Pomiar transportu kationów przez Na,K- i H,K-ATPazę w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych

Podsumowanie

Opisujemy metodę ilościowego określania aktywności przeciwtransportujących K⁺ ATPaz typu P poprzez heterologiczną ekspresję enzymów w oocytach Xenopus i mierzenie absorpcji Rb⁺ lub Li⁺ do pojedynczych komórek za pomocą atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej. Metoda ta stanowi czułą i bezpieczną alternatywę dla eksperymentów ze strumieniem radioizotopów, ułatwiając złożone badania kinetyczne

.

Streszczenie

Podczas gdy transport kationów przez elektrogeniczny transporter błonowy Na⁺,K⁺-ATPaza może być mierzony przez elektrofizjologię, elektroneutralnie działająca w żołądku H⁺,K⁺-ATPaza jest trudniejsza do zbadania. Wiele testów transportowych wykorzystuje izotopy promieniotwórcze w celu osiągnięcia wystarczającego stosunku sygnału do szumu, jednak niezbędne środki bezpieczeństwa nakładają surowe ograniczenia dotyczące narażenia ludzi lub projektu testu. Co więcej, na transport jonów przez błony komórkowe krytyczny wpływ ma potencjał błonowy, który nie jest bezpośrednio kontrolowany w hodowli komórkowej lub w preparatach proteoliposomowych. Wykorzystujemy tutaj wyjątkową czułość atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej (AAS) na śladowe ilości pierwiastków chemicznych do pomiaru transportu Rb⁺ lub Li⁺ przez Na⁺,K⁺- lub H⁺,K⁺-ATPazę żołądkową w pojedynczych komórkach. Wykorzystując oocyty Xenopus jako system ekspresji, określamy ilość Rb⁺ (Li⁺) transportowanego do komórek, mierząc próbki homogenatów pojedynczych oocytów w urządzeniu AAS wyposażonym w poprzecznie podgrzewany piec z atomizerem grafitowym (THGA), który jest ładowany z automatycznego podajnika próbek. Ponieważ tło nieswoistego wychwytu Rb⁺ do oocytów kontrolnych lub podczas stosowania inhibitorów specyficznych dla ATPazy jest bardzo małe, możliwe jest wdrożenie złożonych schematów testów kinetycznych obejmujących jednocześnie dużą liczbę warunków eksperymentalnych lub porównanie zdolności transportowej i kinetyki specyficznie zmutowanych transporterów swoistych dla miejsca z dużą precyzją. Ponadto, ponieważ wychwyt kationów jest określany na pojedynczych ogniwach, eksperymenty ze strumieniem można przeprowadzić w połączeniu z dwuelektrodowym zaciskaniem napięcia (TEVC) w celu uzyskania dokładnej kontroli potencjału i prądu membrany. Pozwoliło to m.in. na ilościowe określenie stechiometrii transportu 3Na⁺/2K⁺ ATPazy Na⁺,K⁺-ATPazy i umożliwiło po raz pierwszy zbadanie zależności napięciowej transportu kationów przez elektroobojętnie działającą w żołądku H⁺,K⁺-ATPazę. Zasadniczo test nie ogranicza się do białek błonowych transportujących K⁺, ale może działać równie dobrze w przypadku aktywności transporterów metali ciężkich lub przejściowych lub wychwytu pierwiastków chemicznych w procesach endocytotycznych.

