Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE

31.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50243

⸱

31 maja 2013

 ,  ,  ,  , 
1RT Biochemistry Section, HIV Drug Resistance Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Wysokoprzepustowa selektywna acylacja hydroksylowa 2' analizowana przez rozszerzenie startera (SHAPE) wykorzystuje nowatorską technologię sondowania chemicznego, odwrotną transkrypcję, elektroforezę kapilarną i oprogramowanie do przewidywania struktury drugorzędowej do określenia struktur RNA od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Streszczenie

Zrozumienie funkcji RNA biorącego udział w procesach biologicznych wymaga gruntownej znajomości struktury RNA. W tym celu metodologia nazwana "wysokoprzepustową selektywną acylacją hydroksylową 2' analizowaną przez wydłużenie startera" (SHAPE) umożliwia przewidywanie struktury drugorzędowej RNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Podejście to wykorzystuje chemiczne środki sondujące, które preferencyjnie acylują jednoniciowe lub elastyczne regiony RNA w roztworze wodnym. Miejsca modyfikacji chemicznej są wykrywane przez odwrotną transkrypcję zmodyfikowanego RNA, a produkty tej reakcji są frakcjonowane przez automatyczną elektroforezę kapilarną (CE). Ponieważ odwrotna transkryptaza zatrzymuje się na tych nukleotydach RNA zmodyfikowanych przez odczynniki SHAPE, powstała biblioteka cDNA pośrednio mapuje te rybonukleotydy, które są jednoniciowe w kontekście złożonego RNA. Za pomocą oprogramowania ShapeFinder elektroferogramy wytworzone przez zautomatyzowane CE są przetwarzane i przekształcane w tabele reaktywności nukleotydów, które z kolei są przekształcane w pseudoograniczenia energetyczne używane w algorytmie przewidywania RNAStructure (v5.3). Dwuwymiarowe struktury RNA uzyskane przez połączenie sondowania SHAPE z przewidywaniem struktury drugorzędowej RNA in silico okazały się znacznie dokładniejsze niż struktury uzyskane przy użyciu którejkolwiek z tych metod osobno.

Wprowadzenie

Aby zrozumieć funkcje katalitycznych i niekodujących RNA zaangażowanych w regulację splicingu, translacji, replikacji wirusów oraz nowotworów, wymagana jest szczegółowa wiedza na temat struktury RNA1,2. Niestety, dokładne przewidywanie fałdowania RNA stanowi ogromne wyzwanie. Klasyczne środki sondujące obarczone są wieloma wadami, takimi jak toksyczność, niepełne pokrycie nukleotydów i/lub wydajność ograniczona do 100-150 nukleotydów na eksperyment. Algorytmy przewidywania struktury drugorzędowej bez wsparcia doświadczalnego są podobnie nieefektywne ze względu na niedokładności wynikające z niezdolności do skutecznego rozróżniania struktur o podobnej energii. Duże cząsteczki RNA są szczególnie oporne na metody wyznaczania struktury 3D, takie jak krystalografia rentgenowska i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), ze względu na ich elastyczność konformacyjną oraz konieczność zastosowania dużych ilości próbek o wysokiej czystości w tych technikach.

Wysokoprzepustowa metoda SHAPE rozwiązuje wiele z tych problemów, zapewniając efektywne i proste podejście do badania struktur dużych cząsteczek RNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Co więcej, odczynniki stosowane w SHAPE są bezpieczne, łatwe w obsłudze i, w przeciwieństwie do większości innych odczynników do sondowania chemicznego, reagują ze wszystkimi czterema rybonukleotydami. Odczynniki te mogą również przenikać przez błony komórkowe, co umożliwia badanie RNA w kontekście in vivo3. Metoda SHAPE, opracowana pierwotnie w laboratorium Weeksa4, była wykorzystywana do analizy szerokiej gamy RNA, czego najbardziej znaczącym przykładem jest wyznaczenie pełnej struktury drugorzędowej genomu RNA HIV-1 o długości ok. 9 kb5. Inne istotne osiągnięcia z zastosowaniem SHAPE obejmują wyjaśnienie struktur zakaźnych wiroidów6, ludzkich długich niekodujących RNA7, rybosomów drożdżowych8 oraz ryboszaczy9, a także identyfikację miejsc wiązania białek w RNA HIV-1 związanym z wirionami3. Choć oryginalna i wysokoprzepustowa odmiany protokołu SHAPE zostały opublikowane w innych opracowaniach10-12, niniejsza praca dostarcza szczegółowego opisu wyznaczania struktury drugorzędowej RNA za pomocą wysokoprzepustowego SHAPE z wykorzystaniem fluorescencyjnych oligonukleotydów, analizatora genetycznego Beckman Coulter CEQ 8000 oraz oprogramowania SHAPEfinder i RNAStructure (v5.3). Uwzględniono również niepublikowane wcześniej szczegóły techniczne oraz wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów.

Warianty metody SHAPE

Istotą metody SHAPE i jej odmian jest poddanie RNA w roztworze wodnym działaniu bezwodników elektrofilowych, które selektywnie acylują grupy 2'-hydroksylowe (2'-OH) rybozy, tworząc rozbudowane addukty w miejscach modyfikacji. Reakcja chemiczna ta służy do badania lokalnej dynamiki strukturalnej RNA, ponieważ nukleotydy jednoniciowe są bardziej podatne na przyjmowanie konformacji sprzyjających atakowi elektrofilowemu tych odczynników, podczas gdy nukleotydy sparowane lub ograniczone architektonicznie są mniej reaktywne lub całkowicie nieaktywne10. Miejsca tworzenia adduktów wykrywa się poprzez odwrotną transkrypcję inicjowaną z fluorescencyjnie lub radiologicznie znakowanych starterów, zhybrydyzowanych ze specyficznym miejscem na zmodyfikowanym RNA (reakcja wydłużania startera „(+)”). Gdy odwrotna transkryptaza (RT) nie jest w stanie przejść przez acylowane rybonukleotydy, powstaje pula produktów cDNA, których długości odpowiadają miejscom modyfikacji. Przeprowadza się również kontrolną reakcję wydłużania startera „(–)” z wykorzystaniem RNA, które nie było poddane działaniu odczynnika, aby można było odróżnić przedwczesne przerwanie syntezy DNA (t.j. „zatrzymania”) wynikające ze struktury RNA, niespecyficznych pęknięć nici RNA itp., od zatrzymań spowodowanych modyfikacją chemiczną. Na koniec dwie reakcje sekwencjonowania dideoksy, inicjowane z tych samych starterów, służą jako markery do skorelowania reaktywnych nukleotydów z sekwencją pierwotną RNA po elektroforezie.

