Wprowadzenie do elektrofizjologii opartej na membranach podpartych ciałem stałym

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę elektrofizjologiczną opartą na solidnych membranach z naciskiem na jej zastosowania do charakterystyki elektrogenicznych transporterów membranowych.

Streszczenie

Metoda elektrofizjologiczna, którą prezentujemy, opiera się na solidnej membranie (SSM) składającej się z warstwy oktadekanetiolu chemisorbowanej na pokrytym złotem chipie czujnika i monowarstwy fosfatydylocholiny na wierzchu. Ten zespół jest zamontowany w systemie kuwet zawierającym elektrodę odniesienia, drut z chlorowanego srebra.

Po adsorpcji fragmentów błony lub proteoliposomów zawierających interesujące białko błonowe, szybka wymiana roztworu jest wykorzystywana do indukowania aktywności transportowej białka błonowego. W protokole wymiany jednego rozwiązania potrzebne są dwa rozwiązania, jedno nieaktywujące i jedno aktywujące. Przepływ jest kontrolowany przez sprężone powietrze oraz system zaworów i przewodów w klatce Faradaya.

Kinetyka aktywności transportu elektrogenicznego jest uzyskiwana poprzez sprzężenie pojemnościowe między SSM a proteoliposomami lub fragmentami błony. W związku z tym metoda daje tylko prądy przejściowe. Prąd szczytowy reprezentuje stacjonarną aktywność transportową. Zależne od czasu prądy transportera można zrekonstruować za pomocą analizy obwodu.

Ta metoda jest szczególnie odpowiednia dla transporterów prokariotycznych lub eukariotycznych z błon wewnątrzkomórkowych, które nie mogą być zbadane za pomocą metody patch clamp lub voltage clamp.

Wprowadzenie

Tutaj demonstrujemy nowe podejście elektrofizjologiczne oparte na solidnej membranie (SSM) do charakterystyki elektrogenicznych białek błonowych.

Solidna podpora składa się z cienkiej warstwy złota na szklanym szkiełku, chipie czujnika. Hydrofilowa powierzchnia złota służy do wiązania grupy tiolowej odczynnika alcanetyolowego. Następnie samoorganizacja monoliera fosfatydylocholiny kończy tworzenie SSM.

Aby zmierzyć reakcje elektrogeniczne białek błonowych, proteoliposomy lub fragmenty błony są adsorbowane do SSM (Rysunek 1). Białko zawierające błonę i SSM tworzą następnie pojemnościowo sprzężony system błonowy. Dlatego translokację ładunku na błonie zawierającej białko można wykryć przez sprzężenie pojemnościowe za pośrednictwem SSM. Ta metoda daje tylko prądy przejściowe. Prąd szczytowy reprezentuje stacjonarną aktywność transportową. Zależne od czasu prądy transportera można zrekonstruować za pomocą analizy obwodu.

Układ czujnika jest zamontowany w systemie kuwet (Rysunek 2). Kuweta ma cylindryczną pojemność kuwety 17 μl (objętość netto z zamontowanym o-ringiem). Kołek styku sprężynowego tworzy styk ze wzmacniaczem. Złącze wylotowe jest przykręcone do górnej części głównej i przenosi elektrodę odniesienia, drut z chlorowanego srebra.

Kuweta jest zamontowana w klatce Faradaya. Jest połączony ze szlakiem płynnym , który służy do indukowania aktywności transportowej białka błonowego w odpowiedzi na szybką wymianę roztworu (ryc. 3). W protokole wymiany pojedynczych rozwiązań wymagane są dwa rozwiązania, jedno nieaktywujące i jedno aktywujące. Przepływ jest kontrolowany przez sprężone powietrze za pomocą oprogramowania sterującego zaworem na komputerze lub ręcznych przełączników na skrzynce interfejsu.

Protokół

1. Konfiguracja aparatury do elektrofizjologii opartej na SSM

Szczegóły są podane w dwóch naszych publikacjach technicznych, które zawierają również schematyczne rysunki i zdjęcia naszych kuwet i konfiguracji ^{1, 2}. Różne konfiguracje wymiany rozwiązań i protokoły przepływu są również omówione w naszym dokumencie metodycznym ².

Poniżej dodajemy kilka ostatnich ulepszeń i szczegółów technicznych, które mają bezpośrednie znaczenie dla prezentacji wideo.

Sterowanie zaworami i akwizycja danych

Skrzynka interfejsu zawiera komercyjne wyjście cyfrowe USB / analogowy interfejs wejściowy (NI USB 6009 National Instruments) oraz sterowniki zaworów. Kontroluje przepływ rozwiązania i odpowiada za pozyskiwanie danych. Zawory są zwykle zasilane napięciem 12 V. Jednak w celu szybkiego przełączania zawory mogą być napędzane napięciem do 18 V. Na filmie używamy zasilacza 12 V.

