Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE

Summary

Wysokoprzepustowa selektywna acylacja hydroksylowa 2' analizowana przez rozszerzenie startera (SHAPE) wykorzystuje nowatorską technologię sondowania chemicznego, odwrotną transkrypcję, elektroforezę kapilarną i oprogramowanie do przewidywania struktury drugorzędowej do określenia struktur RNA od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Abstract

Zrozumienie funkcji RNA biorącego udział w procesach biologicznych wymaga gruntownej znajomości struktury RNA. W tym celu metodologia nazwana "wysokoprzepustową selektywną acylacją hydroksylową 2' analizowaną przez wydłużenie startera" (SHAPE) umożliwia przewidywanie struktury drugorzędowej RNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Podejście to wykorzystuje chemiczne środki sondujące, które preferencyjnie acylują jednoniciowe lub elastyczne regiony RNA w roztworze wodnym. Miejsca modyfikacji chemicznej są wykrywane przez odwrotną transkrypcję zmodyfikowanego RNA, a produkty tej reakcji są frakcjonowane przez automatyczną elektroforezę kapilarną (CE). Ponieważ odwrotna transkryptaza zatrzymuje się na tych nukleotydach RNA zmodyfikowanych przez odczynniki SHAPE, powstała biblioteka cDNA pośrednio mapuje te rybonukleotydy, które są jednoniciowe w kontekście złożonego RNA. Za pomocą oprogramowania ShapeFinder elektroferogramy wytworzone przez zautomatyzowane CE są przetwarzane i przekształcane w tabele reaktywności nukleotydów, które z kolei są przekształcane w pseudoograniczenia energetyczne używane w algorytmie przewidywania RNAStructure (v5.3). Dwuwymiarowe struktury RNA uzyskane przez połączenie sondowania SHAPE z przewidywaniem struktury drugorzędowej RNA in silico okazały się znacznie dokładniejsze niż struktury uzyskane przy użyciu którejkolwiek z tych metod osobno.

Introduction

Aby zrozumieć funkcje katalitycznych i niekodujących RNA zaangażowanych w regulację splicingu, translacji, replikacji wirusa i raka, wymagana jest szczegółowa wiedza na temat struktury RNA^1,2. Niestety, dokładne przewidywanie fałdowania RNA stanowi ogromne wyzwanie. Klasyczne środki pomiarowe mają wiele wad, takich jak toksyczność, niepełne pokrycie nukleotydami i/lub przepustowość ograniczona do 100-150 nukleotydów na eksperyment. Podobnie niekorzystne są samodzielne algorytmy predykcji struktur drugorzędowych, ze względu na niedokładności wynikające z ich niemożności skutecznego rozróżnienia struktur zbliżonych energetycznie. W szczególności duże RNA są również często oporne na metody określania struktury 3D, takie jak krystalografia rentgenowska i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), ze względu na ich elastyczność konformacyjną i duże ilości wysoce czystych próbek wymaganych do tych technik.

Wysokoprzepustowy SHAPE rozwiązuje wiele z tych problemów, dostarczając skutecznego, prostego podejścia do badania struktur dużych RNA w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. Co więcej, odczynniki stosowane w SHAPE są bezpieczne, łatwe w obsłudze i, w przeciwieństwie do większości innych odczynników do sondowania chemicznego, reagują ze wszystkimi czterema rybonukleotydami. Odczynniki te mogą również przenikać przez błony komórkowe, umożliwiając sondowanie RNA w ich kontekście in vivo3. Pierwotnie opracowany w laboratorium Weeks⁴, SHAPE został wykorzystany do analizy szerokiej gamy RNA, z których najbardziej godnym uwagi przykładem jest określenie kompletnej struktury drugorzędowej genomu RNA HIV-1 o długości ~9 kb⁵. Inne godne uwagi osiągnięcia przy użyciu SHAPE obejmują wyjaśnienie struktur zakaźnych wiroidów⁶, ludzkich długich niekodujących RNA⁷, rybosomów drożdży⁸ i ryboprzełączników⁹, a także identyfikacja miejsc wiązania białek w RNA³ HIV-1 związanym z wirionem. Podczas gdy oryginalne i wysokoprzepustowe warianty protokołu SHAPE zostały opublikowane w innym miejscu^10-12, niniejsza praca zawiera szczegółowy opis oznaczania struktury drugorzędowej RNA za pomocą wysokoprzepustowego SHAPE przy użyciu fluorescencyjnych oligonukleotydów, analizatora genetycznego Beckman Coulter CEQ 8000 oraz oprogramowania SHAPEfinder i RNAStructure (v5.3). Uwzględniono również wcześniej niepublikowane szczegóły techniczne i porady dotyczące rozwiązywania problemów.

