Szybkie testy kolorymetryczne w celu jakościowego rozróżnienia RNA i DNA w próbkach biomolekularnych

Podsumowanie

Opisano zestaw testów kolorymetrycznych do szybkiego rozróżniania białek, RNA, DNA i cukrów redukujących w potencjalnie heterogenicznych próbkach biomolekularnych.

Streszczenie

Eksperymenty biochemiczne zazwyczaj wymagają dokładnej wiedzy, na wczesnym etapie, o kwasie nukleinowym, białku i innych składnikach biomolekularnych w potencjalnie heterogenicznych próbkach. Kwasy nukleinowe można wykrywać za pomocą kilku uznanych podejść, w tym metod analitycznych, które są spektrofotometryczne (np. A₂₆₀), fluorometryczne (np. wiązanie barwników fluorescencyjnych) lub kolorymetryczne (chromogenne reakcje chemiczne specyficzne dla nukleozydów). ¹ Chociaż nie można łatwo odróżnić RNA od DNA, stosunek A₂₆₀ / A₂₈₀ jest powszechnie stosowany, ponieważ oferuje prostą^{i szybką 2} ocenę względnej zawartości kwasu nukleinowego, który wchłania głównie w pobliżu 260 nm i białka, które wchłania głównie w pobliżu 280 nm. Proporcje < 0,8 są traktowane jako wskazujące na "czyste" próbki białek, podczas gdy czysty kwas nukleinowy (NA) charakteryzuje się stosunkami > 1,5³.

Są jednak scenariusze, w których zawartość białka/NA nie może być tak jasno i wiarygodnie wywnioskowana z prostych pomiarów spektrofotometrycznych uv-vis. Na przykład (i) próbki mogą zawierać jedno lub więcej białek, które są stosunkowo pozbawione aminokwasów aromatycznych odpowiedzialnych za wchłanianie przy ≈280 nm (Trp, Tyr, Phe), jak ma to miejsce w przypadku niektórych małych białek wiążących RNA, oraz (ii) próbki mogą wykazywać pośrednie proporcje A₂₆₀/A₂₈₀ (~0,8 < ~1,5), gdzie zawartość białka / NA jest znacznie mniej wyraźna i może nawet odzwierciedlać pewne wysokie powinowactwo między białkiem a składnikami NA. W przypadku takich scenariuszy opisujemy tutaj zestaw testów kolorymetrycznych w celu szybkiego rozróżnienia RNA, DNA i cukrów redukujących w potencjalnie mieszanej próbce biomolekuł. Metody opierają się na zróżnicowanej wrażliwości pentoz i innych węglowodanów na odczynniki Benedicta, Biala (orcynol) i Dische'a (difenyloamina); Uproszczone protokoły można ukończyć w ciągu kilku minut, bez żadnych dodatkowych kroków związanych z koniecznością izolowania komponentów. Testy można wykonywać równolegle, aby rozróżnić RNA i DNA, a także wskazać obecność wolnych cukrów redukujących, takich jak glukoza, fruktoza i ryboza (ryc. 1).

Wprowadzenie

Duża część biologii komórki zachodzi poprzez interakcje molekularne obejmujące DNA i RNA. ⁴ Te naturalnie występujące kwasy nukleinowe (NA) oddziałują ze ^sobą,5 z białkami,6 oraz z wieloma drobnocząsteczkowymi związkami i ligandami in vivo (np. kationami dwuwartościowymi7). Interakcje mogą być krótkotrwałe lub długotrwałe (kinetycznie), mogą wahać się od wysokiego przez umiarkowane do niskiego powinowactwa (siła termodynamiczna), a także mogą wykazywać znaczne różnice we właściwościach chemicznych i swoistości - niektóre powiązania są dość specyficzne (np. DNA···czynniki transkrypcyjne, RNA····czynniki splicingowe), podczas gdy inne interakcje są z konieczności znacznie bardziej ogólne (np., DNA···bakteryjne białka histone-podobne do HU⁸). Niespecyficzne interakcje z NAs mogą mieć praktyczne konsekwencje dla doświadczeń in vitro obejmujących mieszaniny biomolekuł, ponieważ jest możliwe, a nawet prawdopodobne, że niektóre NA będą kojarzyć się z biomolekułami będącymi przedmiotem zainteresowania, przynajmniej w pewnym podzbiorze stosowanych warunków eksperymentalnych (siła jonowa, pH roztworu itp.).