Płytka obwodu sterownika zaworu może obsługiwać cztery zawory. Został wyprodukowany przez warsztat Instytutu Biofizyki im. Maxa Plancka. Zawory mogą być sterowane komputerowo lub ręcznie za pomocą przełączników na panelu przednim. Ten ostatni jest wygodny do spłukiwania- i czyszczenia. Podczas pomiaru skrzynka interfejsu jest sterowana komputerowo za pomocą oprogramowania do sterowania zaworami i akwizycji danych (oprogramowanie SURFE²R, IonGate Biosciences).

2. Przygotowania

W tej sekcji wymienione są różne protokoły przygotowania eksperymentu elektrofizjologicznego opartego na SSM.

2.1 Przygotowanie roztworu lipidowego do tworzenia SSM

1. Wymieszać 25 μl oktadecyloaminy (5 mg/ml w chloroformie) i 375 μl difitanoilofosfatydylocholiny (20 mg/ml w chloroformie) w szklanej fiolce.
2. Za pomocą wyparki obrotowej i ciągłego przepływu azotu należy odparowywać chloroform przez około 30 minut.
3. Usunąć lipid ze ścianek szklanej fiolki, wstrząsając 500 μl n-dekanu. Końcowe stężenie lipidów wynosi 15 mg/ml z 1:60 (w/w) oktadecyloaminy.
4. Przenieść roztwór do szklanej fiolki do przechowywania. Przechowywać roztwór lipidowy w temperaturze -20 °C.

2.2 Chlorowanie elektrody referencyjnej

Elektrody referencyjne muszą być chlorowane w regularnych odstępach czasu z powodu ścierania.

1. Usuń resztę starej warstwy chlorku srebra za pomocą drobnego papieru ściernego przed procesem chlorowania.
2. Umieść srebrny drut wraz z elektrodą platynową w 1 M roztworze kwasu solnego i chloruj przez 15 minut w temperaturze 0,5 mA. Po zakończeniu chlorowania srebrny drut zmienia kolor na jednorodny ciemnoszary.

2.3 Przygotowanie mostu z żelu poliakrylamidowego

1. Przygotować roztwór zawierający 100 mM KPi przy pH = 7, 100 mM KCl i 6% akryloamidu.
2. Dodać 0,3% APS (10% Stock) i 0,6% TEMED i krótko wymieszać roztwór za pomocą pipety.
3. Natychmiast po wymieszaniu roztworu za pomocą pipety wstrzyknąć 30 μl mieszaniny do pustego pojemnika na mostek żelowy. Ważne jest, aby unikać pęcherzyków powietrza podczas wstrzykiwania.
4. Podczas inkubacji trwającej 20 minut żel ulega polimeryzacji.
5. Po polimeryzacji mostek żelowy jest przechowywany w roztworze (100 mM KPi pH 7, 100 mM KCl). Aby przedłużyć żywotność mostu żelowego, roztwór przechowuje się w temperaturze 4 °C.

2.4 Przygotowanie roztworów pomiarowych

Ze względu na silne oddziaływanie substancji rozpuszczonych z SSM, podczas wymiany roztworów o różnym składzie powstają artefakty elektryczne. Dlatego przygotowanie rozwiązań jest krytycznym krokiem. Podczas procesu przygotowywania roztworu należy podjąć następujące środki ostrożności, aby zminimalizować artefakty wymiany roztworu.

1. Przygotuj roztwory nieaktywujące i aktywujące z jednej partii, dostosuj pH i siłę jonową.
2. Tło o wysokiej zawartości soli pomaga zredukować artefakty wymiany roztworu.
3. Podzielić roztwór wsadowy na dwie objętości.
4. Dodaj związek aktywujący do roztworu aktywującego. Użyj związku kompensacyjnego w roztworze nieaktywującym, aby utrzymać osmolarność i siłę jonową obu roztworów tak podobne, jak to możliwe.
5. Jeśli roztwory są przechowywane w temperaturze 4 °C, przed rozpoczęciem pomiaru upewnij się, że wszystkie roztwory osiągnęły temperaturę pokojową, ponieważ nawet niewielkie różnice temperatur mogą powodować artefakty.

3. Eksperyment elektrofizjologiczny oparty na SSM

Tutaj prezentujemy typowy protokół dla eksperymentu elektrofizjologicznego opartego na SSM.

3.1 Przygotowanie konfiguracji SSM

Gdy konfiguracja SSM nie jest używana, probówki są napełniane 30% roztworem etanolu/wody, aby uniknąć rozwoju bakterii.

1. Umyj system czystą wodą, aby usunąć etanol z rurki przed zamontowaniem kuwety. Zamień pojemniki na etanol pojemnikami na wodę. Za pomocą wysokiego ciśnienia (0,6 do 1,0 bar) wyczyść system 20-30 ml wody.
2. Powtórzyć procedurę czyszczenia, używając 100 mM buforu KPi o pH 7,6 lub roztworze nieaktywującym.
3. Upewnij się, że w układzie płynów nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza.