Wariacje KSZTAŁTU

Istotą SHAPE i jego odmian jest wystawienie RNA w roztworze wodnym na bezwodniki elektrofilowe, które selektywnie acylują grupy rybozy 2'-hydroksylowej (2'-OH), wytwarzając masywne addukty w miejscach modyfikacji. Ta reakcja chemiczna służy jako sposób na badanie lokalnej dynamiki strukturalnej RNA, ponieważ jednoniciowe nukleotydy są bardziej podatne na przyjęcie konformacji sprzyjających atakowi elektrofilowemu przez te odczynniki, podczas gdy nukleotydy sparowane z zasadami lub ograniczone architektonicznie są mniej lub niereaktywne¹⁰. Miejsca tworzenia adduktów są wykrywane przez odwrotną transkrypcję inicjowaną z fluorescencyjnie lub znakowanych radioaktywnie starterów hybrydyzowanych z określonym miejscem na zmodyfikowanym RNA (reakcja wydłużania startera "(+)"). Gdy odwrotna transkryptaza (RT) nie przechodzi przez acylowane rybonukleotydy, wytwarzana jest pula produktów cDNA, których długości pokrywają się z miejscami modyfikacji. Kontrolna reakcja wydłużania startera "(-)" z wykorzystaniem RNA, który nie został wystawiony na działanie odczynnika, jest również przeprowadzana tak, że przedwczesne zakończenie syntezy DNA (tj. "zatrzymanie") z powodu struktury RNA, niespecyficznego pęknięcia nici RNA itp., można odróżnić od pauzy spowodowanej modyfikacją chemiczną. Wreszcie, dwie reakcje sekwencjonowania dideoksy inicjowane z tych samych starterów są wykorzystywane jako markery do korelacji reaktywnych nukleotydów z pierwotną sekwencją RNA po elektroforezie.

W oryginalnym zastosowaniu SHAPE, ten sam ³²starter znakowany końcem P jest używany do (+), (-) i dwóch reakcji sekwencjonowania. Produkty tych reakcji są ładowane do sąsiednich studzienek w 5-8% żelu z poliakryloamidu i frakcjonowane przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym (PAGE; Rysunek 1). Analizę ilościową obrazów żeli wytwarzanych przez konwencjonalny SHAPE można przeprowadzić za pomocą SAFA, półautomatycznego oprogramowania do analizy śladów stóp¹³.

Dla kontrastu, wysokoprzepustowy SHAPE wykorzystuje fluorescencyjnie znakowane startery i automatyczną elektroforezę kapilarną. W szczególności, dla każdego badanego regionu RNA, należy zsyntetyzować lub zakupić zestaw czterech starterów DNA o wspólnej sekwencji, ale różnych znacznikach fluorescencyjnych 5'. Te różnie znakowane oligonukleotydy służą do zapoczątkowania dwóch reakcji SHAPE i dwóch reakcji sekwencjonowania, których produkty są łączone i frakcjonowane/wykrywane przez automatyczną elektroforezę kapilarną (CE). Podczas gdy profil reaktywności 100-150 nt RNA można uzyskać z zestawu czterech reakcji przy użyciu oryginalnego podejścia, wysokoprzepustowy SHAPE pozwala na rozdzielczość 300-600 nt z pojedynczej próbki zbiorczej³. Jednocześnie można frakcjonować do 8 zestawów reakcji, podczas gdy do frakcjonowania można przygotować aż 96 próbek w ciągu 12 kolejnych serii CE (rysunek 2). Co więcej, oprogramowanie SHAPEfinder, opracowane do przetwarzania i analizy danych pochodzących z CEQ i innych analizatorów genetycznych, jest bardziej zautomatyzowane i wymaga znacznie mniejszej interwencji użytkownika niż SAFA¹³ lub inne pakiety do analizy żelowej.

Ostatnio pojawiły się bardziej zaawansowane metodologie wysokoprzepustowe, takie jak PARS (równoległa analiza struktury RNA)¹⁴ i Frag-Seq (sekwencjonowanie fragmentów)¹⁵, które wykorzystują enzymy specyficzne dla struktury, a nie odczynniki alkilowacyjne w połączeniu z technikami sekwencjonowania nowej generacji w celu uzyskania informacji o strukturze RNA. Pomimo atrakcyjności tych technik, wiele ograniczeń związanych z sondowaniem nukleaz nadal pozostaje¹⁶. Problemy te można obejść w protokole sekwencjonowania SHAPE (SHAPE-Seq)¹⁷, w którym sekwencjonowanie nowej generacji jest poprzedzone modyfikacją chemiczną i odwrotną transkrypcją RNA w sposób podobny do tego, który odbywa się w konwencjonalnym SHAPE. Chociaż metody te mogą stanowić przyszłość określania struktury RNA, należy pamiętać, że sekwencjonowanie nowej generacji jest bardzo drogie i pozostaje niedostępne dla wielu laboratoriów.

SHAPE Analiza danych

Dane wytworzone w analizatorze genetycznym są prezentowane w formie elektroferogramu, w którym intensywność fluorescencji próbki (próbek) przepływających przez detektor kapilarny jest wykreślana w stosunku do wskaźnika czasu migracji. Wykres ten przyjmuje formę nakładających się na siebie śladów odpowiadających czterem kanałom fluorescencyjnym używanym do wykrywania różnych fluoroforów, przy czym każdy ślad składa się z pików odpowiadających poszczególnym cDNA lub produktom sekwencjonowania. Dane elektroferogramu są eksportowane z analizatora genetycznego jako plik tekstowy rozdzielany tabulatorami i importowane do oprogramowania do transformacji i analizy ShapeFinder¹⁸.