W pierwotnej aplikacji metody SHAPE ten sam starter z końcowym znakowaniem 32P jest wykorzystywany w reakcjach (+), (-) oraz w dwóch reakcjach sekwencjonowania. Produkty tych reakcji są nakładane do sąsiednich studzienek żelu płytkowego z poliakryloamidem 5-8% i frakcjonowane za pomocą denaturującej elektroforezy żelowej w poliakryloamidzie (PAGE; Rysunek 1). Analiza ilościowa obrazów żelu uzyskanych za pomocą konwencjonalnej metody SHAPE może być przeprowadzona przy użyciu SAFA, półautomatycznego oprogramowania do analizy footprintingu13.

W przeciwieństwie do tego, wysokoprzepustowy SHAPE wykorzystuje startery znakowane fluorescencyjnie oraz zautomatyzowaną elektroforezę kapilarną. Konkretnie, dla każdego badanego regionu RNA należy zsyntetyzować lub zakupić zestaw czterech starterów DNA o wspólnej sekwencji, ale różnych fluorescencyjnych znakowaniach na końcu 5'. Te różnie znakowane oligonukleotydy służą do inicjacji dwóch reakcji SHAPE i dwóch reakcji sekwencjonowania, których produkty są łączone i następnie frakcjonowane/wykrywane za pomocą zautomatyzowanej elektroforezy kapilarnej (CE). Podczas gdy profil reaktywności 100-150 nt RNA można uzyskać z zestawu czterech reakcji przy użyciu pierwotnego podejścia, wysokoprzepustowy SHAPE umożliwia rozdzielenie 300-600 nt z jednej połączonej próbki3. Jednocześnie można frakcjonować do 8 zestawów reakcji, natomiast w ciągu 12 następujących po sobie przebiegów CE można przygotować do frakcjonowania nawet 96 próbek (Rysunek 2). Co więcej, oprogramowanie SHAPEfinder, opracowane do przetwarzania i analizy danych pochodzących z analizatorów CEQ i innych analizatorów genetycznych, jest bardziej zautomatyzowane i wymaga znacznie mniejszej interwencji użytkownika niż SAFA13 lub inne pakiety do analizy żelowej.

W ostatnim czasie pojawiły się bardziej zaawansowane metodologie wysokoprzepustowe, takie jak PARS (równoległa analiza struktury RNA)14 oraz Frag-Seq (sekwencjonowanie fragmentów)15, które zamiast odczynników alkilujących wykorzystują enzymy specyficzne dla struktury w połączeniu z technikami sekwencjonowania następnej generacji w celu uzyskania informacji o strukturze RNA. Pomimo atrakcyjności tych technik, wciąż istnieją liczne ograniczenia właściwe dla sondowania nukleazami16. Problemy te można obejść w protokole sekwencjonowania SHAPE (SHAPE-Seq)17, w którym sekwencjonowaniu następnej generacji poprzedza modyfikacja chemiczna i odwrotna transkrypcja RNA w sposób podobny do tego, który stosuje się w konwencjonalnym SHAPE. Chociaż metody te mogą stanowić przyszłość wyznaczania struktury RNA, należy pamiętać, że sekwencjonowanie następnej generacji jest bardzo kosztowne i pozostaje niedostępne dla wielu laboratoriów.

Analiza danych SHAPE

Dane uzyskane w analizatorze genetycznym są przedstawione w formie elektroferogramu, w którym intensywność fluorescencji próbki lub próbek przepływających przez detektor kapilarny jest wykreślona w funkcji czasu migracji. Wykres ten przyjmuje postać nakładających się śladów odpowiadających czterem kanałom fluorescencji wykorzystywanym do wykrywania różnych fluoroforów, gdzie każdy ślad składa się z pików odpowiadających poszczególnym produktom cDNA lub produktom sekwencjonowania. Dane z elektroferogramu są eksportowane z analizatora genetycznego jako plik tekstowy z separatorami tabulatorami, a następnie importowane do oprogramowania do transformacji i analizy ShapeFinder18.

Oprogramowanie ShapeFinder jest początkowo wykorzystywane do przeprowadzenia serii transformacji matematycznych na danych, aby zapewnić, że czasy migracji i objętości pików dokładnie odzwierciedlają odpowiednio tożsamość oraz ilość produktów reakcji. Następnie piki są dopasowywane i całkowane, a wyniki zestawione w tabeli wraz z pierwotną sekwencją RNA. „Profil reaktywności” dla odpowiedniego segmentu RNA uzyskuje się poprzez odjęcie wartości kontrolnych od wartości (+), powiązanych z każdym nukleotydem RNA, oraz normalizację danych zgodnie z opisem poniżej. Profil ten jest importowany do oprogramowania RNAstructure (v5.3)19,20, które przekształca znormalizowane wartości reaktywności w pseudo-ograniczenia energetyczne, włączane do algorytmu zwijania drugorzędowej struktury RNA. Połączenie sondowania chemicznego z algorytmami zwijania w ten sposób znacząco poprawia dokładność przewidywania struktury w porównaniu do stosowania każdej z tych metod z osobna12,21. Wynik działania programu RNAstructure (v5.3) obejmuje obrazy drugorzędowych struktur RNA o najniższej energii, zakodowane kolorystycznie zgodnie z profilem(ami) reaktywności SHAPE, a także te same struktury zapisane w tekstowej notacji kropka-nawias (dot-bracket notation). Te ostatnie mogą być następnie eksportowane do oprogramowania przeznaczonego do graficznej prezentacji drugorzędowej struktury RNA, takiego jak Varna22 i PseudoViewer23.