3.2 Montaż kuwety

1. Przymocuj o-ring do elektrody referencyjnej
2. Wyjmij mostek żelowy z roztworu do przechowywania i podłącz elektrodę referencyjną.
3. Napełnij złącze wylotowe nieaktywującym się buforem, włóż o-ring i podłącz mostek żelowy, aby zakończyć montaż elektrody referencyjnej. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby na styku mostka żelowego i ścieżki przepływu roztworu wylotowego nie znajdowały się pęcherzyki powietrza.
4. Wstępnie zmontuj główną część kuwety, dodając sworzeń styku sprężynowego (połączenie ze wzmacniaczem), rurkę wlotową (połączenie z zaworem terminala), o-ring (uszczelnienie dla SSM) i.
5. Za pomocą pęsety wyjmij chip czujnika z roztworu do przechowywania (10 mM oktadekanotiol w etanolu).
6. Za pomocą pipety zmyć pozostały roztwór ok. 5 ml czystego etanolu.
7. Osuszyć elektrodę pod gazowym azotem.
8. Umieść chip czujnika dokładnie na podstawowej części kuwety, tak aby otwór wlotowy głównej części kuwety był skierowany do okrągłego obszaru aktywnego czujnika.
9. Dodać 1 μl roztworu lipidowego do obszaru aktywnego chipa czujnika. Upewnij się, że warstwa złota jest całkowicie pokryta lipidem.
10. Natychmiast po dodaniu roztworu lipidów zamknij kuwetę, dodając wstępnie zmontowaną część główną.
11. Przed zamontowaniem kuwety w klatce Faradaya upewnij się, że wszystkie powierzchnie są całkowicie suche.
12. Podłącz amplifier do styku sprężynowego, a rurkę wlotową do zaworu terminala. Następnie przymocuj kuwetę za pomocą wewnątrz klatki Faradaya.
13. Przykręć złącze wylotowe do górnej części kuwety. Na koniec podłącz rurkę wylotową do złącza wylotowego, a generator napięcia do elektrody odniesienia.
14. Bezpośrednio po zamontowaniu kuwety należy umyć układ buforem o ciśnieniu 0,6 bara. Prowadzi to do spontanicznego powstawania SSM.

3.3 Pomiar parametrów membrany

Aby sprawdzić jakość SSM, pojemność i konduktancja są mierzone za pomocą generatora funkcji.

1. Za pomocą generatora funkcyjnego przyłóż napięcie 100 mV DC do pomiaru przewodności.
2. Oblicz przewodność: Zanik prądu pokazuje ładowanie kondensatora membranowego. Po pełnym naładowaniu kondensatora zmierzony prąd daje przewodnictwo membrany zgodnie z prawem Ohma. Dla uproszczenia używamy prądu 1 sekundę po przyłożeniu napięcia do obliczenia przewodności G=I/U.
3. Zastosuj trójkątne napięcie przemienne o amplitudzie szczytowej 50 mV i częstotliwości 0,5 Hz do pomiaru pojemności.
4. Oblicz pojemność: Amplituda wynikowego prądu fali prostokątnej reprezentuje prądy ładowania kondensatora. Pojemność C jest równa przenoszonemu ładunkowi Q=IΔt podzielonemu przez ΔU=100 mV. (ΔU jest dwukrotnością przyłożonego napięcia 50 mV, ponieważ I jest różnicą prądów dodatnich minus ujemne nachylenie napięcia trójkątnego.)
5. Monitoruj parametry elektryczne membrany wielokrotnie co 10 minut przez ok. 30 do 40 minut, aż do osiągnięcia stałych wartości. Przemyć pomiędzy nimi buforem KPi pod wysokim ciśnieniem w zakresie od około 0,6 do 1 bar.
6. Oszacuj jakość SSM: Optymalne parametry mieszczą się w zakresie od 0,1 do 0,2 nS i od 2 do 3,5 nF. Wysoka przewodność powyżej 0,8 nS i niska pojemność poniżej 1 nF wskazują, że SSM nie jest prawidłowo uformowany. Wysoka pojemność powyżej 4 nF może oznaczać, że strefa aktywna nie jest całkowicie pokryta przez SSM.
7. Jeśli parametry nie mieszczą się w optymalnym zakresie, membranę należy wyrzucić i przygotować kolejny SSM, używając świeżo przygotowanego chipa elektrody.

3.4 Sprawdzanie artefaktów wymiany roztworu

Po sprawdzeniu parametrów membrany, pomiarowe powinny zostać przetestowane pod kątem artefaktów wymiany roztworu.