ShapeFinder jest początkowo używany do wykonywania serii matematycznych przekształceń danych, aby zapewnić, że czasy migracji i szczytowe objętości dokładnie odzwierciedlają odpowiednio tożsamość i ilości produktów reakcji. Piki są następnie wyrównywane i integrowane, a wyniki zestawiane w tabelach z pierwszorzędową sekwencją RNA. "Profil reaktywności" dla odpowiedniego segmentu RNA uzyskuje się poprzez odjęcie wartości kontrolnych od wartości (+) związanych z każdym nukleotydem RNA i normalizację danych w sposób opisany poniżej. Ten profil jest importowany do oprogramowania RNAstructure (v5.3)^19,20 , które przekształca znormalizowane wartości reaktywności na ograniczenia pseudoenergetyczne, które są włączone do algorytmu zwijania struktury drugorzędowej RNA. Połączenie w ten sposób algorytmów sondowania chemicznego i fałdowania znacznie poprawia dokładność przewidywania struktury w porównaniu z którąkolwiek z tych metod^12,21. Dane wyjściowe RNAstructure (v5.3) zawierają obrazy drugorzędowych struktur RNA o najniższej energii, oznaczone kolorami za pomocą profili reaktywności SHAPE, a także te same struktury w tekstowej notacji kropkowej. Te ostatnie mogą być następnie eksportowane do oprogramowania dedykowanego do graficznego przedstawiania drugorzędowej struktury RNA, takiego jak Varna²² i PseudoViewer²³.

Rysunek 1. Schemat blokowy oznaczania struktury RNA za pomocą SHAPE^4,10. (A) RNA można uzyskać z próbek biologicznych lub przez transkrypcję in vitro. (B) W zależności od źródła, RNA jest składane lub w inny sposób przetwarzane i modyfikowane odczynnikiem SHAPE. (C) Odwrotna transkrypcja przy użyciu starterów znakowanych fluorescencyjnie lub radioaktywnie. (D) produkty cDNA są frakcjonowane za pomocą elektroforezy na bazie żelu kapilarnego lub płytowego. (E) Analiza fragmentów. (F) Przewidywanie struktury RNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. Wysokoprzepustowy charakter SHAPE opartego na CE umożliwia szybką analizę wielu RNA i/lub wielu segmentów tego samego RNA. (A) Przedstawia, w jaki sposób RNA może być podzielony na sekcje 300-600 nt (oznaczone kolorami na zielono, niebiesko i czerwono) (B) Odcinki RNA są badane niezależnie przy użyciu różnych zestawów starterów fluorescencyjnych (czarne strzałki) (C) Zestawy reakcji są łączone i ładowane odpowiednio do studzienek A1, B1, C1 itd., zapewniając pełne pokrycie dla ~ 3 kb RNA1. Produkty reakcji z RNA 2, 3, 4 itd. mogą być podobnie przygotowane do frakcjonowania w kolejnych przebiegach elektroforetycznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Protocol

Projekt podkładu i rozszerzenie końca RNA 3'

Aby przeanalizować długie RNA za pomocą wysokoprzepustowego SHAPE, należy wybrać serię miejsc hybrydyzacji starterów tak, aby (i) były oddzielone od siebie o ~300 nt, (ii) miały 20-30 nt długości, oraz (iii) aby hybrydy RNA/DNA powstałe przez wyżarzanie DNA do tych miejsc miały oczekiwaną temperaturę topnienia >50 °C. Ponadto należy unikać segmentów RNA, co do których przewiduje się, że są wysoce ustrukturyzowane, chociaż dokonanie takiego określenia wymaga pewnej wiedzy na temat struktury RNA, która często jest niedostępna. Startery DNA, które hybrydyzują z tymi miejscami, powinny być następnie zaprojektowane, dbając o to, aby nie oczekiwać, że utworzą stabilne dimery lub wewnątrzniciowe struktury drugorzędowe.

Po zaprojektowaniu, zestawy starterów muszą być albo zakupione (np. od Integrated DNA Technologies, Ames, Iowa), albo zsyntetyzowane^24,25. Startery 5' oznaczone Cy5, Cy5.5, WellRedD2 (Beckman Coulter) i IRDye800 (Lycor) /WellRedD1 (Beckman Coulter) najlepiej nadają się do Beckman Coulter 8000 CEQ, zapewniając dobrą intensywność sygnału przy jednoczesnym zminimalizowaniu przesłuchów. Znakowane oligonukleotydy mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w małych podwielokrotnościach 10 μM w temperaturze -20 °C; Unikaj powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.

Korzystając z tak zaprojektowanych starterów, możliwe jest uzyskanie danych SHAPE dla praktycznie całego RNA o dowolnej długości. Jednak sekwencja na lub w pobliżu końca 3' RNA jest zawsze niedostępna dla SHAPE, chyba że RNA jest zaprojektowane tak, aby zawierało przedłużenie końcowe 3' (np. "kasetę struktury"), do której starter może być hybrydyzowany⁴.

Przygotowanie RNA za pomocą elektroforezy kapilarnej

Chociaż RNA z próbek biologicznych mogą być wykorzystywane do wysokoprzepustowego SHAPE, podany tutaj protokół jest zoptymalizowany pod kątem RNA wytwarzanego przez transkrypcję in vitro. Komercyjne zestawy do transkrypcji, takie jak MegaShortScript (Ambion) używane w połączeniu z kolumnami oczyszczającymi MegaClear RNA (Ambion), doskonale nadają się do generowania dużych ilości czystego RNA. RNA powinny być przechowywane w buforze TE w temperaturze od -20 °C do -80 °C. Aby uzyskać najlepsze wyniki, RNA powinny wydawać się jednorodne zarówno przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym denaturującym, jak i niedenaturującym.