Schemat analizy struktury RNA; transkrypcja in vitro, analiza żelowa, wysokoprzepustowa metoda SHAPE.
Rysunek 1. Schemat blokowy wyznaczania struktury RNA za pomocą metody SHAPE4,10. (A) RNA może zostać pozyskane z próbek biologicznych lub poprzez transkrypcję in vitro. (B) W zależności od źródła, RNA jest fałdowane lub w inny sposób przetwarzane, a następnie modyfikowane odczynnikiem SHAPE. (C) Odwrotna transkrypcja z wykorzystaniem starterów znakowanych fluorescencyjnie lub radioaktywnie. (D) Produkty cDNA są frakcjonowane za pomocą elektroforezy kapilarnej lub żelowej na płytkach. (E) Analiza fragmentów. (F) Przewidywanie struktury RNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Schematyczny rysunek struktury RNA; obejmuje strukturę drugorzędową i układ mikromacierzy do analizy.
Rysunek 2. Wysokoprzepustowy charakter metody SHAPE opartej na CE pozwala na szybką analizę wielu cząsteczek RNA i/lub wielu segmentów tej samej cząsteczki RNA. (A) Przedstawia sposób podziału RNA na sekcje o długości 300-600 nt (oznaczone kolorami zielonym, niebieskim i czerwonym) (B) Sekcje RNA są badane niezależnie przy użyciu różnych zestawów starterów fluorescencyjnych (czarne strzałki) (C) Zestawy reakcji są łączone i naniesione odpowiednio do studni A1, B1, C1 itd, zapewniając pełne pokrycie dla RNA1 o długości ~3 kb. Produkty reakcji z RNA 2, 3, 4 itd. mogą być przygotowane w podobny sposób do frakcjonowania w kolejnych przebiegach elektroforetycznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Projektowanie starterów i wydłużanie końca 3' RNA

Aby przeanalizować długie cząsteczki RNA za pomocą wysokoprzepustowej metody SHAPE, należy wybrać serię miejsc hybrydyzacji starterów w taki sposób, aby (i) były one oddalone od siebie o ok. 300 nt, (ii) miały długość 20-30 nt oraz (iii) hybrydy RNA/DNA powstające w wyniku przyłączania DNA do tych miejsc miały przewidywaną temperaturę topnienia >50 °C. Ponadto należy unikać segmentów RNA, o których się przypuszcza, że posiadają silną strukturę drugorzędową, choć ustalenie tego wymaga pewnej wiedzy na temat struktury RNA, która często nie jest dostępna. Następnie należy zaprojektować startery DNA hybrydyzujące z tymi miejscami, dbając o to, aby nie tworzyły one stabilnych dimerów ani wewnątrzniciowych struktur drugorzędowych.

Po zaprojektowaniu zestawy starterów muszą zostać zakupione (np. z Integrated DNA Technologies, Ames, Iowa) lub zsyntetyzowane24,25. Startery znakowane na końcu 5' barwnikami Cy5, Cy5.5, WellRedD2 (Beckman Coulter) oraz IRDye800 (Lycor) / WellRedD1 (Beckman Coulter) najlepiej nadają się do systemu Beckman Coulter 8000 CEQ, zapewniając dobrą intensywność sygnału przy jednoczesnym zminimalizowaniu przesłuchów (crosstalk). Znakowane oligonukleotydy można przechowywać bezterminowo w małych alikwotach o stężeniu 10 μM w temperaturze -20 °C; należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.

Dzięki zastosowaniu starterów zaprojektowanych w ten sposób możliwe jest uzyskanie danych SHAPE dla praktycznie całej cząsteczki RNA o dowolnej długości. Jednakże sekwencja w obrębie lub w pobliżu końca 3' RNA jest zawsze niedostępna dla metody SHAPE, chyba że RNA zostanie zmodyfikowane tak, aby zawierało rozszerzenie końca 3' (np. „kasetę strukturalną”), do której można zhybrydyzować starter4.

Przygotowanie RNA za pomocą elektroforezy kapilarnej

Chociaż RNA z próbek biologicznych mogą być wykorzystane do wysokoprzepustowego SHAPE, przedstawiony tutaj protokół został zoptymalizowany dla RNA otrzymywanego w drodze transkrypcji in vitro. Komercyjne zestawy do transkrypcji, takie jak MegaShortScript (Ambion), stosowane wraz z kolumnami do oczyszczania RNA MegaClear (Ambion), są odpowiednie do generowania dużych ilości czystego RNA. RNA należy przechowywać w buforze TE w temperaturze od -20 °C do -80 °C. Dla uzyskania najlepszych wyników RNA powinny wydawać się homogeniczne zarówno w denaturującej, jak i niedenaturującej elektroforezie w żelu poliakrylamidowym.

1. Fałdowanie RNA

  1. W probówce do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml rozcieńczyć 12 pmol RNA do objętości 18 μl wodą i dodać 2 μl 10X buforu do renaturacji. Dobrze wymieszać.
  2. Podgrzać do 85 °C przez 1 min, a następnie schłodzić do 4 °C z szybkością 0,1 °C/sec.
  3. Dodać 100 μl wody i 30 μl 5X buforu do zwijania.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30-60 min, w zależności od zwijanego RNA. Zasadniczo zwijanie dłuższych i bardziej ustrukturyzowanych cząsteczek RNA zależne od Mg2+ wymaga dłuższego czasu inkubacji.
  5. Przenieść alikwot o objętości 72 μl do każdej z dwóch probówek do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml: zmodyfikowanej (+) oraz kontrolnej (-).