1. Włóż odpowiednie pojemniki z roztworem do układu płynu.
2. Usuń pęcherzyki powietrza z układu płynów za pomocą zaworów ręcznych.
3. Korzystając z oprogramowania do akwizycji danych, wybierz protokół przepływu, którego chcesz użyć w eksperymencie.
4. Ustaw ciśnienie na 0,6 bara i rozpocznij pomiar.
5. Oprócz artefaktów związanych z mechanicznym przełączaniem zaworów, najlepiej byłoby, gdyby prądy artefaktów nie były mierzone lub były znacznie mniejsze niż oczekiwane sygnały transportu białek. W przypadku zaobserwowania artefaktów wymiany roztworu, przed kontynuowaniem eksperymentu należy spróbować zoptymalizować skład buforu i/lub procedurę przygotowania.

3.5 Dodawanie próbki białka

Zazwyczaj proteoliposomy lub fragmenty błony są przechowywane w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C. Do jednego pomiaru potrzebna jest podwielokrotność około 30 μl.

1. Przepłukać SSM roztworem nieaktywującym.
2. Rozmrozić próbkę białka na lodzie.
3. Trzy 10-sekundowe cykle sonikacji są przeplatane 10-sekundowymi interwałami chłodzenia na lodzie. Proteoliposomy są sonikowane za pomocą sonikatora do kąpieli. Do fragmentów membrany stosuje się sonikator końcówki (50 W, 30 kHz, średnica sonotrody 1 mm, intensywność 20%, cykl 0,5). Po ostatnim etapie sonikacji nie należy ponownie umieszczać próbki na lodzie, ale natychmiast wstrzyknąć ją do kuwety.
4. Odkręć złącze wylotowe wraz z zespołem elektrody odniesienia.
5. Za pomocą pipety odessać 30 μl próbki białka i przymocować końcówkę pipety do otworu wylotowego.
6. Otwórz zawór ręczny w drodze nieaktywującej do pojemnika na odpady i wstrzyknij proteoliposomy do objętości kuwety. Uważaj, aby nie wstrzykiwać powietrza do objętości kuwety za pomocą czujnika.
7. Przed wyjęciem końcówki pipety zamknij zawór ręczny, aby zapobiec dalszemu przepływowi roztworu.
8. Pozwól proteoliposomom na adsorpcję w SSM przez czas inkubacji od 1 do 2 godzin. Możliwa jest również inkubacja przez noc.

3.6 Ogólna procedura eksperymentu opartego na SSM

1. Rozgrzać miarowe na czas, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C. Wszystkie pomiarowe muszą mieć temperaturę pokojową przed rozpoczęciem pomiaru, aby uniknąć artefaktów.
2. Podczas wymiany roztworów należy najpierw oczyścić probówki wewnątrz pojemników z roztworem chusteczką, która nie rozmywa się, a następnie włożyć nowe butelki.
3. Przed rozpoczęciem pomiaru należy użyć zaworów ręcznych, aby usunąć pęcherzyki powietrza, które mogły powstać w wyniku procedury zmiany.
4. Wyreguluj ciśnienie tuż przed rozpoczęciem pomiaru. Rutynowo stosujemy ciśnienie 0,6 bara, które przy naszej specyficznej konfiguracji zaworów i rurek daje natężenie przepływu około 1,0 ml/s.
5. Kilka pierwszych pomiarów można przeprowadzić bezpośrednio jeden po drugim i należy je odrzucać, dopóki prąd szczytowy nie pozostanie stały. Jeżeli roztwory różnią się pH, czas inkubacji wynosi co najmniej 3 minuty, aby dostosować wewnętrzne pH proteoliposomów przed rozpoczęciem pomiaru.
6. Teraz konfiguracja jest gotowa do pomiaru. Aby zredukować hałas, należy wykonać co najmniej 3 pomiary i uśrednić.

3.7 Pomiary kontrolne

Utrata sygnału podczas serii pomiarów może wystąpić z powodu degradacji białka lub utraty adsorpcji. Każdy eksperyment SSM powinien zawierać kontrolę rozbiegu. Odbywa się to poprzez wielokrotne pomiary z identycznymi roztworami. Minimalna kontrola wyczerpania oznacza jeden pomiar na początku i jeden na końcu eksperymentu, przy użyciu tego samego roztworu.

Zalecamy przeprowadzenie kontroli rozbiegu w warunkach, w których spodziewasz się najwyższej amplitudy szczytowej w eksperymencie. Ułatwia to ilościowe określenie przebiegu sygnału.

Przebieg sygnału można określić ilościowo przez porównanie amplitud szczytowych dwóch kontrolek dobiegu. Uzyskaną wartość procentową można wykorzystać do skorygowania mierzonych sygnałów, zakładając liniową zależność wybiegu w czasie.

3.8 Sterowanie artefaktami

Jeśli to możliwe, spróbuj zweryfikować swoje wyniki, hamując interesujące nas białko po eksperymencie. Pozostałe sygnały są prawdopodobnie artefaktami wymiany rozwiązań. Sygnały muszą być następnie skorygowane o zmierzone artefakty.