1. Składanie RNA

1. W probówce do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml rozcieńczyć 12 pmol RNA do 18 μl wodą i dodać 2 μl 10-krotnego buforu renaturyzacyjnego. Dobrze wymieszaj.
2. Podgrzewać do 85 °C przez 1 minutę, a następnie schłodzić do 4 °C z szybkością 0,1 °C/sek.
3. Dodać 100 μl wody i 30 μl buforu składanego 5X.
4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30-60 minut, w zależności od fałdowanego RNA. Ogólnie rzecz biorąc, zależne od Mg²⁺ fałdowanie dłuższych i bardziej ustrukturyzowanych RNA wymaga dłuższego czasu inkubacji.
5. Przenieść podwielokrotność 72 μl do każdej z dwóch probówek mikrowirówek o pojemności 0,5 ml: zmodyfikowanej (+) i kontrolnej (-).

2. Modyfikacja chemiczna RNA

Dobrze scharakteryzowane, elektrofilowe odczynniki SHAPE obejmują bezwodnik izatoowy (IA), bezwodnik N-metyloosiatoowy (NMIA), bezwodnik 1-metylo-7-nitro-izatonowy (1M7)²⁶ i cyjanek benzoilu (BzCN)²⁷. Spośród nich najczęściej stosowanymi do wysokowydajnych SHAPE są 1M7 i NMIA, a tylko ten ostatni jest dostępny na rynku (Life Technologies). Końcowe stężenie odczynnika modyfikującego musi być zoptymalizowane dla każdego RNA, aby uzyskać kinetykę modyfikacji "pojedynczego trafienia", tj. stan, w którym większość RNA w roztworze jest modyfikowana raz w regionie analizowanego RNA¹¹. To optymalne stężenie można określić, przeprowadzając wiele reakcji, w których stężenie odczynnika zmienia się w zakresie wskazanym w tabeli w sekcji 2.1 poniżej. Należy użyć stężenia odczynnika, który wytwarza łatwo wykrywalny sygnał, jednocześnie minimalizując różnicę w intensywności sygnału między długimi i krótkimi produktami syntezy DNA (np. Rysunek 3).

Rysunek 3. Elektroferogramy SHAPE wykonane z ~360 nt RNA poddanego działaniu (A) 0 (B) 2,5 mM lub (C) 10 mM 1M7. Wszystkie elektroferogramy są wyświetlane w tej samej skali. Niebieskie, zielone, czerwone i czarne ślady odpowiadają odpowiednio (+) produktom reakcji (Cy5), (-) produktom reakcji (Cy5.5) i dwóm drabinkom sekwencjonowania (WellRed D2 i IRDye800). RNA użyte do wytworzenia obrazu (B) zostało potraktowane optymalną ilością 1M7, wykazując dobrą rozdzielczość i intensywność piku, przy minimalnym zaniku sygnału w całym śladzie (po lewej). W tych warunkach długość odczytu jest maksymalna. Natomiast brak średnich natężeń, dobrze rozdzielonych pików w (A) sugeruje nieoptymalne stężenie 1M7. I odwrotnie, zanik sygnału widoczny w (C) wskazuje, że kinetyka pojedynczego trafienia nie jest obserwowana, a RNA jest nadmiernie modyfikowany. W takich przypadkach, zwłaszcza gdy nie oczekuje się, że RT napotka koniec 5' matrycy RNA, długość odczytu będzie nieoptymalna.

1. Przygotuj 10-krotny zapas odczynnika SHAPE (NMIA lub 1M7). Najlepiej osiągnąć to poprzez dodanie niewielkiej ilości odczynnika do probówki z mikrofugą o pojemności 1,5 ml, a następnie dodanie DMSO w celu uzyskania pożądanego stężenia. uwaga: Roztwory odczynników SHAPE muszą pozostać bezwodne do momentu zmieszania z RNA. Przechowywać DMSO w eksykatorze w temperaturze pokojowej i przygotować roztwory podstawowe bezpośrednio przed użyciem, aby zminimalizować narażenie na parę wodną z otoczenia. Odczynnik Optymalne stężenie 10X (w DMSO) Czas do całkowitej degradacji odczynnika²⁷ Międzynarodowa Organizacja Górniczo- 10-100 mM ~20 min 1M7 10-50 mM 70 sekund
   Tabela 1. Odczynniki elektrofilowe stosowane do modyfikacji RNA.
   
2. Dodaj 8 μl 10X NMIA/1M7 lub bezwodnego DMSO odpowiednio do mieszanek modyfikowanych (+) i kontrolnych (-). Uwaga: Okazało się, że 2,5 mM jest skutecznym stężeniem początkowym zarówno dla NMIA, jak i 1M7, niezależnie od analizowanego RNA.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 50 minut (NMIA) lub 5 minut (1M7), w zależności od przypadku.
4. Wytrącić RNA, dodając 8 μl (0,1 obj.) 3 M NaOAc (pH 5,2), 8 μl 100 mM EDTA, 240 μl (3 obj.) zimnego etanolu i 1 μl 10 mg/ml glikogenu. Wstawić do lodówki na 2 godziny, a następnie odwirować przy 14 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Umyć granulat dwukrotnie zimnym 70% etanolem. uwaga: Ważne jest, aby zminimalizować czas chłodzenia, czas wirowania i prędkość w celu zminimalizowania współwytrącania soli, ponieważ może to niekorzystnie wpłynąć na rozdzielczość szczytową podczas elektroforezy.
5. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety i suszyć granulki na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
6. Wytrącony RNA rozpuścić w 10 μl buforu TE i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Jest to wystarczająca ilość rozpuszczonego RNA do dwóch reakcji odwrotnej transkrypcji. Niewykorzystaną porcję przechowywać w temperaturze -20 °C. Uwaga: Mechaniczne ponowne zawieszenie osadu zwykle nie jest konieczne i może uszkodzić RNA.