Wprowadzenie

Chcieliśmy opracować czułą, bezpieczną i tanią alternatywę dla eksperymentów z radioaktywnym znacznikiem, aby zbadać specyficzną aktywność transportową jonów translokujących białka błonowe w celu obejścia ograniczeń dotyczących dostępu do laboratoriów izotopowych, wymogów bezpieczeństwa lub stosowania kosztownych radioizotopów, które - jak w przypadku litu - mogą być nawet niedostępne ze względu na bardzo krótkie czasy rozpadu. Byliśmy szczególnie zainteresowani określeniem aktywności działającej elektroneutralnie gazowej H⁺,K⁺-ATPazy, ponieważ enzym ten nie wytwarza prądu, a zatem jego aktywność nie może być kontrolowana metodami elektrofizjologicznymi. Ponieważ transport Na⁺,K⁺- i H⁺,K⁺-ATPazy Rb⁺ jest równie wydajny jak K⁺ (i Li⁺ również), wysoka czułość techniki AAS dla rubidu lub litu powinna ułatwić czułe wykrywanie aktywności transportowej. Spektrofotometry absorpcji atomowej są powszechnymi urządzeniami analitycznymi, które są szeroko rozpowszechnione w laboratoriach chemicznych i powinny być dostępne dla dużej liczby zainteresowanych naukowców. Ponadto chcieliśmy wykorzystać system ekspresji oocytów Xenopus, który wykorzystuje duże pojedyncze komórki (o średnicy około 1,0-1,5 mm), co pozwala osiągnąć niezwykle niską zmienność między komórkami pod względem poziomu ekspresji białka w jednej partii. Proste obliczenia pokazują wykonalność testu AAS: Granica wykrywalności (masa charakterystyczna) dla rubidu techniką THGA-AAS wynosi 10 pg lub 1,2·^10-13 mol (Rb: 85,47 g/mol), dla litu 5,5 pg lub 7,9·^10-13 mol (Li: 6,94 g/mol). Przy heterologicznej ekspresji Na⁺,K⁺-ATPazy w oocytach Xenopus można osiągnąć prądy pompowania 100 nA (co odpowiada około 6,2·1011 ładunków elementarnych na sekundę, czyli 1,03·^10-12 mol ^s-1), co skutkuje transportem 6·^10-6 C ładunku w ciągu 1 minuty. Ponieważ transport jednego ładunku netto odpowiada wychwytowi dwóch jonów Rb⁺ (ze względu na stechiometrię 3Na⁺/2K⁺), prąd 100 nA przez 1 minutę odpowiada poborowi 1,2·^10-10 mol Rb⁺. Tak więc, nawet po 1000-krotnym rozcieńczeniu (homogenizacja oocytu o objętości około 1 μl w 1 ml wody), typowa próbka THGA-AAS (20 μl) zawiera 2,4·^10-12 mol Rb⁺ (lub 204 pg), co jest znacznie powyżej progu wykrywania. W związku z tym nawet transportery o ponad 100-krotnie niższej aktywności transportowej lub ekspresji błony plazmatycznej mogą być testowane za pomocą tej techniki, odpowiednio dostosowując czas strumienia w eksperymencie.

Ponieważ szybkość pompowania jest wrażliwie zależna od temperatury (typowe energie aktywacji dla Na⁺,K⁺-ATPazy są w zakresie od 90 kJ/mol do 130 kJ/mol^1-3, co powoduje około 30% wzrost prędkości obrotu przy zmianie z 20 °C na 22 °C), obowiązkowe jest przeprowadzanie pomiarów strumienia pod precyzyjną kontrolą temperatury (klimatyzacja) z dobrze zbalansowanymi roztworami buforowymi. Ponadto oocyty powinny być starannie dobrane pod kątem jednorodnej wielkości pod kątem ekspresji transportera jonów. Dzięki tym środkom ostrożności możliwe jest rutynowe osiąganie eksperymentalnych błędów standardowych mniejszych niż 10 procent przy około 10 komórkach na warunki eksperymentalne. Za pomocą tej techniki udało nam się określić m.in. pozorne powinowactwo Rb⁺ do transportu kationów^4-6, wpływ zewnątrz- i wewnątrzkomórkowego pH⁷ oraz wpływ mutacji reszt zaangażowanych w koordynację kationów podczas transportu^4,8. Zaletą tej techniki jest to, że strumienie jonów mogą być również wyznaczane w połączeniu z dwuelektrodowym zaciskaniem napięcia oocytów, co z jednej strony zapewnia dokładną kontrolę potencjału błonowego podczas transportu, a z drugiej pozwala skorelować strumień jonów z prądem błonowym. W ten sposób udało się zweryfikować stechiometrię 3Na⁺/2K⁺ ATPazy Na⁺,K⁺ (patrz przykładowe wyniki poniżej) oraz określić zależność napięciową transportu kationów przez żołądkową H⁺/K⁺-ATPazę⁷.

Protokół

1. Konstrukcje cDNA i ekspresja białek w oocytach Xenopus

cDNA interesującego białka błonowego należy sklonować do wektora odpowiedniego do ekspresji w oocytach Xenopus laevis, takiego jak pTLN⁹ lub pcDNA3.1X¹⁰. Takie zoptymalizowane wektory zawierają 5'- i 3'-nieprzetłumaczalne regiony (UTR) genu β-globiny Xenopus laevis flankujące miejsce wielokrotnego klonowania (MCS), sekwencję promotora polimerazy RNA (pTLN: SP6, pcDNA3.1X: T7) zlokalizowaną przed 5' UTR, odcinek poli-A w kierunku 3' od MCS w celu zapewnienia stabilności cRNA w komórkach, a dalej w dół strumienia kolejną sekwencję miejsc cięcia dla endonukleaz restrykcyjnych tnących w jednym miejscu, służącą do linearyzacji plazmidu, aby mógł on pełnić rolę matrycy do transkrypcji cRNA in vitro.