3.9 Po eksperymencie

1. Umyj system 20-30 ml czystej wody i 20-30 ml 30% etanolu/wody. Roztwór etanolowy zapobiega rozwojowi bakterii, gdy system nie jest używany.
2. Po tej procedurze czyszczenia zwolnij ciśnienie z systemu i wyłącz wszystkie instrumenty.
3. Wyjmij kuwetę z klatki Faradaya i zdemontuj ją. Wszystkie części kuwety można czyścić wodą i czystym etanolem, jeśli to konieczne, za pomocą sonografu do kąpieli.
4. Umieść chip czujnika w szklanej zlewce z czystym etanolem. Sonikować zlewkę przez około 1 do 2 minut za pomocą sonografu do kąpieli.
5. Wysuszyć chip czujnika pod gazowym azotem.
6. Przechowuj chip czujnika z dala od światła w roztworze etanolowym oktadekantiolu o stężeniu 10 mM. Po czasie inkubacji wynoszącym około 30 minut chip czujnika jest gotowy do ponownego użycia.

Wyniki

Do tej pory elektrofizjologia oparta na SSM była używana do scharakteryzowania ponad 20 transporterów, głównie pochodzenia prokariotycznego, np. MelB ³, NhaA ⁴ i PutP ⁵ (podsumowane w ⁶). Badano również transportery eukariotyczne z błon wewnątrzkomórkowych, np. ClC777 oraz kanały jonowe, np. nikotynowy receptor acetylocholiny ⁸.

Tutaj prezentujemy jako przykład pomiary kotransportera cukru/H+ LacY z Escherichia coli przy użyciu proteoliposomów z co najmniej 85% LacY zorientowanym na prawą stronę na zewnątrz przy LPR 5, ^{9, 10}. Skupiamy się na głównych krokach prowadzących do minimalnego modelu kinetycznego tego białka transportowego.

1. Charakterystyka elektrofizjologiczna dzikiego typu LacY

Pierwszym krokiem jest ogólna charakterystyka reakcji elektrogenicznej poprzez pomiar różnych wartości pH (Rysunek 4), stężeń substratów (Rysunek 5) i substratów. Aby potwierdzić tę technikę, odtworzono wartości K_{, M} i pK podane w literaturze.

Zależność pH LacY pokazuje dwie różne reakcje elektrogeniczne. Prąd sprzężony pojemnościowo wzrasta między pH 5 a pH 8,5, ale także zmienia swój kształt. W warunkach zasadowych obserwuje się transport w stanie ustalonym, podczas gdy dla kwaśnych wartości pH zachodzi tylko szybka reakcja elektrogenna. Aby odróżnić sygnały w stanie ustalonym od szybkich reakcji elektrogenicznych, zastosowaliśmy analizę obwodów w celu zrekonstruowania prądów transportera (ilustracja 6).

Przy pH 7 sygnał jednofazowy staje się dwufazowy. Wskazuje to również, że istnieją dwie różne reakcje elektrogeniczne. Oszacowane na podstawie przeniesionego ładunku (całki sygnałów), obie reakcje mają około 6% i 94% całkowitej elektrogeniczności cyklu transportu.

2. Przypisanie reakcji elektrogenicznych

Aby przypisać dwie reakcje elektrogeniczne do poszczególnych etapów cyklu reakcji LacY, zmierzono wariant LacY E325A (Rysunek 7). Ten wariant wykazuje tylko wymianę laktozy, ale jest niewystarczający dla wszystkich aktywnych rodzajów transportu, ze względu na hamowanie uwalniania protonów. Sygnał E325A LacY reprezentuje szybki stan nieustalony i jest stały dla wszystkich mierzonych wartości pH. Kształt i amplituda sygnału jest podobna do sygnału typu dzikiego LacY w warunkach kwaśnych. Dodatkowo po malejącym prądzie szczytowym obserwujemy małą ujemną fazę, która jest charakterystyczna dla szybkich prądów przejściowych mierzonych w układach sprzężonych pojemnościowo. Ponieważ wiązanie i uwalnianie laktozy nie jest elektrogenne, szybki stan przejściowy musi korelować z elektrogenicznym przejściem konformacyjnym po związaniu laktozy.

Wiadomo, że etap uwalniania protonów ogranicza szybkość obrotu LacY w trybie transportu napędzanym gradientem stężenia laktozy. W tym przypadku spodziewamy się wzrostu szybkości transportu przy zasadowym pH, ponieważ sprzyja to uwalnianiu protonów. Tak jest w przypadku skorelowanego sygnału transportu w stanie ustalonym typu dzikiego LacY. Co więcej, za pomocą pomiaru gradientu pH można wykazać, że tylko wewnętrzne pH wpływa na transport LacY w stanie ustalonym (niepublikowane). Dlatego dużą reakcję elektrogeniczną można przypisać etapowi uwalniania protonów.