3. Odwrotna transkrypcja

Ten krok generuje znakowane fluorescencyjnie produkty cDNA, które są używane do pośredniego identyfikowania stopnia, w jakim nukleotydy RNA zostały zmodyfikowane przez odczynnik SHAPE. W przypadku SHAPE wydajność RT w indeksie górnym III (Invitrogen) była lepsza niż w przypadku wszystkich innych testowanych RT i jest to enzym wybrany do użycia z tym protokołem. Oligonukleotydy znakowane Cy5 i Cy5.5 są używane do przygotowania reakcji odpowiednio (+) i (-). W przypadku krótszych RNA, startery są hybrydyzowane do końcowego przedłużenia 3' natywnego RNA (np. "kasety strukturalnej") w celu uzyskania informacji o końcu 3'⁴. uwaga: Od tego momentu do CE próbki należy chronić przed światłem.

1. Przygotować próbki (+) i (-) do odwrotnej transkrypcji w probówkach do mikrokrówek o pojemności 0,5 ml. W przypadku reakcji (+) RT zmieszać 5 μl zmodyfikowanego RNA (+), 6 μl wody i 1 μl startera znakowanego Cy5 (10 μM); dla reakcji (-) RT zmieszać 5 μl kontrolnego RNA (-), 6 μl wody i 1 μl startera znakowanego Cy5 (10 μM). uwaga: Do tego zastosowania zalecane są probówki Sarstedt PCR (REF 72.735.002).
2. Umieścić probówki w termocyklerze i starterze wyżarzającym do RNA i przygotować do odwrotnej transkrypcji, stosując następujący program: 85 °C, 1 min; 60 °C, 5 min; 35 °C, 5 min; 50 °C, przytrzymać.
3. Na etapie wyżarzania należy przygotować wystarczającą ilość mieszanki 2,5X RT dla liczby reakcji, które mają być przeprowadzone, plus 50% (np. dla dwóch (+) i dwóch (-) reakcji skala 4,5-krotna). Jedna reakcja wymaga 8 μl, w następujący sposób: 4 μl 5x bufor RT, 1 μl 100 mM DTT, 1,5 μl wody, 1 μl 10 mM dNTP, 0,5 μl SuperScript III RT. Przechowywać na lodzie. Uwaga: 5X RT buffer i 100 mM DTT są dostarczane z SuperScript III RT.
4. Gdy temperatura mieszanin do wyżarzania osiągnie 50 °C, dodaj 8 μl mieszanki 2,5X RT do reakcji (+) i (-). zalecenie: Podgrzać mieszaninę RT do temperatury 37 °C przez 5 minut przed dodaniem jej do reakcji.
5. Inkubować przez 50 minut w temperaturze 50 °C, następnie schłodzić do 4 °C i/lub umieścić na lodzie. nuta: Inkubacja reakcji RT przez okres dłuższy niż 50 minut może prowadzić do powstania nieprawidłowych produktów cDNA.
6. Hydrolizę RNA poprzez dodanie 1 μl 4 M NaOH i ogrzewanie do 95 °C przez 3 min. Chłodzą reakcje na lodzie, a następnie neutralizujemy je dodając 2 μl 2 M HCl. Uwaga: Pominięcie tego kroku skutkuje złą jakością separacji produktów cDNA.
7. Połącz reakcje (+) i (-) i wytrącić cDNA, dodając 0,1 obj. 3 M NaOAc, 0,1 obj. 100 mM EDTA, 1,5 obj. zimnego etanolu i 1 μl 10 mg/ml glikogenu. Wstawić do lodówki na 2 godziny, następnie odwirować przy 14 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Umyć granulat dwukrotnie zimnym 70% etanolem. uwaga: Wirowanie z większą szybkością lub przez dłuższy czas powoduje trudności z ponownym zawieszeniem granulatu(ów).
8. Ponownie zawiesić granulowany cDNA w 40 μl dejonizowanego formamidu, podgrzewając do 65 °C przez 10 minut, a następnie energicznie wirując przez ponad 30 minut. Uwaga: Granulki mogą być niewidoczne. Brak sygnału lub słaby sygnał po elektroforezie może być wynikiem nieodpowiedniego rozpuszczenia osadu na tym etapie.

4. Przygotowanie drabiny sekwencjonowania

Drabinki sekwencjonowania służą jako markery do określania pozycji nukleotydów podczas przetwarzania danych. Są one generowane przy użyciu zestawu do sekwencjonowania cyklu USB (#78500), DNA o tej samej sekwencji co badane RNA i starterów znakowanych WellRed D2 lub D1/Lycor 800. Zazwyczaj DNA użyte w tej reakcji będzie używane jako matryca transkrypcyjna dla danego RNA. Chociaż przedstawiony tutaj protokół reakcji jest bardzo podobny do zalecanego przez producenta zestawu, reakcja jest kilkakrotnie skalowana. Podczas gdy ddA i ddT są używane jako terminatory łańcuchowe w reakcjach opisanych poniżej, dowolna para terminatorów może być użyta do wygenerowania drabinek sekwencjonowania.

