Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Podsumowanie

Opisujemy metody wideomikroskopii żywych komórek fagocytozy Candida albicans za pomocą makrofagów. Metody te umożliwiają specyficzną dla danego etapu analizę migracji, rozpoznawania, pochłaniania i dojrzewania fagosomów oraz ujawniają nowe aspekty fagocytozy.

Streszczenie

Usuwanie patogenów grzybowych i ogólnie mikroorganizmów można uznać za składające się z czterech odrębnych etapów: (i) migracji fagocytów do miejsca, w którym znajdują się patogeny; (ii) rozpoznawanie wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP) za pomocą receptorów rozpoznawania wzorców (PRR); (iii) pochłanianie mikroorganizmów związanych z błoną komórkową fagocytów oraz (iv) przetwarzanie pochłoniętych komórek w dojrzewających fagosomach i trawienie połkniętej cząstki. Badania, które oceniają fagocytozę w całości, mają charakter informacyjny^{1, 2, 3, 4, 5}, ale są ograniczone, ponieważ zwykle nie dzielą procesu na migrację, pochłanianie i dojrzewanie fagosomów, na które może wpływać w różny sposób. Co więcej, takie badania oceniają absorpcję jako pojedyncze zdarzenie, a nie jako ciągły proces dynamiczny. Niedawno opracowaliśmy zaawansowane technologie obrazowania żywych komórek i połączyliśmy je z genetyczną analizą funkcjonalną zarówno komórek patogenu, jak i gospodarza, aby stworzyć interdyscyplinarną platformę do analizy funkcji wrodzonych komórek odpornościowych i patogenezy grzybów. Badania te ujawniły nowe aspekty fagocytozy, które można było zaobserwować tylko przy użyciu systematycznej analizy czasowej interakcji molekularnych i komórkowych między ludzkimi fagocytami a patogenami grzybiczymi i ogólnie mikroorganizmami zakaźnymi. Na przykład, zaczęliśmy definiować następujące elementy: (a) składniki powierzchni komórki wymagane na każdym etapie procesu rozpoznawania, pochłaniania i zabijania komórek grzyba^{1, 6, 7, 8}; b) w jaki sposób geometria powierzchni wpływa na skuteczność wychwytu i zabijania makrofagów przez drożdże i strzępki^{krwi 7}; oraz (c) w jaki sposób pochłanianie prowadzi do zmiany cyklu komórkowego i zachowania makrofagów ^{9, 10}.

W przeciwieństwie do pojedynczych migawek punktu czasowego, mikroskopia wideo żywych komórek umożliwia badanie szerokiej gamy komórek gospodarza i patogenów jako ciągłych sekwencji przez długie okresy czasu, dostarczając przestrzennych i czasowych informacji na temat szerokiego zakresu dynamicznych procesów, w tym migracji komórek, replikacji i transportu pęcherzykowego. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak przygotować komórki gospodarza i grzyba oraz przeprowadzić eksperymenty z mikroskopią wideo. Metody te mogą stanowić przewodnik dla przyszłych badań z innymi fagocytami i mikroorganizmami.

Protokół

1. Wzrost i warunki C. albicans

1. Przygotować płytki agarowe SC-Ura, dodając 6,9 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 1 ml 1 M NaOH, 10 ml 1% (w/v) soli hemisiarczanu adeniny i 20 g agaru technicznego (wcześniej opisanego szczegółowo w ¹¹). Uzupełnić objętość do 900 ml destylowanym autoklawem_H2O, pozostawić agar do ostygnięcia, ale nie na tyle do zestalenia, a następnie dodać 50 ml sterylnej 40% D-glukozy i 50 ml sterylnego 4% dropoutu SC-Ura w warunkach aseptycznych. Wymieszaj, przelej na szalki Petriego i pozostaw płytki agarowe do ostygnięcia i zestalenia. Przechowywać płytki agarowe w temperaturze 5 °C do czasu użycia.
2. Smuga C. albicans serotyp A szczep CAI4+CIp10 z zapasów glicerolu przechowywanych w temperaturze -80 °C na płytce agarowej SC-Ura.
3. Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C do momentu powstania kolonii i przechowywać w temperaturze 5 °C.
4. Wyhodować pojedynczą kolonię C. albicans w 5 ml pożywki SC-Ura (receptura jak w 1.1, ale bez agaru technicznego) i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C, 200 obr./min w celu wytworzenia fazy stacjonarnej C. albicans.