Aby odróżnić aktywność nadekspresowanej ludzkiej pompy Na⁺/K⁺-ATPase (podjednostka α₂+podjednostka β₁) od endogennej Na⁺/K⁺-ATPase w oocytach, wprowadzono mutacje Q116R i N127D w celu uzyskania białka opornego na oubain z wartością IC50 w zakresie milimolarnym¹¹. W przypadku H⁺/K⁺-ATPase pomiary strumieni przeprowadzono z użyciem mutantu S806C podjednostki α H⁺/K⁺-ATPase, ponieważ strumienie Rb⁺ były skorelowane z danymi kinetycznymi z eksperymentów fluorometrii z zaciskaniem napięcia (VCF). Technika VCF (https://www.jove.com/video/2627/ examining-the-conformational-dynamics-of-membrane-proteins-in-situ-with-site-directed-fluo rescence-labeling)¹² opiera się na specyficznym przyłączeniu fluoroforu do strategicznie wprowadzonego reszty cysteiny, co pozwala monitorować zmiany konformacyjne enzymu.

2. Linearyzacja i oczyszczanie matrycy DNA

1. W celu linearyzacji matrycy DNA, poddaj 3 μg plazmidowego DNA w 50 μl objętości reakcyjnej trawieniu z użyciem 5 μl 10-krotnie stężonego buforu odpowiedniego dla enzymu restrykcyjnego oraz 10 U enzymu restrykcyjnego przez 1 hr w temperaturze 37 °C.
2. Oczyść zlinearyzowane DNA za pomocą zestawu High-Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science). Najpierw dodaj 350 μl buforu wiążącego (zawierającego izotiocyjan guanidynium) do probówki z trawionym DNA. Po tym etapie oczyszczania zlinearyzowana matryca DNA jest w stopniu czystości „RNA grade”, ponieważ izotiocyjan guanidynium jest wydajnym denaturatorem białek i niszczy w szczególności RNazę, która jest częstym zanieczyszczeniem w laboratoriach biologii molekularnej.
3. Umieść kolumny wirowe w probówkach zbiorczych, naładuj kolumnę roztworem DNA z kroku 2, odwiruj przy 13,000 x g przez 30 sec i odlej filtrat.
4. Dodaj do kolumny 500 μl buforu płuczącego. Odwiruj przez 1 min przy 13,000 x g i odlej filtrat.
5. Dodaj do kolumny 200 μl buforu płuczącego. Odwiruj przez 1 min przy 13,000 x g, aby całkowicie osuszyć kolumnę.
6. Przenieś kolumnę wirową do nowej probówki Eppendorf 1,5 ml i dodaj do kolumny 50 μl wody wolnej od nukleaz (Ambion Product # AM9937). Eluuj poprzez wirowanie przez 1 min z maksymalną prędkością.
7. Po elucji zagęść roztwór zawierający DNA do objętości około 15 μl. Krok ten zapewnia, że roztwór zawiera 0,5 μg zlinearyzowanego DNA w 3 μl, co jest zalecanym stężeniem dla następnej reakcji transkrypcji cRNA in vitro.

3. Synteza cRNA in vitro

1. Wybierz odpowiedni zestaw mMessage mMachine Kit (Ambion Product #1340, #1344) zgodnie z sekwencją promotora na plazmidzie (SP6, T7). Do całkowitej objętości reakcji 10 μl dodaj 3 μl zlinearyzowanego DNA z poprzedniego kroku oraz 1 μl buforu do transkrypcji do wcześniej odmierzonej porcji 5 μl mieszaniny NTP-cap. Wstępne rozdzielenie mieszaniny NTP-cap na porcje jest konieczne, aby uniknąć częstych cykli zamrażania i rozmrażania, które mogą prowadzić do degradacji nukleozydotrifosforanów. Na koniec dodaj 1 μl odpowiedniej polimerazy RNA, krótko wymieszaj i odwiruj mieszaninę reakcyjną.
2. Inkubuj mieszaninę reakcyjną przez 1 do 2 h w temperaturze 37 °C. Czas inkubacji nie powinien przekraczać 2 h, ponieważ może to prowadzić do obniżenia wydajności lub jakości cRNA.
3. Dodaj 15 μl lodowatego 3 M roztworu LiCl z zestawu, 15 μl zimnej wody wolnej od nukleaz, krótko wymieszaj (nie używaj vortexa), krótko odwiruj próbkę przy 11,000 x g przez 10 s i przechowuj w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 min, aby umożliwić wytrącenie cRNA.
4. Wstępnie schłodź wirówkę do 4 °C i po wytrąceniu wiruj przez co najmniej 15 min przy 13,000 x g.
5. Ostrożnie i całkowicie usuń supernatant z jasnobrązowego osadu na dnie probówki i dodaj 150 μl 70% etanolu klasy RNA schłodzonego do -20 °C. Wiruj w temperaturze 4 °C przez 5 min przy 13,000 x g.
6. Całkowicie usuń supernatant, krótko (1-2 min) wysusz pozostały osad cRNA w ewaporatorze odśrodkowym (np. Eppendorf Concentrator model 5301) w temperaturze pokojowej.
7. Rozpuść osad w 12 μl zimnej wody wolnej od nukleaz. UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy przeprowadzać z próbką cRNA przechowywaną na lodzie.
8. Wyznacz stężenie cRNA za pomocą spektrofotometru (np. Eppendorf BioPhotometer).
9. Sprawdź integralność cRNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. UWAGA: Ta weryfikacja jest konieczna, ponieważ nawet częściowo zdegradowane RNA daje niezerową absorpcję UV. Do elektroforezy cRNA użyj dokładnie wyczyszczonej komory elektroforetycznej nowo napełnionej buforem TAE oraz świeżo przygotowanego 1% żelu agarozowego. Jeśli podejrzewasz zanieczyszczenie komory elektroforetycznej lub buforu RNazami, napełnij komorę 0,1 M HCl na 1 h w celu oczyszczenia i przygotuj bufor TAE z wody wolnej od nukleaz.
10. Przechowuj cRNA w temperaturze -20 °C do momentu użycia. cRNA może być przechowywane przez co najmniej rok w temperaturze -20 °C.