1. Wymieszaj 40 μl mieszanki terminacyjnej ddA, 5 pmol matrycy DNA, 4,6 μl 10X buforu sekwenazy, 10 μl startera znakowanego WellRed D2, 4,6 μl sekwenazy i wody, aby uzyskać całkowitą objętość do 82 μl. Dodaj Sequenazę na końcu. Przygotuj drugą reakcję sekwencjonowania w ten sam sposób, używając zamiast tego ddT i startera znakowanego Licor IR800.
2. Przejdź do amplifikacji PCR w zalecanych warunkach USB. uwaga: Dodawanie oleju mineralnego nie jest wymagane ani zalecane w przypadku protokołów/termocyklerów, które wykorzystują podgrzewaną pokrywę.
3. Połącz reakcje sekwencjonowania ddA i ddT w jednej probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml (łącznie ~164 μl).
4. Wytrącić DNA w następujący sposób: Dodać 16 μl 3 M NaOAc (pH 5,2), 16 μl 100 mM EDTA, 1 μl 10 mg/ml glikogenu i 480 μl 95% etanolu. Dobrze wymieszać, inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut i odwirować w temperaturze 14 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
5. Zawiesić granulowany cDNA w 100 μl dejonizowanego formamidu, ogrzewając do 65 °C przez 10 minut, a następnie energicznie wirując przez co najmniej 30 minut.

5. Frakcjonowanie produktów reakcji metodą elektroforezy kapilarnej

Elektroforeza kapilarna umożliwia jednoczesne oddzielenie produktów syntezy cDNA z czterech reakcji połączonych w jedną próbkę. Osiem próbek może być frakcjonowanych jednocześnie, podczas gdy podczas jednego cyklu można frakcjonować nawet 96 próbek (rysunek 2).

1. Zmieszać 40 μl zbiorczych próbek SHAPE z 10 μl połączonych drabinek sekwencjonowania i przenieść na 96-dołkowe płytki do pobierania próbek. uwaga: Konieczne jest stosowanie odczynników i płytek Beckman Coulter (w tym żelu LPA-I, buforu bieżącego, oleju mineralnego, roztworu do ładowania próbki oraz płytek do pobierania próbek i) z analizatorem genetycznym Beckman-Coulter CEQ 8000.
2. Zaprogramuj i przygotuj przyrząd do elektroforezy kapilarnej i rozpocznij pracę zgodnie z instrukcjami producenta. nuta: W celu uzyskania najlepszej rozdzielczości próbek należy skorzystać z wcześniej opublikowanych parametrów metody CAFA²⁸.

Idealnie, poza pikami startera i silnego stopu, sygnały dla każdego piku we wszystkich czterech śladach elektroferogramu powinny mieścić się w zakresie liniowym; dopuszczalny jest stopniowy spadek sygnału. Zdarza się jednak, że nawet w reakcji kontrolnej widoczne są duże piki (zatrzymania), które mogą zakłócać późniejsze przetwarzanie danych. Skrócone cDNA, które powodują powstawanie tych pików, mogą być wynikiem naturalnej przeszkody podczas odwrotnej transkrypcji (np. struktury drugorzędowej RNA) lub degradacji RNA. W pierwszym przypadku dodatki, takie jak betaina, mogą poprawić procesywność RT i zmniejszyć pauzowanie RT/przedwczesne zakończenie.

Przetwarzanie danych

Oprogramowanie ShapeFinder pozwala użytkownikowi na wizualizację i przekształcanie śladów CE oraz przekształcanie ich w profile reaktywności SHAPE¹⁸. Po tabelaryzacji wartości reaktywności są one normalizowane i importowane do RNAStructure (wersja 5.3) w celu wygenerowania i uściślenia drugorzędnych modeli strukturalnych.

6. Oprogramowanie ShapeFinder

Rozszerzenie platformy przetwarzania śladów BaseFinder²⁹, opublikowana wersja ShapeFindera jest swobodnie dostępna do użytku niekomercyjnego¹⁸. Szczegółowe instrukcje dotyczące obsługi danych w ShapeFinder znajdują się w dokumentacji oprogramowania.

1. Elektroferogramy są importowane z CEQ do ShapeFindera, gdzie są dostosowywane w celu skorygowania (i) tła fluorescencyjnego, (ii) nakładania się widm między kanałami fluorescencyjnymi, (iii) przesunięć ruchliwości nadawanych przez różnie oznakowane startery, (iv) różnic w intensywności kwitnienia popularnych produktów znakowanych różnymi fluoroforami oraz (v) zaniku sygnału wynikającego z przedwczesnego zakończenia odwrotnej transkrypcji.
2. Funkcja "Setup" narzędzia "Align and Integrate" w ShapeFinder automatycznie przypisuje tożsamości do poszczególnych pików i koreluje je z sekwencją RNA zdefiniowaną przez użytkownika i dwiema drabinkami sekwencjonowania. Chociaż początkowe przypisania są na ogół niedoskonałe, błędy można skorygować ręcznie za pomocą funkcji "Modyfikuj" tego samego narzędzia. Na koniec funkcja "Fit" oblicza obszary pod wyrównanymi (+) i (-) pikami reakcji i zestawia te wartości reaktywności wraz z odpowiadającą im liczbą nukleotydów w pliku tekstowym rozdzielanym tabulatorami.