3. Pomiary do analizy kinetycznej

Po zidentyfikowaniu reakcji elektrogenicznych szybkość transportu została określona za pomocą konfiguracji SSM z wysoką rozdzielczością czasową około 4,5 ms. Jest to możliwe tylko w warunkach, gdy jedna reakcja dominuje nad sygnałem. W tym przypadku stałe szybkości można wyprowadzić z prądów przejściowych z uwzględnieniem rozdzielczości czasowej sygnałów za pomocą iteracyjnego algorytmu dekonwolucji metodą najmniejszych kwadratów (rysunek 8). Wyznaczone stałe szybkości, jak również proponowany minimalny model kinetyczny (rysunek 9) ostatecznie wykorzystano do symulacji kinetyki transportera. Symulowane krzywe odtwarzają dane SSM, co dodatkowo potwierdza słuszność modelu kinetycznego.

Rysunek 1. Geometria adsorpcji proteoliposomów na SSM. SSM jest utworzony na chipie czujnika, strukturalnym szkiełku pokrytym złotem. Aby zmierzyć reakcje elektrogeniczne białek błonowych, proteoliposomy lub fragmenty błony są adsorbowane do SSM. Obie membrany tworzą system sprzężony pojemnościowo. Z tego powodu wykrywane są tylko prądy przejściowe.

Rysunek 2. Kuweta SSM przenosi chip czujnika i elektrodę referencyjną. Chip czujnika jest umieszczony między podstawą kuwety a głowicą kuwety. Elektroda referencyjna jest odizolowana od ścieżki przepływu za pomocą mostka solnego z żelu poliakrylamidowego.

Rysunek 3. Ścieżka płynu i obwód elektryczny układu SSM. W protokole wymiany pojedynczego roztworu wymagane jest tylko jedno rozwiązanie nieaktywujące (NA) i jedno aktywujące (A). Przepływ jest kontrolowany przez dwa zawory 2-drogowe (V1) i jeden zawór zaciskowy (V2). Zawór terminalowy przełącza się między roztworami nieaktywującymi i aktywującymi, kierując jeden z roztworów do kuwety, a drugi roztwór do pojemnika na odpady (W). Układ czujnika (SSM) jest podłączony do wzmacniacza (I/U), podczas gdy elektroda referencyjna (AgCl) jest podłączona do generatora funkcyjnego (F) w zewnętrznym obwodzie elektrycznym. Komputer (PC) i skrzynka interfejsu służą do obsługi zaworu i gromadzenia danych.

Rysunek 4. Prądy przejściowe mierzone za pomocą proteoliposomów LacY typu dzikiego po skokach stężenia laktozy 100 mM przy różnych wartościach pH. Roztwór nieaktywujący zawierał 100 mM glukozy, podczas gdy roztwór aktywujący zawierał 100 mM laktozy. Wszystkie roztwory przygotowano w 100 mM buforze fosforanu potasu o wskazanym pH z 1 mM DTT. Szczegółowe informacje na temat warunków pomiaru na tym i kolejnych rysunkach znajdują się w ^{punktach 9} i ¹⁰.

Rysunek 5. Uśrednione znormalizowane prądy szczytowe mierzone za pomocą proteoliposomów LacY typu dzikiego po skokach stężenia laktozy przy różnych stężeniach i wartościach pH. Wartości K_M uzyskuje się z pasowań hiperbolicznych.

Rysunek 6. Rekonstrukcja prądów transporterowych. Prądy przejściowe (A) użyte do rekonstrukcji prądów transportera (B) zmierzono za pomocą proteoliposomów LacY typu dzikiego po skokach stężenia laktozy o 100 mM przy pH 8,5 (ślad niebieski) i pH 5,2 (ślad czerwony). Przy pH 8,5 obserwuje się ciągły obrót, natomiast przy pH 5,2 zachodzi szybka reakcja elektrogenna. Widać to wyraźnie w zrekonstruowanym prądzie (B).

Rysunek 7. Prąd przejściowy mierzony proteoliposomami LacY E325A po skoku stężenia laktozy o 100 mM przy pH 5,2. Ten wariant LacY jest hamowany na etapie uwalniania protonów w cyklu transportowym, a zatem ma niedobór transportu. Obserwowana mała składowa ujemna jest charakterystyczna dla szybkich prądów przejściowych mierzonych w układach sprzężonych pojemnościowo i jest spowodowana rozładowaniem pojemności membrany po szybkiej reakcji elektrogenicznej. Jego stała czasowa π0 jest określona przez pojemności i przewodności układu (rysunek 1).