4. Pozyskiwanie materiału jajnika od samic Xenopus laevis poprzez częściową ovariektomię

Protokół ten został zatwierdzony przez właściwy organ państwowy (Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin, Senat Berlina, Niemcy).

1. Nie karmić żaby przez co najmniej 12 hr przed operacją, aby zapobiec wymiotom.
2. Przygotować roztwór 2 g miejscowego środka znieczulającego trikainy (MS-222) rozpuszczonej w 1 L wody z pH dostosowanym do 7.0 za pomocą 5 mM buforu HEPES. OSTROŻNIE: Podczas pracy z MS-222 przez cały czas należy nosić rękawice nitrylowe, a roztwór przygotowywać w dygestorium chemicznym.
3. Zanurzyć żabę w roztworze trikainy (maks. 10 min), aż zwierzę przestanie wykazywać odruchy prostowania. Aby sprawdzić brak reakcji, należy spróbować odwrócić żabę na grzbiet w dłoniach i obserwować, czy nie występują ruchy obronne.
4. Wyjąć żabę z roztworu trikainy ręcznie i opłukać zwierzę zimną wodą z kranu, aby usunąć środek znieczulający.
5. Położyć żabę grzbietem do góry na warstwie lodu przykrytej mokrym ręcznikiem papierowym, aby uniknąć uszkodzenia skóry żaby w wyniku bezpośredniego kontaktu z lodem. Przez cały czas trwania operacji skórę zwierzęcia należy utrzymywać w stanie wilgotnym, aby zapobiec wysychaniu. Umieszczenie na lodzie przedłuża czas znieczulenia.
6. Za pomocą ostrych nożyczek wykonać niewielkie nacięcie brzuszne (długość 8-10 mm) po lewej lub prawej stronie linii środkowej żaby. OSTROŻNIE: Należy uważać, aby nie uszkodzić linii bocznej. Kolejne operacje powinny być wykonywane naprzemiennie po obu stronach, aby umożliwić dobrą regenerację tkanki jajnika. Zazwyczaj należy przebić trzy warstwy tkanki (skórę zewnętrzną, cienką warstwę białej tkanki łącznej – powięź – oraz warstwę mięśniową).
7. Po otwarciu jamy brzusznej chwycić fragmenty płatów jajnika pęsetą tępą i delikatnie wyciągnąć na zewnątrz. Jako wytyczną przyjmuje się usunięcie poprzez nacięcie około 3-5 cm materiału jajnikowego. W przypadku uszkodzenia małych naczyń krwionośnych i wystąpienia krwawienia, należy zastosować ucisk za pomocą sterylnego plastikowego pręta lub schłodzić miejsce urazu lodem, aż krwawienie ustanie.
8. Zamknąć nacięcie chirurgicznie, stosując szew przerywany nicią 4.0 Ethicon Vicryl (Johnson & Johnson #V633H). Do szycia należy używać instrumentów chirurgicznych i zawiązać dwa lub trzy węzły oddzielnie wzdłuż nacięcia. OSTROŻNIE: Ważne jest, aby każdy węzeł zszywał trzy warstwy tkanki w jednym kroku.
9. Po operacji umieścić żabę w lekko nachylonej misce z wodą (30 L), zawierającej tyle wody, by zakryła dno, tak aby nozdrza zwierzęcia znajdowały się powyżej poziomu wody w celu umożliwienia oddychania. Podczas okresu budzenia (około 1-2 hr) przykryć zwierzę mokrym ręcznikiem papierowym, aby uniknąć wysychania wrażliwej skóry.
10. Gdy zwierzę odzyska aktywność, napełnić miskę z wodą i trzymać żabę oddzielnie od innych zwierząt przez 3-4 dni w celu monitorowania rekonwalescencji i gojenia rany.
11. Po operacji zachować odstęp od kolejnych zabiegów przez co najmniej 3 miesiące, aby umożliwić pełną regenerację zwierzęcia i jego tkanki jajnikowej. Jako wytyczną przyjmuje się, że na każdej żabie można przeprowadzić maksymalnie 6-8 operacji.