2. Modyfikacja chemiczna RNA

Do dobrze scharakteryzowanych elektrofilnych odczynników SHAPE należą bezwodnik izatoowy (IA), bezwodnik N-metyloizatoowy (NMIA), 1-metylo-7-nitro-bezwodnik izatoowy (1M7)26 oraz cyjanek benzoilu (BzCN)27. Z tych odczynników do wysokoprzepustowego SHAPE najczęściej stosuje się 1M7 i NMIA, przy czym tylko ten drugi jest dostępny komercyjnie (Life Technologies). Końcową stężenie odczynnika modyfikującego musi zostać zoptymalizowane dla każdego RNA, aby uzyskać kinetykę modyfikacji typu „single-hit”, t.j. warunek, w którym większość cząsteczek RNA w roztworze zostaje zmodyfikowana raz w analizowanym regionie RNA11. Optymalne stężenie można wyznaczyć, przeprowadzając wiele reakcji, w których stężenie odczynnika jest zmieniane w zakresach wskazanych w tabeli w sekcji 2.1 poniżej. Należy zastosować takie stężenie odczynnika, które daje łatwo wykrywalny sygnał, minimalizując jednocześnie różnicę w intensywności sygnału między długimi a krótkimi produktami syntezy DNA (np. Rysunek 3).

Wyniki chromatografii; analiza efektów stężenia 1M7; dane dotyczące oczyszczania białek.
Rycina 3. Elektroferogramy SHAPE otrzymane z RNA o długości ~360 nt traktowanego (A) 0 (B) 2,5 mM lub (C) 10 mM 1M7. Wszystkie elektroferogramy przedstawiono w tej samej skali. Ślady niebieski, zielony, czerwony i czarny odpowiadają odpowiednio produktom reakcji (+) (Cy5), produktom reakcji (-) (Cy5.5) oraz dwóm drabinom sekwencyjnym (WellRed D2 i IRDye800). RNA użyte do uzyskania obrazu (B) zostało poddane działaniu optymalnej ilości 1M7, co objawia się dobrą rozdzielczością i intensywnością pików, przy minimalnym zaniku sygnału w całym przebiegu (po lewej). W tych warunkach długość odczytu jest maksymalna. W przeciwieństwie do tego, brak pików o średniej intensywności i dobrej rozdzielczości w (A) sugeruje podoptymalne stężenie 1M7. Z kolei zanik sygnału widoczny w (C) wskazuje, że nie zaobserwowano kinetyki pojedynczego trafienia (single hit kinetics), a RNA zostało nadmiernie zmodyfikowane. W takich przypadkach, szczególnie gdy nie spodziewamy się, że RT napotka koniec 5' matrycy RNA, długość odczytu będzie podoptymalna.

  1. Przygotuj 10-krotny roztwór zapasowy odczynnika SHAPE (NMIA lub 1M7). Najlepiej zrobić to, dodając niewielką ilość odczynnika do probówki do wirówki o pojemności 1,5 ml, a następnie dodając DMSO do uzyskania pożądanej koncentracji. Uwaga: Roztwory reagentów SHAPE muszą pozostać bezwodne aż do momentu zmieszania z RNA. DMSO należy przechowywać w deskryptorze w temperaturze pokojowej, a roztwory robocze przygotowywać bezpośrednio przed użyciem, aby zminimalizować kontakt z parą wodną z otoczenia.
    OdczynnikOptymalne stężenie 10X (w DMSO)Czas całkowitej degradacji odczynnika27
    NMIA10-100 mMok. 20 min
    1M710-50 mM70 s

    Tabela 1. Odczynniki elektrofilowe stosowane do modyfikacji RNA.
  2. Dodaj 8 μl 10X NMIA/1M7 lub bezwodny DMSO do odpowiednio zmodyfikowanych mieszanin (+) i mieszanin kontrolnych (-). Uwaga: Stężenie 2,5 mM okazało się skutecznym stężeniem początkowym zarówno dla NMIA, jak i 1M7, niezależnie od analizowanego RNA.
  3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 50 min (NMIA) lub 5 min (1M7), w zależności od zastosowania.
  4. Wytrącenie RNA poprzez dodanie 8 μl (0,1 obj.) 3 M NaOAc (pH 5,2), 8 μl 100 mM EDTA, 240 μl (3 obj.) zimnego etanolu i 1 μl 10 mg/ml glikogenu. Przechowywać w lodówce przez 2 h, a następnie wirować przy 14 000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °CPrzemyć osad dwukrotnie zimnym 70% etanolem. Uwaga: Ważne jest ograniczenie czasu chłodzenia oraz czasu i prędkości wirowania w celu zminimalizowania współstrącania soli, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na rozdzielczość piku podczas elektroforezy.
  5. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety i suszyć osad na powietrzu przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  6. Rozpuścić wytrącone RNA w 10 μl bufor TE i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej. Taka ilość rozpuszczonego RNA jest wystarczająca do przeprowadzenia dwóch reakcji odwrotnej transkrypcji. Niewykorzystaną część przechowywać w temperaturze -20 °C. Uwaga: Mechaniczne resuspensowanie osadu zazwyczaj nie jest konieczne i może doprowadzić do uszkodzenia RNA.

3. Odwrotna transkrypcja

Ten krok pozwala na otrzymanie fluorescencyjnie znakowanych produktów cDNA, które służą do pośredniego określenia stopnia modyfikacji nukleotydów RNA przez odczynnik SHAPE. W przypadku metody SHAPE wydajność odwrotnej transkrypcji (RT) z użyciem Superscript III (Invitrogen) była wyższa niż we wszystkich innych przetestowanych enzymach RT, dlatego wybrano go do zastosowania w niniejszym protokole. Do inicjacji reakcji (+) i (-) stosuje się odpowiednio oligonukleotydy znakowane Cy5 oraz Cy5.5. W przypadku krótszych cząsteczek RNA primery hybrydyzowane są z 3'-końcowym przedłużeniem natywnego RNA (np. „kaseta strukturalna”), aby uzyskać informacje o końcu 3'4. Uwaga: Od tego momentu aż do elektroforezy kapilarnej (CE) próbki powinny być chronione przed światłem.