Uwaga: Analiza danych ma kluczowe znaczenie dla dokładności SHAPE, a niektóre kwestie są bardzo ważne podczas tej analizy, w tym:

• Sygnał do szumu: Stosunek sygnału do szumu musi być taki, aby poszczególne piki były łatwe do zidentyfikowania nawet w przypadku pozycji o niskiej reaktywności. Chociaż ShapeFinder zapewnia opcję wygładzania danych; Ta alternatywa powinna być stosowana bardzo ostrożnie, ponieważ może zniekształcić późniejszą analizę.
• Region analizy: Zazwyczaj wiarygodne dane można uzyskać z cDNA o długości 300-600 nt, zaczynając od obszaru oddalonego o 40-80 nt od końca startera 3', a kończąc na zaniku sygnału do poziomów trudnych do odróżnienia od szumu tła. Do analizy dłuższych odcinków RNA wymagane będzie użycie wielu zestawów starterów. W takim przypadku zaleca się, aby nakładanie się niezawodnego sygnału między zestawami starterów mieściło się w zakresie 30-50 nt. W przypadku krótszych RNA, w których odwrotna transkryptaza często dociera do końca matrycy RNA, należy zachować ostrożność, aby wykluczyć te piki, na których stosunek sygnału do szumu wpływa silne zatrzymanie syntezy DNA.
• Rozpad sygnału: Rozpad sygnału jest związany z zakresem modyfikacji RNA podczas eksperymentu, a także z niedoskonałą procesywnością RT. Idealnie byłoby, gdyby kinetyka pojedynczego trafienia w stosunku do analizowanego regionu RNA została osiągnięta w celu maksymalizacji długości odczytu. Shapefinder zawiera narzędzie, które jest skuteczne w korygowaniu zaniku sygnału; Ponieważ jednak ma to tendencję do wprowadzania błędu do analizy - zwłaszcza gdy nie obserwuje się kinetyki pojedynczego uderzenia, najlepiej jest ją stosować, gdy zanik sygnału jest minimalny (tj. gdy rozkład pików jest zgodny z kinetyką pojedynczego uderzenia). Ostatnio opublikowano ulepszone algorytmy przekształcania zaniku sygnału^sygnału30 i powinny być badane, jeśli zanik sygnału jest szczególnie niepokojący w danym eksperymencie.
• Skalowanie sygnału. Prawdopodobnie najbardziej arbitralnym krokiem w przetwarzaniu danych SHAPE, profil kontrolny powinien być skalowany tak, aby natężenia pików wśród minimalnie reaktywnych (+) i (-) ścieżek były równe. Zbyt duże przeskalowanie śladu kontrolnego spowoduje obfitość ujemnych wartości reaktywności w pierwszym kwartylu (patrz Normalizacja danych poniżej). W takim przypadku współczynnik skali powinien zostać odpowiednio zmniejszony, a dane ponownie zintegrowane.
• Przypisywanie szczytów. Ogólnie rzecz biorąc, automatyczna wersja przypisywania szczytów działa dobrze. Jednak gdy proces się nie powiedzie, konieczne jest, aby użytkownik upewnił się, że wszystkie szczyty zostały rozpoznane przez oprogramowanie, zwłaszcza gdy stosunek sygnału do szumu jest niski. Na przykład szczyty ramion nie zawsze są wykrywane, a sekwencje bogate w G są często skompresowane.

7. Normalizacja danych

Aby włączyć profile reaktywności nukleotydów do algorytmu struktury drugorzędowej używanego przez oprogramowanie RNAStructure (v5.3) i/lub porównać profile blisko spokrewnionych RNA, dane SHAPE muszą być znormalizowane w ustandaryzowany sposób¹². Obejmuje to (i) wykluczenie wartości odstających z kolejnych obliczeń, (ii) określenie "efektywnej maksimalnej" reaktywności (tj. średniej z najwyższych 8% wartości reaktywności, z wyłączeniem wartości odstających) oraz (iii) normalizację poprzez podzielenie wszystkich wartości reaktywności przez "efektywne maksimum" w następujący sposób:

1. Otwórz plik tekstowy rozdzielany tabulatorami wygenerowany po wyrównaniu i integracji, a następnie skopiuj jego zawartość do arkusza kalkulacyjnego Excel. Skrajna prawa kolumna tego pliku (RX.area-BG.area) zawiera obliczone bezwzględne wartości reaktywności SHAPE dla każdego nukleotydu RNA. Skrajne lewe kolumny odnoszą tę reaktywność do sekwencji RNA.
2. Oblicz i zapisz wartości pierwszego i trzeciego kwartyla (tj. 25. i 75. percentyla) dla (RX.area-BG.area) za pomocą funkcji programu Excel "=KWARTYL(tablica;kwarta)"
3. Oblicz i zapisz różnicę międzykwartylową "=KWARTYL(tablica, 3)-KWARTYL(tablica, 1)"
4. Oblicz i zapisz "wartość odstającą odstającą" za pomocą formuły "=(KWARTYL, tablica,3)+1.5*((KWARTYL(tablica,3)-KWARTYL(tablica,1))". Wszystkie wartości reaktywności większe od tej wartości należy wykluczyć z kolejnych obliczeń.
5. Skopiuj wartości reaktywności z (RX.area-BG.area) i wklej je do sąsiedniej, pustej kolumny, a następnie posortuj te wartości tak, aby największe z nich znajdowały się na górze kolumny.
6. W nowo utworzonej "kolumnie posortowanych wartości" usuń wartości większe niż wartość odstająca wartości odstające.
7. Oblicz i zapisz średnią z największych 8% pozostałych wartości reaktywności w "kolumnie posortowanych wartości". Wartość ta jest "efektywną maksimum" reaktywności.
8. Podziel nieposortowane (RX.area-BG.area) każdego nukleotydu (w tym wartości odstające) przez "efektywną maksimalną" wartość reaktywności, aby uzyskać "znormalizowane wartości reaktywności". Przechowuj je w pustej kolumnie, pozostawiając pustą kolumnę po lewej stronie. Następnie skopiuj numery nukleotydów po lewej stronie tabeli i wklej je do pustej kolumny bezpośrednio po lewej stronie "znormalizowanych wartości reaktywności".
9. Skopiuj i wklej pary wartości reaktywności znormalizowanej pozycji nukleotydu do edytora tekstu.
10. Wyeliminuj wartości poniżej -0,09 (tj. pozostaw puste miejsca), ponieważ są one prawdopodobnie wynikiem pauzy RT podczas syntezy cDNA z powodów innych niż chemiczna modyfikacja matrycy. Ponadto należy wykluczyć wszelkie wartości reaktywności nukleotydów, przy których obserwuje się silne pauzy na niezmodyfikowanym szablonie (określone przez oględziny profilu ShapeFindera "Align and Integrate").
11. Zapisz plik z rozszerzeniem .shape do użycia w analizie statyczno-wytrzymałościowej za pomocą oprogramowania RNAstructure (v5.3).