Rozważ, na przykład, produkcję białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) poprzez heterologiczną nadekspresję białka rekombinowanego w hodowli komórkowej Escherichia coli; taka procedura jest rutynowo wykonywana w praktycznie każdym laboratorium biologii strukturalnej. ⁹ Przygotowując się do dalszych eksperymentów, takich jak charakterystyka biochemiczna/biofizyczna, krystalizacja itp., początkowe wysiłki koncentrują się na ogół na uzyskaniu wystarczającej ilości POI w możliwie najczystszej formie, najlepiej jako chemicznie jednorodny i biofizycznie monodyspersyjny próbk. Po rozerwaniu komórek gospodarza, wczesne etapy typowego procesu oczyszczania mają na celu wyizolowanie POI od białek E. coli, kwasów nukleinowych, szczątków ściany komórkowej i innych składników lizatu komórkowego. Jednak NA-NA gospodarza mogą oczyszczać się jednocześnie z POI z kilku powodów fizykochemicznych - wysoce zasadowy POI może niespecyficznie ściągać w dół DNA/RNA gospodarza; POI może mieć ogólną aktywność wiążącą NA (np. wspomniany HU); POI może być dość specyficznym białkiem wiążącym NA, ale wykazywać reaktywność krzyżową z RNA lub DNA gospodarza; NA-NA gospodarza mogą wchodzić w interakcje z matrycą chromatograficzną, a tym samym po prostu koeluować z POI; i tak dalej. Bezkrytyczne, wysokie powinowactwo wiązania NAs gospodarza z POI może stanowić irytujący problem, ponieważ zanieczyszczenia NA prawdopodobnie będą zakłócać dalsze eksperymenty (np. Testy anizotropii fluorescencji wiązania POI•RNA¹⁰). Alternatywnie, nieprzewidziane powiązania POI···NA mogą być również postrzegane przypadkowo, ponieważ takie interakcje rzucają światło na zdolność POI do wiązania kwasów nukleinowych. Tak czy inaczej, niezależnie od tego, czy NA są kluczowymi składnikami, czy zanieczyszczeniami, należy najpierw określić ilościowo i zidentyfikować typ (DNA, RNA) współoczyszczających NA w ramach przygotowań do dalszych eksperymentów.

Istnieje kilka metod analitycznych do wykrywania i ilościowego oznaczania NAs w próbce. Większość dostępnych metod to metody spektrofotometryczne (np. wartości absorbancji A₂₆₀ i proporcje A₂₆₀/A₂₈₀), fluorometryczne (np. wiązanie oranżu tiazolowego lub innych barwników fluorescencyjnych z NA) lub kolorymetryczne (podatność nukleozydów na reakcje chemiczne, w wyniku których powstają chromofory absorbujące się w obszarze uv-vis widma elektromagnetycznego), jak niedawno opisali De Mey i wsp. ¹ Jednak kluczowy krok identyfikacji typu polinukleotydu jako RNA lub DNA wykracza poza zakres wielu z tych podejść do oceny ilościowej. Tutaj przedstawiamy zestaw testów kolorymetrycznych do szybkiej identyfikacji rodzajów składników NA w próbce białkowej.