2. Barwienie C. albicans za pomocą izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)

1. Dodać 10 μl C. albicans przez noc do 990 μl PBS (pH 7,4) i przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą hemocytometru.
2. Aby ułatwić wizualizację C. albicans podczas testów fagocytozy, wybarwić 1 ×^{10 8} C. albicans za pomocą 1 mg/ml FITC w 0,05 M buforze węglanowo-wodorowęglanowym (pH 9,6) przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
3. W celu usunięcia niezwiązanego FITC, przemyć C. albicans w 1 ml 1 x PBS, odwirować przy 3 000 × g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml 1 x PBS. Powtórz 3 razy.
4. Zawiesić osad w 1 × 10⁶ komórek/μl w 1 x PBS.

3. Przygotowanie linii komórkowej makrofagów myszy J774.1

1. Utrzymuj makrofagi J774.1 w kolbach do hodowli tkankowych o średnicy 75^cm2 w pożywce DMEM uzupełnionej 10% (v/v) płodowej surowicy cielęcej (FCS), 200 U/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Przygotowanie pierwotnych makrofagów opisano szczegółowo w innym miejscu ^{12, 13}.
2. Zeskrobać komórki J774.1 z kolby do hodowli tkankowej i przenieść do probówki Falcon o pojemności 50 ml. Wirować przy 600 × g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy.
3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml wstępnie podgrzanej, uzupełnionej pożywki DMEM. Policz komórki za pomocą hemocytometru i płytki 1 × 10⁶ makrofagów J774.1 w 2 ml uzupełnionej pożywki DMEM w szklanej naczyniu obrazowym o średnicy 35 mm. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
4. Przed przystąpieniem do obrazowania należy zastąpić uzupełnioną pożywkę DMEM 2 ml wstępnie podgrzanej, uzupełnionej pożywki niezależnej od CO₂ (z 10% (v/v) płodową surowicą cielęcą (FCS), 200 U/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy) zawierającą 1 μM LysoTracker Red DND-99.

4. Test fagocytozy w mikroskopii wideo na żywo

1. Wybór mikroskopu będzie zależał od tego, co jest dostępne lokalnie, ale konfiguracja mikroskopu będzie musiała obejmować odwrócony stolik, komorę środowiskową podgrzaną do 37 °C oraz filtry wzbudzenia/emisji dla wybranych barwników (FITC i TRITC).
2. Włączyć grzałkę mikroskopu przed eksperymentem i odczekać wystarczająco dużo czasu, aby komora kontroli środowiska nagrzała się do 37 °C. Czas potrzebny do ustabilizowania się temperatury w komorze będzie różny w zależności od konfiguracji mikroskopu.
3. Włącz mikroskop i komputer, a następnie załaduj oprogramowanie do obrazowania. Zamontuj czaszę obrazowania na stoliku mikroskopu i dostosuj ostrość, aby znaleźć makrofagi J774.1. Zoptymalizuj wygląd obrazów TRITC i DIC, dostosowując procentowy udział światła przepuszczanego i czasy ekspozycji.
4. Wyjmij naczynie do obrazowania i dodaj do naczynia 3 ×^{10 6} C. albicans barwionych FITC. Zapisz czas, w którym C. albicans jest dodawany do potrawy. Przywróć antenę na scenę i w razie potrzeby zoptymalizuj wygląd obrazów FITC. W razie potrzeby skonfiguruj listę punktów.
5. Rozpocznij obrazowanie, gdy wszystkie punkty są ostre, a kanały są zoptymalizowane. Rejestruj obrazy FITC, TRITC i DIC co minutę przez 6 godzin.

Wyniki

Przedstawiamy tutaj reprezentatywne wyniki pobierania C. albicans przez mysią linię komórkową makrofagów J774.1 podczas 6-godzinnego eksperymentu z wykorzystaniem wideomikroskopii żywych komórek. Rysunek 1 to reprezentatywny film z wideomikroskopii żywych komórek, ukazujący fagocytozę C. albicans przez mysie makrofagi J774.1. Wideomikroskopia żywych komórek umożliwia wizualizację internalizacji C. albicans bez konieczności barwienia zewnętrznych komórek Candida. Jednak w trakcie tych eksperymentów C. albicans barwiono za pomocą wrażliwego na pH barwnika FITC (zielony), który ulega wygaszeniu podczas zakwaszania fagosomu makrofaga, co ułatwia potwierdzenie, że Candida została zinternalizowana (Rysunek 1). Aby dodatkowo wspomóc wizualizację pochłoniętych C. albicans, makrofagi barwiono czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym LysoTracker red DND-99, który barwi przedziały kwaśne i służy jako nieswoisty marker dojrzewania fagosomu. Rysunek 2 to klatka z eksperymentu wideomikroskopii żywych komórek, ilustrująca zmienność w liczbie pochłoniętych C. albicans przez poszczególne makrofagi J774.1. W tym eksperymencie 82% makrofagów J774.1 pochłonęło co najmniej jedną komórkę C. albicans pod koniec 6-godzinnego testu fagocytozy. Na Rysunku 3 przedstawiono liczbę zinternalizowanych komórek C. albicans na makrofag. Średnia liczba pobranych C. albicans na makrofag wynosi 3,4, lecz co ciekawe, makrofagi mogą pochłonąć do 16 komórek grzyba. Rysunek 4 to sekwencja zdjęć z reprezentatywnego eksperymentu wideomikroskopii żywych komórek, pokazująca makrofag fagocytujący komórki C. albicans, wzrost strzępek wewnątrz makrofaga i ostatecznie lizę makrofaga. Rysunek 4 ilustruje, że wideomikroskopia umożliwia analizę zdarzeń następujących po pochłonięciu komórek docelowych, tj. można generować dane dotyczące zabijania makrofagów przez strzępki C. albicans w odniesieniu do liczby i morfogenezy pochłoniętych komórek docelowych oraz badać w czasie rzeczywistym, jak zabijanie makrofagów wiąże się z dojrzewaniem fagosomu.