  1. Przygotować próbki (+) i (-) do odwrotnej transkrypcji w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 ml. W przypadku reakcji RT (+), zmieszać 5 μl zmodyfikowanego RNA (+), 6 μl wody i 1 μl startera znakowanego Cy5 (10 μM); w przypadku reakcji RT (-), zmieszać 5 μl kontrolnego RNA (-), 6 μl wody i 1 μl startera znakowanego Cy5 (10 μM). Uwaga: do tej aplikacji zaleca się stosowanie probówek PCR Sarstedt (REF 72.735.002).
  2. Umieścić probówki w termocyklerze, przeprowadzić hybrydyzację startera z RNA i przygotować do odwrotnej transkrypcji, stosując następujący program: 85 °C, 1 min; 60 °C, 5 min; 35 °C, 5 min; 50 °C, hold.
  3. Podczas etapu hybrydyzacji przygotować odpowiednią ilość 2,5X mieszaniny RT dla liczby planowanych reakcji, zwiększając objętość o 50% (np. dla dwóch reakcji (+) i dwóch reakcji (-) zwiększyć skalę 4,5-krotnie). Jedna reakcja wymaga 8 μl mieszaniny, składającej się z: 4 μl buforu RT 5x, 1 μl 100 mM DTT, 1,5 μl wody, 1 μl 10 mM dNTPs i 0,5 μl SuperScript III RT. Przechowywać w lodzie. Uwaga: bufor RT 5X oraz 100 mM DTT są dostarczane wraz z SuperScript III RT.
  4. Gdy temperatura mieszanin hybrydyzacyjnych osiągnie 50 °C, dodać 8 μl 2,5X mieszaniny RT do reakcji (+) i (-). Zalecenie: przed dodaniem do reakcji podgrzać mieszaninę RT do 37 °C przez 5 min.
  5. Inkubować przez 50 min w temperaturze 50 °C, następnie schłodzić do 4 °C i/lub umieścić w lodzie. Uwaga: inkubacja reakcji RT przez czas dłuższy niż 50 min może prowadzić do powstania aberrantnych produktów cDNA.
  6. Zhydrolyzować RNA, dodając 1 μl 4 M NaOH i podgrzewając do 95 °C przez 3 min. Schłodzić reakcje w lodzie, a następnie zneutralizować je, dodając 2 μl 2 M HCl. Uwaga: pominięcie tego kroku skutkuje niską jakością rozdziału produktów cDNA.
  7. Połączyć reakcje (+) i (-) i wytrącić cDNA, dodając 0,1 obj. 3 M NaOAc, 0,1 obj. 100 mM EDTA, 1,5 obj. zimnego etanolu oraz 1 μl glikogenu w stężeniu 10 mg/ml. Przechowywać w lodówce przez 2 h, a następnie wirować przy 14 000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C. Przeć zpelletowane cDNA dwukrotnie zimnym 70% etanolem. Uwaga: wirowanie przy wyższych prędkościach lub przez dłuższy czas powoduje trudności z resuspensją pelletu.
  8. Resuspender pellet cDNA w 40 μl dejonizowanej formamidy, podgrzewając do 65 °C przez 10 min, a następnie energicznie mieszając na wortexie przez ponad 30 min. Uwaga: pellety mogą być niewidoczne. Brak sygnału lub słaby sygnał po elektroforezie może być wynikiem nieprawidłowego rozpuszczenia pelletu na tym etapie.

4. Przygotowanie drabinki sekwencyjnej

Drabinki sekwencyjne służą jako markery do wyznaczania pozycji nukleotydów podczas przetwarzania danych. Są one generowane przy użyciu zestawu USB Cycle Sequencing (#78500), DNA o tej samej sekwencji co badane RNA oraz starterów znakowanych WellRed D2 lub D1/Lycor 800. Zazwyczaj w tej reakcji wykorzystuje się DNA, które służyło jako matryca transkrypcyjna dla analizowanego RNA. Chociaż protokół reakcji przedstawiony tutaj ściśle odpowiada zaleceniom producenta zestawu, skala reakcji została zwiększona kilkukrotnie. Choć w opisanych poniżej reakcjach jako terminatory łańcucha zastosowano ddA i ddT, do wygenerowania drabinek sekwencyjnych można użyć dowolnej pary terminatorów.

  1. Wymieszać 40 μl mieszaniny terminacyjnej ddA, 5 pmol matrycy DNA, 4,6 μl buforu Sequenase 10X, 10 μl startera znakowanego WellRed D2, 4,6 μl enzymu Sequenase oraz wodę, aby osiągnąć całkowitą objętość 82 μl. Sequenase dodać na samym końcu. W ten sam sposób przygotować drugą reakcję sekwencjonowania, wykorzystując zamiast tego ddT i starter znakowany Licor IR800.
  2. Przeprowadzić amplifikację PCR zgodnie z warunkami zalecanymi przez USB. Uwaga: Dodawanie oleju mineralnego nie jest wymagane ani zalecane w przypadku protokołów/termocyklerów z podgrzewaną pokrywą.
  3. Połączyć reakcje sekwencjonowania ddA i ddT w jednej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml (łącznie ok. 164 μl).
  4. Wytrącić DNA w następujący sposób: dodać 16 μl 3 M NaOAc (pH 5,2), 16 μl 100 mM EDTA, 1 μl glikogenu 10 mg/ml oraz 480 μl 95% etanolu. Dobrze wymieszać, inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 min, a następnie wirować przy 14 000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C.
  5. Resuspender osad cDNA w 100 μl dejonizowanej formamidy poprzez ogrzewanie do 65 °C przez 10 min, a następnie intensywne mieszanie w wirówce typu vortex przez co najmniej 30 min.

5. Frakcjonowanie produktów reakcji za pomocą elektroforezy kapilarnej

Elektroforeza kapilarna umożliwia jednoczesną separację produktów syntezy cDNA z czterech reakcji połączonych w jednej próbce. Jednocześnie można frakcjonować osiem próbek, natomiast podczas jednego przebiegu można przeanalizować do 96 próbek (Rysunek 2).

