLub odpowiednik.
ThermomixerEppendorfThermomixer compactLub odpowiednik.
Stojak magnetycznyMiltenyi Biotec130-042-109Jeden stojak mieści 8 μ Kolumny komputerów Mac.
Kąpiel wodnaGrant SUB Aqua 5Lub równoważny.
Bardzo drobna skalaA& DGR-202Lub równoważny.
E-Gel iBase Power SystemInvitrogenG6400UKDo żeli RNA; lub równoważny.
E-Gel EX 1% prefabrykaty agarozoweInvitrogenG4020-01Do żeli RNA; lub równoważne.
Bufor wiążący krople blokujący Dot płuczący

Bibliografia

  1. Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
  2. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  3. Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  4. Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
  5. Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  6. Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
  7. Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115(2009).
  8. Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
  9. Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
  10. Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
  11. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
  12. Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
  13. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  14. Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
  15. Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
  16. Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458(2011).
  17. Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371(2010).
  18. Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
  19. Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908(2012).
  20. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
  21. Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
  22. Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przetwarzanie RNAdegradacja RNAznakowanie 4 tiurydynbiotinylacja specyficzna dla grup tiolowychmagnetyczne kulek streptawidynyoczyszczanie nowo transkrybowanego RNAanaliza Q RT PCRsekwencjonowanie nast pnej generacji
Znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA w celu profilowania ekspresji genów w wysokiej rozdzielczości syntezy, przetwarzania i rozpadu RNA w hodowli komórkowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.