Rysunek 1. Film z mikroskopii wideo żywych komórek przedstawiający fagocytozę C. albicans przez mysie makrofagi J774.1. Makrofagi zostały zabarwione czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym LysoTracker red DND-99, a C. albicans zostały zabarwione FITC (zielony). Makrofagi i C. albicans były hodowane wspólnie przez okres 6 hr w temperaturze 37 °C w pełnym medium niezależnym od CO₂. Obrazy były rejestrowane w odstępach 1 min przez 6 hr. Widoczne jest nawiązywanie kontaktu międzykomórkowego makrofagów z C. albicans, po czym następuje pochłanianie C. albicans do fagosomów makrofagów. Strzałki wskazują C. albicans przed pochłonięciem przez makrofagi J774.1. Film pokazuje również, że fluorescencja FITC zostaje wygaszona po pochłonięciu C. albicans. Pasek skali, 10 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film.

Rycina 2. Reprezentatywny kadr z wideomikroskopii żywych komórek, pokazujący zróżnicowanie liczby komórek C. albicans pochłoniętych przez poszczególne makrofagi. Makrofagi (barwione LysoTracker red DND-99) były hodowane wspólnie z C. albicans barwionymi FITC (kolor zielony). Widoczne jest zróżnicowanie liczby pochłoniętych komórek C. albicans (liczba przy strzałce wskazuje liczbę pochłoniętych komórek C. albicans) oraz morfologii C. albicans (t.j. forma drożdżakowa versus strzępkowa). Pasek skali, 20 μm.

Rycina 3. Wykres przedstawiający liczbę pochłoniętych komórek C. albicans na jeden mysi makrofag J774.1 po zakończeniu 6-godzinnych testów fagocytozy. Dane reprezentują 2 niezależne eksperymenty. W każdym eksperymencie zliczano łącznie 100 makrofagów z 3 pól widzenia, co dało łącznie 600 pojedynczych makrofagów.

Rycina 4. Seria obrazów z reprezentatywnego eksperymentu z mikroskopii wideo żywych komórek, przedstawiająca makrofag (M) i C. albicans (C) przed rozpoznaniem i w jego trakcie (A, B), a także w trakcie i po wchłonięciu (C, D). Strzępki C. albicans kontynuują wzrost wewnątrz makrofaga (E, F), co może prowadzić do lizy makrofaga (G). Inne makrofagi są rekrutowane do miejsca pęknięcia i próbują pochłonąć uwolnione komórki C. albicans (H). Makrofagi zabarwiono czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym LysoTracker red DND-99, a C. albicans zabarwiono FITC (zielony). Należy zauważyć, że sygnał FITC ulega wygaszeniu po wchłonięciu C. albicans przez makrofagi J774.1 (C). Pasek skali, 10 μm.

Dyskusja

W tym miejscu opisano metodę wykorzystania wideomikroskopii żywych komórek do badania fagocytozy makrofagów. Mikroskopia wideo oferuje wiele dodatkowych warstw informacji do analizy. Jedną z podstawowych zalet jest to, że dane dotyczące absorpcji mogą być generowane (z pojedynczego eksperymentu) dla dowolnego punktu czasowego przez 6-godzinny okres obserwacji. Co ważniejsze, opisana metoda umożliwia analizę różnicową poszczególnych etapów fagocytozy. Wykazaliśmy na przykład, że zmiany w ogólnym wychwytywaniu glikozylacji C . albicans i mutantów morfogenezy przez linie komórkowe makrofagów i pierwotne makrofagi mogą być albo konsekwencją zmian w migracji makrofagów w kierunku komórek docelowych, albo szybkości pochłaniania po nawiązaniu kontaktu komórka-komórka ⁷.