  1. Wymieszać 40 μl połączonych próbek SHAPE z 10 μl połączonych drabinek sekwencyjnych i przenieść do płytek 96-dołkowych na próbki. Uwaga: Niezbędne jest stosowanie odczynników i płytek firmy Beckman Coulter (w tym żelu LPA-I, buforu do elektroforezy, oleju mineralnego, roztworu do ładowania próbek oraz płytek na próbki i bufory) z analizatorem genetycznym Beckman-Coulter CEQ 8000.
  2. Zaprogramować i przygotować urządzenie do elektroforezy kapilarnej, a następnie rozpocząć analizę zgodnie z instrukcjami producenta. Uwaga: Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość próbek, należy zastosować wcześniej opublikowane parametry metody CAFA28.

W idealnym przypadku, poza pikami starterów i pikami stop-strong, sygnały dla każdego piku we wszystkich czterech śladach elektroferogramu powinny znajdować się w zakresie liniowym; dopuszczalny jest stopniowy spadek sygnału. Czasami jednak duże piki (stop) są widoczne nawet w reakcji kontrolnej i mogą one zakłócać późniejsze przetwarzanie danych. Przecięte cDNA, które dają początek tym pikom, mogą być wynikiem naturalnej przeszkody podczas odwrotnej transkrypcji (np. struktury drugorzędowej RNA) lub degradacji RNA. W pierwszym przypadku dodatki takie jak betaina mogą poprawić procesywność RT i zmniejszyć liczbę zatrzymań/przedwczesnych terminacji RT.

Przetwarzanie danych

Oprogramowanie ShapeFinder pozwala użytkownikowi na wizualizację i przekształcanie śladów CE oraz konwersję ich na profile reaktywności SHAPE18. Po zestawieniu wartości reaktywności w tabelach, zostają one znormalizowane i zaimportowane do programu RNAStructure (v5.3) w celu wygenerowania i doprecyzowania modeli struktury drugorzędowej.

6. Oprogramowanie ShapeFinder

Rozszerzona wersja platformy do przetwarzania śladów BaseFinder29, publikowana wersja ShapeFinder, jest dostępna bezpłatnie do użytku niekomercyjnego18. Szczegółowe instrukcje dotyczące obsługi danych w programie ShapeFinder znajdują się w dokumentacji oprogramowania.

  1. Elektroferogramy są importowane z systemu CEQ do programu ShapeFinder, gdzie poddawane są korekcie w celu niwelowania (i) tła fluorescencyjnego, (ii) nakładania się widm między kanałami fluorescencyjnymi, (iii) przesunięć mobilności wynikających z zastosowania różnych primerów z tagami, (iv) różnic w intensywności fluorescencji wspólnych produktów znakowanych różnymi fluoroforami oraz (v) spadku sygnału spowodowanego przedwczesnym przerwaniem transkrypcji odwrotnej.
  2. Funkcja „Setup” narzędzia „Align and Integrate” w programie ShapeFinder automatycznie przypisuje tożsamość poszczególnym pikiom i koreluje je z sekwencją RNA zgodnie z danymi wprowadzonymi przez użytkownika oraz dwiema drabinami sekwencyjnymi. Choć początkowe przypisania są zazwyczaj niedoskonałe, błędy można poprawić ręcznie za pomocą funkcji „Modify” tego samego narzędzia. Na koniec funkcja „Fit” oblicza pola pod wyrównanymi pikiami reakcji (+) i (-), a następnie zestawia te wartości reaktywności wraz z odpowiadającymi im numerami nukleotydów w pliku tekstowym rozdzielanym tabulatorami.

Uwaga: Analiza danych ma krytyczne znaczenie dla dokładności metody SHAPE, a podczas tej analizy bardzo istotne są niektóre kwestie, w tym:

  • Stosunek sygnału do szumu: Stosunek sygnału do szumu musi być taki, aby poszczególne piki były łatwo identyfikowalne nawet w pozycjach o niskiej reaktywności. Chociaż ShapeFinder oferuje opcję wygładzania danych, z tej alternatywy należy korzystać niezwykle ostrożnie, ponieważ może ona zniekształcić późniejszą analizę.
  • Obszar analizy: Zazwyczaj wiarygodne dane można uzyskać z cDNA o długości 300-600 nt, zaczynając od regionu oddalonego o 40-80 nt od końca 3' primera i kończąc w miejscu, gdzie sygnał zanika do poziomów trudnych do odróżnienia od szumu tła. Do analizy dłuższych odcinków RNA wymagane będzie zastosowanie wielu zestawów primerów. W takim przypadku zaleca się, aby pokrycie wiarygodnego sygnału między zestawami primerów mieściło się w zakresie 30-50 nt. W przypadku krótszych cząsteczek RNA, w których odwrotna transkryptaza często dociera do końca matrycy RNA, należy pamiętać o wykluczeniu tych pików, których stosunek sygnału do szumu jest zaburzony przez silne zatrzymanie syntezy DNA.
  • Zanik sygnału: Zanik sygnału wiąże się ze stopniem modyfikacji RNA podczas eksperymentu, a także z niedoskonałą procesywnością RT. Idealnie byłoby osiągnąć kinetykę pojedynczego uderzenia (single-hit kinetics) w odniesieniu do analizowanego regionu RNA, aby zmaksymalizować długość odczytu. Shapefinder zawiera narzędzie skuteczne w korygowaniu zaniku sygnału; jednak ze względu na to, że ma ono tendencję do wprowadzania błędów do analizy – szczególnie gdy nie obserwuje się kinetyki pojedynczego uderzenia – najlepiej stosować je, gdy zanik sygnału jest minimalny (i.e., gdy rozkład pików jest zgodny z kinetyką pojedynczego uderzenia). Ostatnio opublikowano ulepszone algorytmy transformacji zaniku sygnału30, które należy rozważyć, jeśli zanik sygnału stanowi istotny problem w danym eksperymencie.
  • Skalowanie sygnału. Prawdopodobnie najbardziej arbitralny etap przetwarzania danych SHAPE; profil kontrolny powinien zostać przeskalowany tak, aby intensywności pików w śladach o minimalnej reaktywności (+) i (-) były równe. Zbyt silne skalowanie śladu kontrolnego doprowadzi do nadmiaru ujemnych wartości reaktywności w pierwszym kwartylu (patrz: Normalizacja danych poniżej). W takim przypadku należy odpowiednio zmniejszyć czynnik skalujący i ponownie zintegrować dane.
  • Przypisywanie pików. Generalnie zautomatyzowana wersja przypisywania pików działa dobrze. Jeśli jednak proces ten zawiedzie, użytkownik musi upewnić się, że wszystkie piki zostały rozpoznane przez oprogramowanie, szczególnie gdy stosunek sygnału do szumu jest niski. Na przykład piki ramienne (shoulder peaks) nie zawsze są wykrywane, a sekwencje bogate w G są często ściśnięte.