Rysunek 8. Prądy przejściowe mierzone za pomocą proteoliposomów LacY typu dzikiego po różnych skokach stężenia laktozy przy pH 5,2. W tych warunkach nie obserwuje się transportu w stanie ustalonym, ale elektrogeniczne przejście konformacyjne po związaniu laktozy. Linia przerywana przedstawia funkcję transferu reprezentującą rozdzielczość czasową systemu. Wstawka pokazuje wyznaczenie stałych szybkości włączania i wyłączania na podstawie obserwowanej stałej szybkości kobs z dopasowaniem hiperbolicznym do danych. Obserwowaną stałą szybkości wyznaczono na podstawie prądów przejściowych za pomocą iteracyjnego algorytmu dekonwolucji metodą najmniejszych kwadratów ¹⁰.

Rysunek 9. Model kinetyczny cyklu reakcji LacY. Za pomocą pomiarów SSM można było zidentyfikować i scharakteryzować dwa etapy elektrogeniczne. Silnie elektrogeniczna reakcja stanowiąca ~94% całkowitego przemieszczenia ładunku w cyklu reakcji jest obserwowana tylko przy neutralnych i zasadowych wartościach pH. Można go przypisać do kroku uwalniania protonów (niebieska strzałka). Słabo elektrogeniczny etap obserwuje się przy kwaśnym pH, gdy ciągły obrót LacY typu dzikiego jest hamowany. Przypisaliśmy tę reakcję elektrogenicznemu przejściu konformacyjnemu po związaniu laktozy, co stanowi 6% całkowitego przemieszczenia ładunku w cyklu reakcji.

Dyskusja

1. Zalety elektrofizjologii opartej na SSM w porównaniu z metodami konwencjonalnymi

Elektrofizjologia oparta na SSM sprawdziła się jako cenne narzędzie w elektrofizjologicznym zestawie narzędzi. Jest to szczególnie przydatne w przypadkach, gdy nie można zastosować konwencjonalnej elektrofizjologii, a mianowicie metod patch clamp i voltage clamp: poza kilkoma rzadkimi wyjątkami transportery bakteryjne nie mogą być badane przy użyciu metod zacisku napięciowego lub patch clampa ze względu na mały rozmiar bakterii i ponieważ są one trudne do ekspresji w komórkach ssaków lub oocytach. Ale można również zbadać fizjologicznie istotne transportery ssaków. W tym przypadku elektrofizjologia oparta na SSM jest atrakcyjna dla transporterów z błon wewnątrzkomórkowych oraz dla zastosowań przesiewowych w odkrywaniu leków ze względu na jej solidność i potencjał automatyzacji.

Oparte na SSMprzy użyciu konwencjonalnej elektrofizjologii, charakterystyka transporterów z rozdzielczością czasową jest wyzwaniem. Ponieważ rotacja transporterów jest niska, wymagana jest konfiguracja "gigantycznej łatki" lub "całej komórki", które mają z natury niską rozdzielczość czasową w eksperymencie wymiany roztworu. Powikłanie można przezwyciężyć za pomocą uwalniania substratu fotolitycznego. Jednak tylko ograniczona liczba podłoży nadaje się do tego podejścia. W tym przypadku szybka wymiana roztworów w SSM oferuje wyjątkową możliwość wykonywania badań elektrofizjologicznych z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu dowolnych substratów.

2. Ograniczenia i kroki krytyczne

W przeciwieństwie do technik zacisków krosowych i napięciowych, elektrofizjologia oparta na SSM nie może być stosowana do stosowania potencjału. Charakterystyka transportera jest zatem ograniczona do rodzajów transportu, które nie opierają się na potencjale błonowym.

Ogólnie rzecz biorąc, elektrofizjologia oparta na SSM nie ma ograniczeń co do rodzaju transportera (elektrogenicznego). Jednak metody zacisków napięciowych lub patch clamp mogą mieć zalety, jeśli składniki wewnątrzkomórkowe, takie jak białka wiążące, są wymagane do funkcjonalności białka.

Ograniczenia mogą wystąpić, jeśli wymiana roztworu tworzy duże prądy artefaktów. Dzieje się tak, gdy substrat silnie oddziałuje z SSM, jak w przypadku związków lipofilowych. Elementy sterujące artefaktami mogą być używane do korygowania mierzonych sygnałów. Co więcej, tło o wysokiej zawartości soli we wszystkich pomiarowych może być wykorzystane do redukcji artefaktów. Ale w przypadkach, gdy rozmiar artefaktu jest porównywalny z sygnałem białkowym, prawie niemożliwe jest wyizolowanie sygnału związanego z białkiem od artefaktu. Na szczęście wysokie artefakty są rzadkością w zoptymalizowanej wymianie rozwiązań.