5. Enzymatyczna izolacja pojedynczych oocytów

1. Pokrój materiał jajnikowy nożyczkami na mniejsze kawałki i przenieś tkankę do roztworu Ringera dla oocytów bez Ca²⁺ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, pH 7.4) zawierającego kolagenazę (20 mg/ml, typ 1A z Clostridium hystolyticum, Sigma #C9891) oraz inhibitor trypsyny (10 mg/ml, Typ III-O z białka jaja kurzego, Sigma #T2011).
2. Delikatnie wstrząsaj roztworem trawiącym przez 2,5 hr w temperaturze 18 °C. Następnie monitoruj postęp trawienia w odstępach 15 min, aż większość oocytów zostanie oddzielona od tkanki pęcherzykowej.
3. Przemyj oocyty kilkukrotnie w probówce Falcon 50 ml roztworem Ringera dla oocytów bez Ca²⁺, aż roztwór zostanie dostatecznie oczyszczony z resztek tkankowych.
4. Przechowuj oocyty w roztworze Ringera dla oocytów zawierającym Ca²⁺ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES, pH 7.4) z dodatkiem gentamycyny (50 μg/ml) w temperaturze 18 °C.

6. Iniekcja cRNA

1. W celu ekspresji Na⁺,K⁺- lub H⁺,K⁺-ATPase, wstrzyknąć do oocytów 50 nl roztworu cRNA zawierającego 25 ng cRNA podjednostki α i 5 ng cRNA podjednostki β, używając elektrycznej pompy wtryskowej Nanoject II (Drummond Scientific Inc.) z kapilarami hematokrytowymi 3,5" (Drummond #3 000-203-G/X). UWAGA: Ilość mRNA może się różnić w zależności od docelowego białka i może wymagać dostosowania w celu uzyskania maksymalnej ekspresji, potwierdzonej metodą Western blotting.
2. Dla każdego warunku przepływu (np. przy określonym stężeniu Rb⁺) wstrzyknąć roztwór do 18–22 oocytów. Z tej liczby 50% zostanie poddanych analizie w warunkach „+flux” (np. przy określonym stężeniu Rb⁺), a 50% w warunkach „-flux” (np. przy wybranym stężeniu Rb⁺ i zastosowaniu specyficznego inhibitora enzymu w stężeniu nasycającym, np. 10 mM ouabain dla Na⁺,K⁺-ATPase lub 10 μM SCH28080 przy pH 5,5 dla H⁺,K⁺-ATPase)).
3. Po wtrysku przenieść oocyty oddzielnie do płytek 96-dołkowych wypełnionych do połowy roztworem Ringera dla oocytów zawierającym Ca²⁺ oraz 50 μg/ml gentamycyny w temperaturze 18 °C.
4. Przykryć płytkę 96-dołkową Parafilmem, aby zapobiec nadmiernemu odparowaniu.
5. Inkubować oocyty przez 2–7 dni (w zależności od analizowanego białka) w temperaturze 18 °C. Jeśli wymagane jest przechowywanie oocytów przez więcej niż 3 dni, zaleca się wymianę buforu inkubacyjnego w mikrodobkach co 3 dni.
6. Dla każdego zestawu danych o przepływie (np. eksperyment miareczkowania [Rb⁺]) należy poddać analizie około 10 oocytów kontrolnych, niewstrzykniętych (lub wstrzykniętych 50 nl wody wolnej od nukleaz), w warunkach „+flux” i „-flux”. W związku z tym należy inkubować odpowiednią liczbę komórek kontrolnych w ten sam sposób, co oocyty wstrzyknięte cRNA, przed analizą przepływu.

Obróbka wstępna oocytów wykazujących heterologiczną ekspresję ATPase

Procedura ładowania Na⁺

W celu przeprowadzenia pomiarów funkcjonalnych pompy Na⁺/K⁺-ATPase, istotne jest zwiększenie wewnątrzkomórkowego stężenia Na⁺¹³, w następujący sposób:

1. Przenieś oocyty do buforu do ładowania Na⁺ (110 mM NaCl, 2.5 mM cytrynianu Na, 2.5 mM MOPS, 2.5 mM TRIS, pH 7.4) na 45 min w lodzie.
2. W celu późniejszej regeneracji inkubuj oocyty w buforze po ładowaniu „PLB” (100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 5 mM BaCl₂, 5 mM NiCl₂ oraz 2.5 mM MOPS, 2.5 mM TRIS, pH 7.4) przez co najmniej 30 min w lodzie.
3. Przechowuj oocyty w PLB w lodzie do momentu użycia.