7. Normalizacja danych

Aby włączyć profile reaktywności nukleotydów do algorytmu struktury drugorzędowej wykorzystywanego przez oprogramowanie RNAStructure (v5.3) i/lub porównać profile blisko spokrewnionych cząsteczek RNA, dane SHAPE muszą zostać znormalizowane w sposób ustandaryzowany12. Proces ten obejmuje (i) wykluczenie wartości odstających z dalszych obliczeń, (ii) wyznaczenie „efektywnego maksimum” reaktywności (tj. średniej z najwyższych 8% wartości reaktywności, z wyłączeniem wartości odstających) oraz (iii) normalizację poprzez podzielenie wszystkich wartości reaktywności przez „efektywne maksimum”, w następujący sposób:

  1. Otwórz plik tekstowy z rozdzielaczem tabulacyjnym, wygenerowany po wyrównaniu i integracji, a następnie skopiuj jego zawartość do arkusza programu Excel. Prawa kolumna tego pliku (RX.area-BG.area) zawiera obliczone wartości bezwzględnej reaktywności SHAPE dla każdego nukleotydu RNA. Lewe kolumny wiążą tę reaktywność z sekwencją RNA.
  2. Oblicz i zapisz wartości pierwszego i trzeciego kwartyla (t.j. 25. i 75. percentyla) dla (RX.area-BG.area), korzystając z funkcji Excela „=QUARTILE(array,quart)”
  3. Oblicz i zapisz różnicę międzykwartylową za pomocą formuły „=QUARTILE(array, 3)-QUARTILE(array, 1)”
  4. Oblicz i zapisz „wartość odcięcia dla wartości odstających” (outlier cutoff value), stosując wzór „=(QUARTILE, array,3)+1.5*((QUARTILE(array,3)-QUARTILE(array,1))”. Wszystkie wartości reaktywności przekraczające tę wartość powinny zostać wykluczone z dalszych obliczeń.
  5. Skopiuj wartości reaktywności z (RX.area-BG.area) i wklej je do sąsiedniej, pustej kolumny, a następnie posortuj te wartości tak, aby największe z nich znajdowały się na górze kolumny.
  6. W nowo utworzonej „kolumnie wartości posortowanych” usuń wartości przekraczające wartość odcięcia dla wartości odstających.
  7. Oblicz i zapisz średnią z 8% największych wartości reaktywności pozostałych w „kolumnie wartości posortowanych”. Wartość ta stanowi „efektywne maksimum” reaktywności.
  8. Podziel nieposortowane wartości (RX.area-BG.area) każdego nukleotydu (łącznie z wartościami odstającymi) przez wartość „efektywnego maksimum” reaktywności, aby otrzymać „znormalizowane wartości reaktywności”. Zapisz je w pustej kolumnie, pozostawiając jedną pustą kolumnę po lewej stronie. Następnie skopiuj numery nukleotydów z lewej strony tabeli i wklej je do pustej kolumny bezpośrednio po lewej stronie „znormalizowanych wartości reaktywności”.
  9. Skopiuj i wklej pary pozycja nukleotydu–znormalizowana wartość reaktywności do edytora tekstu.
  10. Usuń wartości poniżej -0,09 (t.j. pozostaw puste miejsca), ponieważ prawdopodobnie są one wynikiem zatrzymania RT podczas syntezy cDNA z przyczyn innych niż chemiczna modyfikacja matrycy. Ponadto należy wykluczyć wszelkie wartości reaktywności dla nukleotydów, przy których zaobserwowano silne zatrzymanie na niemodyfikowanej matrycy (ustalone poprzez wizualną inspekcję profilu ShapeFinder w sekcji „Align and Integrate”).
  11. Zapisz plik z rozszerzeniem .shape do wykorzystania w analizie strukturalnej za pomocą oprogramowania RNAstructure (v5.3).

8. Modelowanie danych

Oprogramowanie RNAstructure (v5.3) jest wykorzystywane do przewidywania eksperymentalnie potwierdzonych struktur drugorzędowych RNA przy użyciu więzów pseudo-energii swobodnej wyprowadzonych z analizy SHAPE19. Oprogramowanie to zapewnia graficzne reprezentacje dwuwymiarowych struktur RNA o najniższej energii, a także tekstową reprezentację tych struktur w notacji kropka-nawias. Tę drugą można zaimportować do preferowanego przez użytkownika programu do wizualizacji struktur RNA, np. Pseudoviewer23 lub Varna22, w celu przygotowania obrazów o jakości publikacyjnej.

