Błony ER związane z mitochondriami (MAM) i mikrodomeny wzbogacone w glikosfingolipidy (GEM): izolacja od mózgu myszy

Ida Annunziata; Annette Patterson; Alessandra d'Azzo

doi:10.3791/50215

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Błony ER związane z mitochondriami (MAM) i mikrodomeny wzbogacone w glikosfingolipidy (GEM): izolacja od mózgu myszy

23.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50215

⸱

4 marca 2013

Ida Annunziata^*¹ , Annette Patterson^*¹ , Alessandra d'Azzo¹

¹Department of Genetics, St Jude Children's Research Hospital

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ta procedura ilustruje, jak wyizolować z mózgu dorosłej myszy błony ER związane z mitochondriami lub MAM oraz frakcje mikrodomen wzbogacone glikosfingolipidami z MAM i preparatów mitochondrialnych.

Streszczenie

Wewnątrzkomórkowe organelle to wysoce dynamiczne struktury o różnym kształcie i składzie, które są poddawane specyficznym dla komórki sygnałom wewnętrznym i zewnętrznym. Ich błony są często zestawione w określonych miejscach kontaktu, które stają się węzłami wymiany cząsteczek sygnałowych i składników błony^1,2,3,4. Mikrodomeny błony międzyorganellarnej, które powstają między retikulum endoplazmatycznym (ER) a mitochondriami przy otwarciu wrażliwego na IP3 kanału Ca^{2 +}, są znane jako błony ER związane z mitochondriami lub MAM^4,5,6. Skład białkowo-lipidowy i właściwości biochemiczne tych miejsc kontaktu z błoną zostały szeroko zbadane, szczególnie w odniesieniu do ich roli w regulacji wewnątrzkomórkowego Ca^{2 +} ^4,5,6. ER służy jako główny magazyn wewnątrzkomórkowego Ca^{2 +} i w tym charakterze reguluje niezliczone procesy komórkowe poniżej sygnalizacji Ca^{2 +}, w tym potranslacyjne fałdowanie białek i dojrzewanie białek7. Z drugiej strony mitochondria utrzymują homeostazę^Ca2+, buforując stężenie Ca²⁺ w cytozolu, zapobiegając w ten sposób inicjacji szlaków apoptotycznych poniżej nierównowagi Ca²⁺ ^4,8. Dynamiczna natura MAM sprawia, że są one idealnymi miejscami do analizy podstawowych mechanizmów komórkowych, w tym sygnalizacji Ca^{2 +} i regulacji stężenia mitochondrialnego Ca^{2 +}, biosyntezy i transportu lipidów, metabolizmu energetycznego i przeżycia komórek ^4,9,10,11,12. Opisano kilka protokołów oczyszczania tych mikrodomen z tkanki wątroby i hodowanych komórek^13,14.

Biorąc pod uwagę wcześniej opublikowane metody, dostosowaliśmy protokół izolacji mitochondriów i MAM od mózgu dorosłej myszy. Do tej procedury dodaliśmy dodatkowy etap oczyszczania, a mianowicie ekstrakcję Triton X100, która umożliwia wyizolowanie frakcji mikrodomen wzbogaconych glikosfingolipidami (GEM) w MAM. Te preparaty GEM mają kilka wspólnych składników białkowych z kaweolami i tratwami lipidowymi, pochodzącymi z błony plazmatycznej lub innych błon wewnątrzkomórkowych, i proponuje się, aby działały jako punkty gromadzenia się białek receptorowych i interakcji białko-białko^4,15.

Protokół

Następujący protokół jest przeznaczony do izolacji i oczyszczania MAM i GEM-ów z mózgu myszy.

Rozwiązania wymagane do izolacji mitochondriów, MAM i GEM.

Frakcjonowanie w celu uzyskania surowego preparatu mitochondrialnego:

Roztwór A: 0,32 M Sacharozy, 1 mM NaHCO₃, 1 mM MgCl₂, 0,5 mM CaCl₂ + inhibitory proteazy (dodać świeże, w razie potrzeby).

Roztwór B: 0,32 M Sacharozy, 1 mM NaHCO₃ + inhibitory proteazy (dodać świeże, w razie potrzeby).

Izolacja MAM:

Medium izolacyjne: 250 mM Mannitol, 5 mM HEPES pH 7.4, 0.5 mM EGTA, 0.1% BSA.

Bufor gradientowy: 225 mM Mannitol, 25 mM HEPES pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (stężenie końcowe).

Izolacja GEMs:

Bufor do ekstrakcji GEM: 25 mM HEPES pH 7.5, 0.15 M NaCl, 1% Triton X-100 + inhibitory proteazy (dodać świeże, w razie potrzeby).

GEM Bufor solubilizujący: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM EDTA, 1% SDS + inhibitory proteazy (dodać świeże, w razie potrzeby).

1. Pierwszy etap frakcjonowania subkomórkowego: usuwanie jąder, niezlizowanych komórek i resztek komórkowych

Poddaj mysz eutanazji w komorze CO₂.
Natychmiast wyjąć mózg, przekroić na pół, umieścić w probówkach o pojemności 2 ml na lodzie i zważyć.

Uwaga: Utrzymuj połówki mózgu oddzielnie przez cały czas trwania procedury. Poniższe zasady dotyczą leczenia pojedynczej połówki mózgu.