Istnieje wiele pułapek, których należy unikać podczas przeprowadzania tych eksperymentów. Po pierwsze, bardzo ważne jest zapewnienie stabilnych warunków środowiskowych przez cały czas trwania procedury doświadczalnej. Najlepiej osiągnąć to w komorze środowiskowej, która jest ustawiona na warunki eksperymentalne na kilka godzin przed rozpoczęciem eksperymentu. Jakość wideo jest w dużym stopniu zależna od zaawansowanych modułów, które wykorzystują lasery na podczerwień do automatycznego utrzymywania pozycji Z próbki niezależnie od zmian mechanicznych lub termicznych, eliminując w ten sposób potrzebę ręcznej korekty ostrości.

Biorąc pod uwagę rozszerzony charakter eksperymentów, ważne jest, aby ograniczyć ekspozycję na światło laserowe i związane z tym efekty fotowybielania i fotokonwersji, które można zminimalizować poprzez zastosowanie wysoce fluorescencyjnych markerów, które ułatwiają krótkie czasy naświetlania. Opisany tutaj protokół barwienia FITC jest szybki i niezawodny. Ponieważ FITC jest bardzo jasną i stabilną plamą, wymagane są krótkie czasy naświetlania, co sprawia, że FITC idealnie nadaje się do długich filmów poklatkowych. Jednak rutynowo używamy wielu różnych barwników docelowych, w tym barwników Calcofluor White i PKH, a także oznakowanych organizmów.

Większość naszych opublikowanych prac jest przeprowadzana przy użyciu mikroskopu szerokokątnego, ale ekspozycję można jeszcze bardziej zminimalizować, używając mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem, a w naszych rękach jest to niezbędne do poklatkowej mikroskopii wideo 3D.

Podczas tego badania obrazy były rejestrowane w odstępach 1-minutowych w 6-godzinnym teście fagocytozy. Odstęp między obrazami można dostosować w zależności od badanego procesu. Na przykład odstęp ten można skrócić podczas badania szybkich procesów, takich jak transport pęcherzykowy. Minimalny odstęp czasu będzie ograniczony specyfikacją mikroskopu i kamery. Jest kilka kwestii, o których należy pamiętać podczas dostosowywania czasu. Po pierwsze, zmniejszenie odstępu między migawkami oznacza, że można zobrazować mniej punktów, a rozmiar pliku zostanie znacznie zwiększony. Wręcz przeciwnie, zbyt duże zwiększenie interwału między obrazami spowoduje, że film straci ciągłość.

Podejście to można zasadniczo zastosować do badania innych patogenów i wychwytu umierających komórek gospodarza. Na przykład niedawno wykazaliśmy, że makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego od myszy z niedoborem sialoadhezyny wykazują znacznie zmniejszone wiązanie i fagocytozę sjalowanego Campylobacter jejuni ⁸. Jednak rozmiar docelowy jest ważnym wyznacznikiem wykonalności, ponieważ analiza obrazu staje się coraz trudniejsza wraz ze zmniejszeniem rozmiaru komórki docelowej. Zaawansowane oprogramowanie do analizy obrazu jest niezbędne do szybkiej analizy mikroskopii wideo, a to powinno być połączone z odpowiednim wsparciem bioinformatycznym, aby ułatwić generowanie algorytmów do badania migracji pojedynczych komórek i całych populacji komórkowych ⁷. Mikroskopia wideo z żywymi komórkami w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do analizy obrazu do analizy minuta po minucie migracji i interakcji poszczególnych makrofagów z C. albicans zapewnia unikalny wgląd w złożoność fagocytozy C. albicans przez makrofagi. Istnieje ogromny potencjał rozszerzenia tych metod w celu badania innych patogenów i fagocytów (komórek dendrytycznych, neutrofili) oraz opracowania mikroskopii wideo 3D w celu bardziej szczegółowego obrazowania interakcji komórka-komórka lub na bardziej fizjologicznych powierzchniach, takich jak warstwy komórek nabłonka i śródbłonka. Technika ta należy do nowej generacji narzędzi do badania interakcji gospodarz-patogen i pomoże w generowaniu szczegółowych informacji przestrzennych i czasowych na temat szerokiego zakresu procesów dynamicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Drożdżowa baza azotowa bez aminokwasów	Formedium	CYN0402
NaOH	Sigma	S5881-500G
Sól hemisiarczanu adeniny	Sigma	A3159-25G
Agar techniczny (nr 3)	Oxoid	LP0013
D-glukoza	Sigma	G7021-1KG
SC-Ura dropout	Formedium
FITC	Sigma	F7250-1G
Węglan sodu	BDH	301215M
Wodorowęglan sodu	BDH	102475W
PBS	Gibco	18912-014
DMEM	Lonza	BE12-614F
FCS	Life Technologies	10106169
Penicylina/ streptomycyna	PAA	P11-010
L-glutamina	Lonza	BE17-605E
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L7528
Naczynia szklane 35 mm	PAA	PAA12305160X

DSCK102