Jest kilka kroków, które są kluczowe dla pomyślnej realizacji eksperymentu elektrofizjologicznego opartego na SSM. Najważniejszą częścią jest przygotowanie próbki białka. Jeśli stosuje się proteoliposomy, należy upewnić się, że w procesie rekonstytucji uzyskuje się czystą, powtarzalną próbkę wystarczającej ilości LPR, a transporter jest zorientowany we właściwy sposób. LPR można sprawdzić za pomocą mikroskopii elektronowej z pękaniem zamrażalniczym i orientacji w eksperymencie ELISA, jeśli dostępne są przeciwciała.

Należy używać wyłącznie SSM, który wykazuje optymalne parametry inkubacji próbki białka. Wstrzyknięcie białka jest kolejnym krytycznym krokiem. Sonikacja jest niezbędna i należy unikać pęcherzyków powietrza podczas wstrzykiwania. Po inkubacji próbki same pomiary mają kluczowe znaczenie, ponieważ pęcherzyki powietrza usuną zaadsorbowaną próbkę białka z chipa czujnika. Dlatego zawsze usuwaj pęcherzyki powietrza po zmianie roztworów. Niemniej jednak może dojść do awarii sygnału. Aby skorygować możliwe wyczerpanie sygnału, konieczne jest przeprowadzenie kontroli wyczerpania podczas eksperymentu.

3. Systemy specjalistyczne

Konfiguracja SSM może być modyfikowana w zależności od jej zastosowania. Co więcej, dostępne są zupełnie inne, wysoce wyspecjalizowane konfiguracje.

Istnieje możliwość pomiaru sygnałów białkowych w warunkach asymetrycznych, np. w gradiencie pH. Aby ustalić asymetryczne składy buforowe wewnątrz i na zewnątrz proteoliposomów, należy wprowadzić trzeci roztwór, roztwór spoczynkowy, a to wymaga konfiguracji podwójnej wymiany. W tym przypadku wymagany jest dodatkowy zawór trójdrogowy przełączający między roztworami nieaktywującymi i spoczynkowymi.

Aby zwiększyć rozdzielczość czasową systemu, opracowaliśmy alternatywną ścieżkę przepływu pozbawioną zaworu końcowego, ale wykorzystującą inny typ kuwety. W tym przypadku skrzyżowanie roztworu aktywującego i nieaktywującego znajduje się wewnątrz kuwety, 3 mm przed SSM. Ta konfiguracja doskonale nadaje się do analizy kinetycznej szybkich procesów transportowych. Można wykazać, że możliwa jest rozdzielczość czasowa tak długa, jak 2 ms.

Dostępne są komercyjne, w pełni zautomatyzowane systemy, których celem jest znacznie większa przepustowość badań przesiewowych leków. Ruchoma jednostka zbiera roztwory i wstrzykuje je na powierzchnię czujnika na 96-dołkowych płytkach w standardowym formacie płytki do mikromiareczkowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały
Waterbath Sonicator	Bandelin	RK 52 H
Tip Sonicator	Hielscher Ultrasonics GmbH	UP50H
Zawór 2-drogowy	NResearch, West Caldwell, USA	NR225T011
Zawór końcowy	NResearch, West Caldwell, Stany Zjednoczone	NR225T031
Manometr	Greisinger elektronika	GDH 14 AN
Klatka Faradaya	Instytut Biofizyki
Kuweta	Max Planck Instytut Biofizyki
100 ml pojemniki na roztwór	Kartell	1623
O-ringi	Seal Science Inc.
Oscyloskop	Tektronix	TDS 1002
Elektroda referencyjna	Instytut Biofizyki
Generator funkcyjny	Instytut Biofizyki
Rurki	SAINT-GOBAIN Performance Plastics	AAC00006
Chip czujnika	Fraunhofer Institut fü r Schicht und Oberflä chentechnik
Skrzynka interfejsu	Max Planck Instytut Biofizyki
Wzmacniacz	Keithley	427
Ręczny zębatka	Vygon GmbH	876
Konwerter analogowo-cyfrowy USB	National Instruments	6009
Regeants
1,2‑ Difitanoilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina	Avanti Polar Lipids, Inc.
Akrylamid/Bis-akryloamid	Sigma	Aldrich A3574
Nadsiarczan amonu	Sigma Aldrich	A3678
D-(+)-glukoza	Sigma Aldrich	G8270
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	43819
Etanol absolut	VWR AnalaR NORMAPUR	603-002-00-5
Naturalny Ekstrakt polarny z lipidów E. coli	Avanti Polar Lipids, Inc.	100600	do rekonstytucji
laku n-dekan	Sigma Aldrich	D901
Octadecanethiol	Sigma Aldrich	O1858
Octadecylamine	Sigma Aldrich	74750
Chlorek potasu	Merck	1049360500
Fosforan potasu dwuzasadowy	Sigma Aldrich	P3786
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma Aldrich	P9791
Tetrametyloetylenodiamina	BIO RAD	1610801
&alfa;-laktoza jednowodna	Sigma Aldrich	L8783