Opisane tutaj protokoły mogą być efektywnie wykonane bez dodatkowych etapów izolowania potencjalnych zanieczyszczeń NA i polegać na teście Benedicta dla redukcji cukrów¹¹, teście orcyny dla pentoz^12,13 i reakcjach difenyloaminy^14,15 2'-deoksypentozów (Rysunki 1 i 2). Test Benedicta (ryc. 2a) wykorzystuje zdolność liniowej, otwartej (aldehydowej) formy cukru aldozowego do redukcji Cu²⁺, z jednoczesnym utlenianiem karbonylu cukru do ugrupowania karboksylowego i wytwarzaniem Cu₂O jako nierozpuszczalnego czerwonego osadu. Ta reakcja będzie pozytywna w przypadku wolnych cukrów redukujących, takich jak aldozy i ketozy (które przekształcają się w odpowiednie aldozy za pośrednictwem produktów pośrednich enediolu), ale nie w przypadku cukrów pentozowych, które są zablokowane w formie cyklicznej jako część kowalencyjnego szkieletu polinukleotydu DNA lub RNA. Ze względu na minimalistyczny wymóg funkcjonalności wolnego półacetalu, inne związki, które mogą dać wynik pozytywny w tym teście - a zatem działać jako potencjalne zakłócenia - obejmują α-hydroksyketony i krótkie oligosacharydy (np. disacharyd maltozę). Zarówno reakcje orcyny Biala (ryc. 2b), jak i difenyloaminy Dische'a (ryc. 2c) opierają się na początkowym zniszczeniu szkieletu polinukleotydowego poprzez deurinację nukleozydu i dalszą katalizowaną kwasem lub zasadą hydrolizę nukleotydów macierzystych, w celu uzyskania pochodnych furan-2-karbaldehydu (furfuralu); Pochodne te następnie reagują z odczynnikami polihydroksyfenolowymi, takimi jak orcynol (Bial) lub difenyloamina (Dische), tworząc kolorowe produkty kondensacji o w dużej mierze nieznanej strukturze chemicznej. Specyficzność DNA w stosunku do RNA w teście Dische'a wynika z faktu, że cukier pentozowy musi być odtleniony 2', aby był podatny na utlenianie do aldehydu ω-hydroksylewulinylu, który dalej reaguje z difenyloaminą w warunkach kwaśnych, dając jasnoniebieski kondensat (ryc. 2c). Korzystając z opisanych tutaj uproszczonych protokołów, odkryliśmy, że te specyficzne dla cukru reakcje kolorymetryczne mogą różnicować RNA i DNA, a także wskazują na obecność wolnych cukrów redukujących, takich jak glukoza, fruktoza lub ryboza w próbce biomolekularnej.

Protokół

1. Test Benedykta do redukcji cukrów

1. Przygotuj odpowiednią ilość odczynnika Benedicta - 940 mM bezwodnego węglanu sodu, 588 mM odwodnionego cytrynianu sodu, 68 mM pięciowodnego siarczanu miedzi (II). Odczynnik ten może być przechowywany w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej sześć miesięcy bez zauważalnej zmiany reaktywności.
2. Powyższy odczynnik to 6x. Tak więc, aby uzyskać reakcje 600 μl, dodaj 100 μl odczynnika Benedicta do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml (np. marki Eppendorf) na próbkę, która ma być oznaczona.
3. Dodać od 10 μl do 500 μl próbki do tej probówki; optymalną objętość można określić na podstawie intensywności tworzenia się koloru w początkowej próbie. Jeżeli dostępna jest wystarczająca ilość próbki, należy rozpocząć takie próby od maksymalnej możliwej objętości próbki (tj. pięć szóstych całkowitej objętości reakcji, w tym przypadku 500 μl próbki), a następnie rozcieńczyć w kolejnych testach.
4. Dodać ddH₂O do probówki, aby doprowadzić końcową objętość do 600 μl; wymieszać roztwór przez wirowanie lub pipetowanie.
5. Inkubować próbki przez 20 minut we wrzącej łaźni wodnej.
6. Wyjąć podgrzaną próbkę z kąpieli i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
7. Odwirować probówkę z próbką przy > 9 300 x g (~10 000 obr./min w wirniku FA45-24-11 Eppendorf) przez 5 minut w celu osadzenia wszelkich cząstek stałych; ten krok jest ważniejszy dla badań ilościowych niż jakościowych.
8. Porcjować supernatant z tej probówki do czystej kuwety.
9. Opróżnij spektrofotometr uv-vis wodą.
10. Zmierzyć absorbancję tej próbki przy długości fali 475 nm.