7. Wstępne blokowanie endogennej pompy Na⁺,K⁺-ATPase

UWAGA: Ponieważ oocyty Xenopus wykazują endogenną ekspresję pompy Na⁺,K⁺-ATPase, ważne jest zablokowanie tej endogennej pompy przed eksperymentami dotyczącymi przepływu Rb⁺, w następujący sposób:

1. Następnie należy zablokować endogenną Na⁺,K⁺-ATPase poprzez inkubację oocytów w buforze poladowym (Post Loading Buffer) zawierającym 100 μM ouabainy przez 15 min w temperaturze pokojowej.

8. Elektrofizjologia

1. Przygotować mikroelektrody poprzez wyciąganie kapilar borokrzemianowych (GB150F-8P, Science Products GmbH) przy użyciu dwustopniowego wyciągacza mikropipet (Model PC-10, Narishige).
2. Wypełnić szklane elektrody od tyłu 3 M KCl. Dla eksperymentów TEVC z H⁺,K⁺-ATPase zaleca się zastosowanie zamiast tego 3M NaCl, co pozwoliło na uzyskanie stabilniejszych zapisów prądu. Zamocować pipetę na drucie Ag/AgCl uchwytów mikroelektrod w układzie dwuelektrodowej blokady napięcia (two-electrode voltage-clamp).
3. Wprowadzić szklane mikroelektrody oraz dwa mostki agarowe (powinny być one wykonane z NaCl/agar zamiast powszechnie stosowanego KCl/agar), które łączą elektrody referencyjne Ag/AgCl z roztworem w kąpieli, do komory pomiarowej (Warner Instr., model RC-10) uprzednio napełnionej buforem pomiarowym (np. PLB z 10 μM ouabainy dla Na⁺,K⁺-ATPase).
4. Przełączyć wzmacniacz blokady napięcia (Turbo TEC-10CX, NPI Electronics, Tamm, Niemcy) w tryb „OFF”.
5. Sprawdzić oporność każdej szklanej elektrody osobno (obie powinny mieścić się w zakresie 0,5-2 MΩ).
6. Sprawdzić potencjały przesunięcia (offset) elektrody napięciowej i prądowej na odpowiednim wyświetlaczu wzmacniacza TEVC. W przypadku odchylenia od zera wyregulować przesunięcie za pomocą odpowiednich regulatorów offsetu we wzmacniaczu.
7. Umieścić oocyt na środku komory i delikatnie przebić błonę elektrodą prądową oraz napięciową.
8. Sprawdzić odczyt potencjału we wzmacniaczu. Odczyt potencjału elektrody napięciowej wskazuje teraz wartość potencjału spoczynkowego komórki.
9. Przełączyć wzmacniacz w tryb VC (voltage-clamp).
10. Za pomocą oprogramowania pCLAMP (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) zablokować komórkę na zdefiniowanym potencjale błony. Może to być wartość wcześniej zmierzonego potencjału spoczynkowego (dla zapisu w warunkach zerowego prądu błonowego) lub jakakolwiek pożądana wartość potencjału testowego. Zwrócić uwagę na amplitudę i stabilność prądu przecieku (wobec braku K⁺/Rb⁺/Li⁺), który – zgodnie z ogólną wytyczną – nie powinien przekraczać -200 nA przy -30 mV.
11. Perfundować oocyt przez określony czas (np. 3 min dla Na⁺,K⁺-ATPase) roztworem zawierającym Rb⁺ (aby uzyskać maksymalny prąd należy użyć stężeń nasycających uzyskanych z pomiarów strumienia w warunkach bez blokady napięcia) i rejestrować prąd pompy za pomocą oprogramowania pCLAMP w trybie ciągłego zapisu. Upewnić się, że pobieranie Rb⁺ zostało następnie całkowicie zatrzymane poprzez perfuzję komórki roztworem wolnym od Rb⁺ przez 30 s.
    1. Zakończyć eksperyment dwuelektrodowej blokady napięcia, wyjąć oocyt z komory pomiarowej i przejść do kroku 4 płukania w akapicie „Rb⁺ uptake experiments”, aby przeanalizować pobieranie Rb⁺ za pomocą spektrofotometrii absorpcyjnej z atomizacją.
12. Wykonać odjęcie prądu przesunięcia i obliczyć całkę czasową prądu pompy za pomocą programu Clampfit z pakietu pCLAMP.