8. Modelowanie danych

RNAstructure (v5.3) oprogramowanie służy do przewidywania eksperymentalnie wspieranych struktur drugorzędowych RNA przy użyciu pseudo-swobodnych ograniczeń energetycznych pochodzących z analizy SHAPE¹⁹. Oprogramowanie zapewnia graficzną reprezentację struktur 2D RNA o najniższej energii, a także tekstową reprezentację tych struktur w notacji kropkowej. Te ostatnie można zaimportować do preferowanej przez użytkownika przeglądarki struktur RNA, np. Pseudoviewer²³ lub Varna²², w celu uzyskania obrazów o jakości publikacji.

Uwaga: Należy zachować ostrożność przy rozważaniu struktur wytwarzanych przez oprogramowanie RNAstructure (v5.3). Na przykład oprogramowanie nie jest w stanie rozwiązać interakcji trzeciorzędowych, takich jak pseudowęzły i pętle całowania, ani nie jest w stanie odróżnić, czy brak reaktywności w określonym regionie jest spowodowany parowaniem zasad, czy ochroną steryczną przez związane białka. W związku z tym czynniki te, wraz z energiami raportowanymi dla poszczególnych konstrukcji, muszą być brane pod uwagę przy przedstawianiu ostatecznego modelu konstrukcyjnego.

Results

RNA zawierające element odpowiedzi rev HIV-1 (RRE) i kasetę 3' o strukturze końcowej⁴ została przygotowana ze zlinearyzowanego plazmidu przez transkrypcję in vitro, po czym została złożona przez ogrzewanie, chłodzenie i inkubację w temperaturze 37 °C w obecności MgCl₂. RNA wystawiono na działanie NMIA, a następnie odwrócono transkrypcję ze znakowanego na końcu 5' startera DNA zhybrydyzowanego z kasetą o strukturze końcowej 3'. Uzyskana biblioteka cDNA SHAPE, wraz z reakcjami kontrolnymi i s...

Discussion

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół dla wysokoprzepustowego SHAPE, techniki, która umożliwia określenie struktury drugorzędowej z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu dla RNA o dowolnej wielkości. Co więcej, sprzężenie eksperymentalnych danych SHAPE z algorytmami przewidywania struktury drugorzędowej ułatwia generowanie modeli 2D RNA z większą dokładnością niż jest to możliwe w przypadku każdej z tych metod osobno. Połączenie znakowanych fluorescencyjnie starterów i zautomatyzowanego CE zapewnia znaczące korzyści...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ODCZYNNIKI
N-bezwodnik metylosiatoowy (NMIA)	Technologie życia	M25	Rozpuszczają się w bezwodnym bezwodniku
DMSO 1-metylo-t-nitroizatoowym (1M7)	patrz ref. 22
Indeks górny III Technologie odwrotnej transkryptazy	życiowej	18080044	10 000 jednostek
Zestaw do sekwencjonowania cyklu termosekwencjonazy	Affymetrix	78500
Materiały dostarczone przez użytkownika
RNA interesujące			6 pmol na reakcję (granica wykrywalności zostanie określona przez urządzenie)
Zestawy czterech starterów znakowanych 5' (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 i WellRed D1/Licor IR800)			Startery są komplementarne do RNA i są stosowane w reakcjach odwrotnej transkrypcji i sekwencjonowania. Wymienione fluorofory są optymalne dla Beckman Coulter 8000 CEQ. Podkłady można kupić lub zsyntetyzować we własnym zakresie.
Matryca			DNA jest używana do reakcji sekwencjonowania i musi zawierać sekwencję badanego RNA - w tym wszelkie 3'końcowe przedłużenie, jeśli jest obecne. W stosownych przypadkach często wygodnie jest użyć szablonu transkrypcji RNA.
10x Bufor			100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA
5X Bufor			200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (Ten bufor może być zmieniany w zależności od przypadku (np. pH, Inhibitor EDTA, Mg, RNazy)
2,5X RT mieszanina			4 μ l Bufor 5X, 1 i mu; l 100 mM naziemna telewizja cyfrowa, 1,5 i mu; l woda,1 μ l 10 mM dNTP, 0,5 i mu; l Indeks górny III. Należy pamiętać, że bufor 5X i 100 mM DTT są dostarczane z zakupem SuperScript III (Invitrogen).
Roztwór do ładowania próbek GenomeLab (Beckman Coulter)			Uwaga: Unikaj wielu cykli zamrażania i rozmrażania
SPRZĘTElektroforeza kapilarna Beckman CEQ8000 Thermocycler różni się