2. Test Orcinol Biala na obecność cukrów pentozowych

1. Przygotować odpowiednią ilość świeżego odczynnika Biala - 24,2 mM monohydratu orcyny (struktura tego związku znajduje się na rysunku 2b), 6 M HCl, 0,025% m/v sześciowodnego chlorku żelaza. nuta: W celu przedłużonego przechowywania, odczynnik Bial można przygotować w postaci dwóch oddzielnych roztworów podstawowych: (i) odczynnika A [0,05% w/v FeCl3•6H₂O w stężonym HCl] i (ii) odczynnika B [422 mM monohydrat orcyny przygotowany w 95% etanolu]. Odczynnik A może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez sześć miesięcy; Odczynnik B może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez jeden miesiąc, przykryty folią w celu ograniczenia ekspozycji na światło. Te roztwory podstawowe miesza się przed użyciem w stosunku 15 (A) : 1 (B) v/v.
2. Powyższy odczynnik to 2x. Tak więc, dla reakcji 1,0 ml, dodać 500 μl odczynnika Biala do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na próbkę, która ma być oznaczona.
3. Dodać do tej probówki od 10 μl do 500 μl próbki. Zgodnie z uwagą 1.3 (powyżej), jeżeli dostępna jest wystarczająca ilość próbki, należy rozpocząć reakcje próbne przy użyciu maksymalnej możliwej objętości próbki (tj. połowy całkowitej objętości reakcji, w tym przypadku 500 μl próbki) i rozcieńczyć ją.
4. Dodać ddH₂O do probówki, aby doprowadzić końcową objętość do 1,0 ml; wymieszać roztwór przez wirowanie lub pipetowanie.
5. Inkubować próbki przez 20 minut we wrzącej łaźni wodnej.
6. Wyjąć podgrzaną próbkę z kąpieli i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
7. Odwirować probówkę z próbką przy > 9 300 x g (~10 000 obr./min w wirniku FA45-24-11 Eppendorf) przez 5 minut w celu osadzenia wszelkich cząstek stałych; ten krok jest ważniejszy dla badań ilościowych niż jakościowych.
8. Porcję supernatantu z tej probówki umieścić w czystej kuwecie w celu kontroli wzrokowej.
9. W przypadku analizy półilościowej należy zaślepić spektrofotometr uv-vis wodą i zmierzyć absorbancję próbki kuwety przy długości fali 660 nm.

3. Test Difenyloaminy Dische'a dla cukrów 2'-deoksypentozowych

1. Przygotować odpowiednią ilość odczynnika difenyloaminy Dische'a - 60 mM difenyloaminy, 11 M lodowaty kwas octowy, 179 mM kwas siarkowy, 0,62% v/v etanolu. Odczynnik ten można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemnym pojemniku lub przykryć folią, aby ograniczyć ekspozycję na światło. Ze względu na wrażliwość na światło odczynnik nie powinien być przechowywany w nieskończoność, chociaż w praktyce można go przygotowywać co dwa do trzech miesięcy bez widocznej zmiany reaktywności.
2. Powyższy odczynnik to 2x. Tak więc, dla reakcji 1,0 ml, dodać 500 μl odczynnika Dische'a do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na próbkę, która ma być oznaczona.
3. Dodać do tej probówki od 10 μl do 500 μl próbki. Zgodnie z uwagą 1.3 (powyżej), jeżeli dostępna jest wystarczająca ilość próbki, należy rozpocząć reakcje próbne przy użyciu maksymalnej możliwej objętości próbki (tj. połowy całkowitej objętości reakcji, w tym przypadku 500 μl próbki) i rozcieńczyć ją.
4. Dodać ddH₂O do probówki, aby doprowadzić końcową objętość do 1,0 ml; wymieszać roztwór przez wirowanie lub pipetowanie.
5. Inkubować próbki przez 20 minut we wrzącej łaźni wodnej.
6. Wyjąć podgrzaną próbkę z kąpieli i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
7. Odwirować probówkę z próbką o >9 300 x g (~10 000 obr./min w wirniku FA45-24-11 Eppendorf) przez 5 minut w celu osadzenia wszelkich cząstek stałych; ten krok jest ważniejszy w przypadku badań ilościowych niż jakościowych.
8. Porcję supernatantu z tej probówki umieścić w czystej kuwecie w celu kontroli wzrokowej.
9. W przypadku analizy półilościowej należy zalać spektrofotometr uv-vis wodą i zmierzyć absorbancję próbki kuwety przy długości fali 600 nm.

4. Dalsze uwagi dotyczące użytkowania

1. Następujące klasy cząsteczek są odpowiednimi związkami odniesienia dla pozytywnych i ujemnych reakcji kontroli dla każdego testu:
   • Benedykta - Dodatni = wolna ryboza, fruktoza, glukoza; Ujemny = RNA, DNA, ATP itp. (każdy sacharyd pozbawiony funkcji wolnego cukru redukującego)
   • Bial's - Dodatni = RNA (np. ekstrakt z drożdży piekarskich), ryboza, ATP, UMP; Ujemny = albumina surowicy bydlęcej (BSA) lub jakiekolwiek inne białko
   • Dische's - Dodatni = DNA (np. grasica cielęca); Ujemny = RNA, ATP itp. (dowolny nukleotyd nieodtleniony 2')
2. Stwierdzono, że testy te są dość odporne na związki często stosowane w oczyszczaniu białek; na przykład sole kuchenne, takie jak NaCl, (NH₄)_2SO4 i_K2SO4 nie zakłócały, a zawartość rozcieńczalnika wydaje się na ogół nie mieć wpływu na reakcje. Detergenty lub środki chaotropowe, takie jak mocznik, mogą wpływać na reaktywność testów, jeśli pH jest wysoce zasadowe; zakres pH od obojętnego do kwaśnego jest na ogół najbardziej optymalny dla testów Biala i Dische'a ze względu na chemię leżącą u podstaw reakcji (patrz tekst i protony na rysunku 2b, c). Potencjalnie nieoptymalne warunki reakcji, podejrzenia zakłóceń itp. powinny być badane indywidualnie dla każdego przypadku, z wykorzystaniem doświadczeń kontroli dodatniej i ujemnej ze związkami odniesienia.