9. Pomiary poboru Rb⁺

1. Odetnij i stop końcówkę żółtej pipety 200 μl do średnicy około 2 mm. Stosowanie takich końcówek zapewnia minimalny przeniesienie roztworu podczas przenoszenia oocytów między naczyniami inkubacyjnymi lub płuczkami. Krótko stop końcówkę płomieniem zapalniczki. Ten etap polerowania zapobiega uszkodzeniu oocytów.
2. Dla każdego oocytu przeznaczonego do pomiaru przygotuj probówkę Eppendorf o pojemności 1,5 ml wypełnioną 1 ml wody Millipore. Przygotuj trzy szalki Petriego z buforem płuczącym wolnym od Rb⁺ (np. PLB) oraz jedną szalkę z wodą Millipore.
3. Przenieś jednocześnie pięć preinkubowanych oocytów do szalki Petriego o średnicy 3,5 cm wypełnionej buforem do pomiaru strumienia Rb⁺ (stężenia Rb⁺ od 0 do 15 mM) i inkubuj przez 3 min (Na⁺,K⁺-ATPase) lub 15 min (H⁺,K⁺-ATPase) w kontrolowanej temperaturze (np. 21 °C w klimatyzowanym pomieszczeniu lub na płycie grzejnej).
4. Przenieś jednocześnie oocyty do pierwszej szalki z buforem płuczącym wolnym od Rb⁺ (w przypadku Na⁺,K⁺-ATPase można użyć PLB). Niezbędne jest zachowanie różnic między czasami inkubacji poniżej 5 s. Delikatnie wypłucz.
5. Przenieś oocyty do drugiej i trzeciej szalki z buforem płuczącym wolnym od Rb⁺, delikatnie wypłucz.
6. Przenieś oocyty do szalki z wodą Millipore, delikatnie wypłucz.
7. Przenieś każdy oocyt pojedynczo do jednej z przygotowanych probówek Eppendorf wypełnionych 1 ml wody Millipore.
8. Zhomogenizuj oocyt, pipetując roztwór w górę i w dół końcówką pipety 200 μl, aż do uzyskania jednorodnej zmętnienia roztworu.

10. Przygotowanie analizatora AAnalyst 800 z wykorzystaniem systemu pieca THGA

1. Otwórz zawór odpowiedniego gazu obojętnego (argon) i włóż odpowiednią lampę katodową z wydrążoną katodą (pojedyncze lampy HCL dla Li⁺ lub Rb⁺; Photron, Melbourne, Australia) w dowolne gniazdo.
2. Uruchom oprogramowanie sterujące WinLab32 (Perkin Elmer) i włącz odpowiednią lampę katodową. Lampy katodowe Perkin Elmer Lumina są rozpoznawane automatycznie i pojawiają się na liście wyboru. Niekompatybilne lampy katodowe muszą zostać wprowadzone ręcznie.
3. Odczekaj około 10-15 min w celu rozgrzania i stabilizacji lamp.
4. Przez inspekcję wizualną upewnij się, że probówka THGA (transversely-heated graphite atomizer tube, Perkin Elmer, #B3000641) jest w dobrym stanie. Piece THGA powinny być wymieniane co 300 pomiarów (średni czas eksploatacji podany przez producenta), jednak mogą wytrzymać analizę większej liczby próbek.
5. W programie WinLab32 wybierz technikę „THGA furnace”.
6. Przygotuj co najmniej pięć próbek kalibracyjnych z koncentracjami Rb⁺/Li⁺ w zakresie od 10 do 50 μg/L (np. poprzez odpowiednie rozcieńczenie z 1 M roztworu RbCl lub LiCl) oraz jedną próbę ślepą zawierającą wyłącznie wodę Millipore. Uwaga: Sole powinny mieć najwyższą dostępną czystość („puriss.” lub z dostępnych komercyjnie wzorców kalibracyjnych do AAS).
7. Wybierz odpowiedni plik inicjalizacyjny (tzw. plik „metody”, który zawiera odniesienia do parametrów kalibracji i ładuje ustawienia instrumentu, np. długość fali detekcji AAS; dla Rb⁺ i Li⁺ są to odpowiednio 780 nm i 670,8 nm), a następnie wprowadź pozycje i stężenia próbek kalibracyjnych. W tym celu wybierz odpowiedni autosampler (tacka na próbki z 88 lub 148 pozycjami dla urządzenia AAnalyst 800).
8. Zmierz krzywą kalibracyjną.
9. Przenieś każdy homogenat oocytów do oddzielnych polipropylenowych naczyń na próbki o pojemności 1,2 ml (Perkin Elmer, #B0510397) i umieść te probówki w tacy autosamplera.
10. Utwórz plik informacji o próbkach, aby zidentyfikować próbki w pozycjach autosamplera, następnie ustaw objętość próbki na 20 μl i uruchom urządzenie.
11. Po zakończeniu serii pomiarów (lub podczas kontroli wizualnej co godzinę przy długich seriach próbek) sprawdź, czy w którychkolwiek próbkach zmierzona ilość Rb⁺ przekracza maksimum krzywej kalibracyjnej. W takim przypadku odpowiednio rozcieńcz dane próbki i zmierz je ponownie.