Umieść pół mózgu we wstępnie schłodzonym szklanym młynku do tkanek o pojemności 2 ml zawierającym 1 ml zimnego roztworu A. Homogenizuj za pomocą łącznie 15 pociągnięć dużym tłuczkiem do prześwitu.
Przenieść do 15 ml probówki Falcon na lodzie i rozcieńczyć homogenaty do 10 objętości w/v, np. 0,225 g do 2,25 ml.
Odwirować próbkę o masie 1 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
Ostrożnie usunąć supernatant i przenieść na lód do 30 ml okrągłej szklanej probówki wirówkowej. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu.
Zawiesić osad w tych samych 10 objętościach roztworu A. Homogenizować w tym samym młynku, wykonując 3-6 pociągnięć małym tłuczkiem do prześwitu, po 1 ml na raz.
Przenieść do świeżej probówki sokoła o pojemności 15 ml i odwirowywać przy stężeniu 710 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. W ten sposób powstaje osad jąder i szczątków komórkowych.
Ostrożnie usunąć supernatant i połączyć go z supernatantem zapisanym w kroku 1.6.

2. Drugi krok: Surowa izolacja mitochondriów

Odwirować supernatanty przy 13 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
Przenieść supernatant do ultra-przezroczystej probówki wirówkowej Beckmana, na lodzie
Zawiesić osad w 10 tomach Roztwór A. Homogenizować w tym samym młynku, wykonując 3-6 pociągnięć małym tłuczkiem do prześwitu, po 1 ml na raz.
Odwirować jako krok 2.1.
Powtórz kroki 2.2-2.4.
Powstały osad jest wzbogaconą frakcją mitochondrialną. Zebrać supernatanty (cytozol i ER), przykryć parafilmem i trzymać na lodzie.
Zawiesić osad za pomocą 6 pociągnięć małym tłuczkiem do prześwitywania w 4,8 ml/g (g odnosi się do pierwotnej masy mózgu) roztworu B, w świeżym homogenizatorze.
Używając szklanych pipet Pasteura, przygotuj nieciągły gradient sacharozy w ultra-przezroczystej probówce wirówkowej Beckmana, dodając następnie na dno probówki w następujący sposób, ostrożnie, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki:
Granulat regenerowany (0,32 m sacharozy)
3 ml 850 mM Sacharozy (w 1 mM NaHCO₃)
3 ml 1 M Sacharozy (w 1 mM NaHCO₃)
3 ml 1,2 M Sacharozy (w 1 mM NaHCO₃)
Wirować przy 82 500 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Powstałe oddzielenie na końcu gradientu wytworzy trzy prążki i osad: 1) mielinę i inne zanieczyszczenia błonowe (granica faz 0,32 M - 0,85 M); 2) ER, Golgiego, błony plazmatyczne (interfejs 0,85 M - 1 M); 3) synaptosomy (interfejs 1 M - 1,2 M); 4) surowe mitochondria (osady), które są wykorzystywane do kolejnych etapów oczyszczania

3. Izolacja błony ER związanej z mitochondriami, MAM

Zawiesić świeżo wyizolowane surowe mitochondria z jednej połówki mózgu w 2 ml pożywki izolacyjnej zawierającej świeżo dodane inhibitory proteazy.
Przygotuj 30% gradient Percoll z buforem gradientowym 8 ml na pół mózgu i umieść w ultra-przezroczystej probówce wirówkowej Beckmana.

* Uwaga: Zwiększ stężenie gradientu (1,43 razy), aby osiągnąć prawidłowe stężenie końcowe po rozcieńczeniu Percollu do 30%.

Nakładaj zawiesinę mitochondrialną na przygotowany gradient POWOLI, aby uniknąć pęcherzyków.
Wirować przy 95 000 x g przez 30 min, 4 °C.
1. Najpierw usuń frakcję ciężką (dolny pasek) szklaną pipetą Pasteura i przenieś do świeżej szklanej probówki z okrągłym dnem na lodzie.
2. Usunąć lekką frakcję (górny pasek) DRUGĄ za pomocą kolejnej szklanej pipety Pasteura i przenieść do oddzielnej świeżej szklanej probówki z okrągłym dnem na lodzie.
Rozcieńczyć obie frakcje zebrane w kroku 3.5 10 ml pożywki izolacyjnej i odwirować przy 6 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
Odrzucić supernatant z frakcji ciężkiej otrzymanej w kroku 3.6, ponownie zawiesić osad z kolejnym 10 ml pożywki izolacyjnej i ponownie odwirować, zgodnie z krokiem 3.6. Powstała osadka będzie czystą frakcją mitochondrialną.
Przenieść supernatant z frakcji lekkiej otrzymanej w kroku 3.6 do ultra-przezroczystej probówki wirówkowej Beckmana na lodzie. Wyrzuć granulkę.
Dodać wystarczającą ilość pożywki izolacyjnej do supernatantu otrzymanego w kroku 3.8, aby napełnić probówkę i odwirować przy 100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Powstały osad będzie frakcją MAM. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.

Uwaga: Na tym etapie możesz również odwirować przy 100 000 x g przez 1 godzinę, 4 °C supernatant zapisany w kroku 2.6. Osad będzie frakcją ER, a supernatant frakcją cytozolową.

4. Ekstrakcja mikrodomen wzbogaconych glikosfingolipidami, GEM-y

Lizować czyste mitochondria i/lub frakcje MAM w 500 μl-1 ml buforu ekstrakcyjnego przez 20 minut na lodzie.
Odwirować lizaty przy 15 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
Zebrać supernatanty (materiał rozpuszczalny Triton X-100) i ponownie odwirować granulki przez 2 minuty, aby usunąć pozostały rozpuszczalny materiał. (Mitochondria wyekstrahowane Triton X-100 i/lub MAM wyekstrahowane Triton X-100).
Rozpuszczaj granulki w buforze do rozpuszczania. Ten rozpuszczony materiał reprezentuje frakcje GEM i może być wykorzystany do dalszej analizy.