Wyniki

Wyniki zastosowania tych testów kolorymetrycznych do znanych związków referencyjnych przedstawiono na Rysunku 3. Reprezentatywne dane jakościowe pokazano dla testu Benedicta (a), testu Bial’a z orcinolem (b) oraz testu Dische’a z difenyloaminą (c), natomiast krzywe wzorcowe dla tych trzech testów przedstawiono na Rysunku 4. W panelach 3(a-c) lewe części obrazu przedstawiają eksperymenty z kontrolą pozytywną/negatywną z użyciem odpowiednio reaktywnych/niereaktywnych analitów; wyniki wizua...

Dyskusja

Przedstawione tutaj testy kolorymetryczne oferują proste podejście do szybkiej oceny chemicznego charakteru mieszanin biomolekularnych, takich jak te, które występują podczas oczyszczania białek, RNA lub kompleksów z lizatu całokomórkowego w ramach przygotowań do dalszych badań. W miarę jak biologia strukturalna dąży do tworzenia coraz bardziej natywnych zespołów, coraz większe wyzwania, takie jak niejednorodność próbek, będą stwarzane przez skomplikowane i wieloskładnikowe kompleksy. Zespoły supramolekularne są często t...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bezwodny węglan sodu	Fisher Scientific	S263
Cytrynian sodu dwuwodny	Sigma	S-4641
Pięciowodny siarczan miedzi (II)	VWR	VW3312-2
Orcynol jednowodny	Sigma-Aldrich	O1875
Skoncentrowany HCl	VWR	BDH3030
Sześciowodny chlorek żelaza	Sigma	F-2877
Difenyloamina	Aldrich	112763
Lodowaty kwas octowy	Fisher Scientific	A28
Kwas siarkowy	Sigma-Aldrich	258105
Etanol	Koptec	V1101
Ryboza	Sigma	R-7500	przygotowanie przy 1% w/v w H2O
Kwas rybonukleinowy z drożdży piekarskich (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	przygotować w dawce 10 mg/ml w H2O; przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Kwas dezoksyrybonukleinowy (sól sodowa), z grasicy cielęcej	Sigma	D1501	przygotować w dawce 10 mg/ml w H2O; przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
Odczynniki, sprzęt i Safety Materiały są wymienione w poniższej tabeli w kolejności, w jakiej pojawiają się w sekcji Protokół. O ile nie zaznaczono inaczej (powyżej), wszystkie odczynniki można przechowywać w temperaturze pokojowej otoczenia i przy oświetleniu. W przypadku wszystkich produktów niewymienionych poniżej (np. probówki do mikrowirówek , można użyć zwykłej marki / modelu / odmiany znajdującej się w standardowym laboratorium biochemicznym (np. , probówki do mikrofug marki Eppendorf o pojemności 1,5 ml). Standardowe probówki do mikrofug z tworzywa sztucznego powinny być używane do etapów obejmujących wirowanie (np. , w celu osadzenia cząstek stałych pod koniec każdego protokołu). Żaden konkretny materiał nie jest preferowany, o ile rurki można uszczelnić; Dobrze sprawdzają się typowe rurki polipropylenowe znajdujące się w laboratoriach biochemicznych. Jeśli chodzi o kwestie bezpieczeństwa i utylizację odpadów, należy zachować standardowe laboratoryjne środki ostrożności (okulary ochronne, dygestoria) przy wstępnym przygotowywaniu, pracy i utylizacji roztworów zawierających stężone kwasy octowe, solne lub siarkowe. W przypadku odczynników organicznych, takich jak orcynol lub difenyloamina, rękawice nitrylowe są lepsze niż zwykła odmiana lateksu (kauczuku naturalnego).