11. Uwagi dotyczące pomiaru dużych liczb próbek (powyżej 50)

• W przypadku pracy urządzenia przez całą noc zaleca się napełnienie zbiornika autosamplera wodą Millipore, aby zapobiec odparowywaniu homogenatów w probówkach.
• Zaleca się umieszczenie probówki z 2% HNO₃ co 20 próbek, aby zapobiec zapychaniu się kapilary wtryskowej autosamplera.

Zalecany protokół temperatury THGA-AAS dla rubidu

Krok	Temperatura (°C)	Czas narastania (s)	Czas utrzymania (s)	Przepływ argonu (ml/min)
Suszenie 1	110	1	20	250
Suszenie 2	130	5	30	250
Piroliza	300-600	10	20	250
Atomizacja	1700-1800	0	5	0
Oczyszczanie	2400	1	2	250

Zalecany protokół temperatury THGA-AAS dla litu

Krok	Temperatura (°C)	Czas narastania (s)	Czas podtrzymania (s)	Przepływ gazu argonowego (ml/min)
Suszenie 1	110	1	30	250
Suszenie 2	130	15	30	250
Piroliza	900	10	20	250
Atomizacja	2200	0	5	0
Oczyszczanie	2450	1	3	250

Analiza danych

1. Dla każdego warunku pomiarowego oblicz średnie pobieranie Rb⁺. Spektrofotometr AAS podaje wartości w μg/L, które należy przeliczyć na pmol/oocyte/min.
2. W analizach kinetycznych (pozorne wartości KM) odejmij tło pobierania Rb⁺ wyznaczone z nieiniekcyjnych oocytów kontrolnych z tej samej partii przy danym stężeniu RbCl.
3. Wykreśl dane w programie Origin, stosując dopasowanie funkcji Hilla lub funkcji Michaelisa-Menten do danych. W równaniach tych [S] oznacza stężenie substratu, nH współczynnik Hilla, a K_0.5 stężenie substratu niezbędne do uzyskania połowy maksymalnej aktywacji.

Wyniki

Ilościowe oznaczenie pobierania Rb⁺ przez ATPazy typu P z przeciwtransportem K⁺ (lub Rb⁺) za pomocą AAS w systemie ekspresyjnym w oocytach Xenopus pozwala na wiarygodne wyznaczenie parametrów kinetycznych enzymu.

Wyznaczenie stechiometrii transportu pompy Na⁺/K⁺-ATPase

W przypadku elektrogennej Na⁺/K⁺-ATPase przepływy Rb⁺ można oznaczać w eksperymentach z wykorzystaniem met...

Dyskusja

Opisana metoda pomiaru ilości Rb⁺ (lub Li⁺) pobranych do poszczególnych oocytów Xenopus wykazujących ekspresję Na⁺,K⁺- lub H⁺,K⁺-ATPazy okazała się wszechstronną, elastyczną i dokładną techniką określania kinetycznych lub termodynamicznych parametrów transportu dla przeciwtransportujących kationy ATPaz typu P^1,4,5,7,8. Jest to bezpieczna i niezawodna alternatywa dla testów strumienia znaczników promieniotwórczych i pozwala odpowiedzieć ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4.0 Materiał szwowy Ethicon Vicryl	Johnson Johnson	V633H
Kolagenaza typu 1A od Clostridium hystolyticum	Sigma	Aldrich C9891
Zestaw do oczyszczania produktu PCR o wysokiej czystości Roche	Applied Science	11732676001
Woda wolna od nukleaz	Ambion	AM9937
mMessage mMachine Kit SP6/ T7	Ambion	1340, 1344
Oktahydrat Ouabainy	Sigma Aldrich	O3125
Trikaina (sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu)	Sigma Aldrich	A5040
Inhibitor trypsyny typu III-O z białka jaja kurzego	Sigma Aldrich	T2011
SCH28080	Sigma Aldrich	S4443
AAnalyst 800	Perkin Elmer	0993-5256
WinLab32TM Perkin	Elmer
BioPhotometer	Eppendorf	6131 000.012
Kapilary borokrzemianowe	Produkty naukowe	GB150F-8P
Rurki hematokrytowe 3,5 "	Drummond Scientific	3 000-203-G / X
Lampa z pustą katodą Lit	Photron	P929LL
Lampa z pustą katodą Rubidium	Photron	P945
Ściągacz do mikropipet	Narishige	Model PC-10
Komora do zapisu oocytów RC-10	Warner Instr.	W4 64-0306
Pompa wtryskowa Nanoject II	Drummond Scientific	3-000-204
Oprogramowanie pCLAMP	Urządzenia
Polipropylenowy kubek na próbkę (1,2 ml)	Perkin Elmer	B0510397
Speedvac - Koncentrator model 5301	Eppendorf	5301 000.210
Rurka THGA	Perkin Elmer	B3000641
Wzmacniacz Turbo TEC-10CX	NPI Electronics	TEC-10CX

molekularne