Uwaga: Należy zachować ostrożność podczas analizy struktur generowanych przez oprogramowanie RNAstructure (v5.3). Na przykład oprogramowanie to nie potrafi rozpoznać oddziaływań trzeciorzędowych, takich jak pseudowęzły i pętle całujące, ani nie jest w stanie odróżnić, czy brak reaktywności w danym regionie wynika z parowania zasad, czy z ochrony sterycznej przez związane białka. W konsekwencji czynniki te, wraz z energią raportowaną dla poszczególnych struktur, muszą zostać uwzględnione podczas przedstawiania ostatecznego modelu strukturalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

RNA zawierające element odpowiedzi rev (RRE) HIV-1 oraz kasetę strukturalną końcową 3'4 przygotowano z liniowego plazmidu poprzez transkrypcję in vitro, po czym poddano go fałdowaniu poprzez ogrzewanie, chłodzenie i inkubację w 37 °C w obecności MgCl2. RNA poddano działaniu NMIA, a następnie przeprowadziono odwrotną transkrypcję przy użyciu znakowanego z końca 5' primera DNA zhybrydyzowanego z kasetą strukturalną końcową 3'. Powstałą bibliotekę cDNA SHAPE, wraz z reakcjami kontrolnymi i sek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół dla wysokoprzepustowego SHAPE, techniki, która umożliwia określenie struktury drugorzędowej z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu dla RNA o dowolnej wielkości. Co więcej, sprzężenie eksperymentalnych danych SHAPE z algorytmami przewidywania struktury drugorzędowej ułatwia generowanie modeli 2D RNA z większą dokładnością niż jest to możliwe w przypadku każdej z tych metod osobno. Połączenie znakowanych fluorescencyjnie starterów i zautomatyzowanego CE zapewnia znaczące korzyści...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

S. Lusvarghi, J. Sztuba-Solinska, K.J. Purzycka, J.W. Rausch i S.F.J. Le Grice są wspierani przez Intramural Research Program National Cancer Institute, National Institutes of Health, USA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ODCZYNNIKI
N-bezwodnik metylosiatoowy (NMIA)Technologie życiaM25Rozpuszczają się w bezwodnym bezwodniku
DMSO 1-metylo-t-nitroizatoowym (1M7)patrz ref. 22
Indeks górny III Technologie odwrotnej transkryptazyżyciowej1808004410 000 jednostek
Zestaw do sekwencjonowania cyklu termosekwencjonazyAffymetrix78500
Materiały dostarczone przez użytkownika
RNA interesujące6 pmol na reakcję (granica wykrywalności zostanie określona przez urządzenie)
Zestawy czterech starterów znakowanych 5' (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 i WellRed D1/Licor IR800)Startery są komplementarne do RNA i są stosowane w reakcjach odwrotnej transkrypcji i sekwencjonowania. Wymienione fluorofory są optymalne dla Beckman Coulter 8000 CEQ. Podkłady można kupić lub zsyntetyzować we własnym zakresie.
MatrycaDNA jest używana do reakcji sekwencjonowania i musi zawierać sekwencję badanego RNA - w tym wszelkie 3'końcowe przedłużenie, jeśli jest obecne. W stosownych przypadkach często wygodnie jest użyć szablonu transkrypcji RNA.
10x Bufor100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA
5X Bufor200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (Ten bufor może być zmieniany w zależności od przypadku (np. pH, Inhibitor EDTA, Mg, RNazy)
2,5X RT mieszanina4 μ l Bufor 5X, 1 i mu; l 100 mM naziemna telewizja cyfrowa, 1,5 i mu; l woda,1 μ l 10 mM dNTP, 0,5 i mu; l Indeks górny III. Należy pamiętać, że bufor 5X i 100 mM DTT są dostarczane z zakupem SuperScript III (Invitrogen).
Roztwór do ładowania próbek GenomeLab (Beckman Coulter)Uwaga: Unikaj wielu cykli zamrażania i rozmrażania
SPRZĘTElektroforeza kapilarna Beckman CEQ8000 Thermocycler różni się
DNA renaturacyjny RNA składany RNA

Bibliografia

  1. Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).
  2. Moore, P. B., Steitz, T. A. The roles of RNA in the synthesis of protein. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003780(2011).
  3. Wilkinson, K. A., et al. High-throughput SHAPE analysis reveals structures in HIV-1 genomic RNA strongly conserved across distinct biological states. Plos Biol. 6, 883-899 (2008).
  4. Merino, E. J., Wilkinson, K. A., Coughlan, J. L., Weeks, K. M. RNA structure analysis at single nucleotide resolution by selective 2 '-hydroxyl acylation and primer extension (SHAPE). J. Am. Chem. Soc. 127, 4223-4231 (2005).
  5. Watts, J. M., et al. Architecture and secondary structure of an entire HIV-1 RNA genome. Nature. 460, 711-716 (2009).
  6. Xu, W., Bolduc, F., Hong, N., Perreault, J. P. The use of a combination of computer-assisted structure prediction and SHAPE probing to elucidate the secondary structures of five viroids. Mol. Plant Pathol. , (2012).
  7. Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Structural architecture of the human long non-coding RNA, steroid receptor RNA activator. Nucleic Acids Res. 40, 5034-5051 (2012).
  8. Leshin, J. A., Heselpoth, R., Belew, A. T., Dinman, J. High-throughput structural analysis of yeast ribosomes using hSHAPE. RNA Biol. 8, 478-487 (2011).
  9. Souliere, M. F., Haller, A., Rieder, R., Micura, R. A powerful approach for the selection of 2-aminopurine substitution sites to investigate RNA folding. J. Am. Chem. Soc. 133, 16161-16167 (2011).
  10. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2 '-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nat. Protoc. 1, 1610-1616 (2006).
  11. McGinnis, J. L., Duncan, C. D. S., Weeks, K. M. High-Throughput Shape and Hydroxyl Radical Analysis of Rna Structure and Ribonucleoprotein Assembly. Method Enzymol. 468, 67-89 (2009).
  12. Low, J. T., Weeks, K. M. SHAPE-directed RNA secondary structure prediction. Methods. 52, 150-158 (2010).
  13. Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. S. A. F. A. Semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments. Rna-a Publication of the Rna Society. 11, 344-354 (2005).
  14. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467, 103-107 (2010).
  15. Underwood, J. G., et al. FragSeq: transcriptome-wide RNA structure probing using high-throughput sequencing. Nat. Methods. 7, 995-1001 (2010).
  16. Mauger, D. M., Weeks, K. M. Toward global RNA structure analysis. Nat. Biotechnol. 28, 1178-1179 (2010).
  17. Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11063-11068 (2011).
  18. Vasa, S. M., Guex, N., Wilkinson, K. A., Weeks, K. M., Giddings, M. C. ShapeFinder: a software system for high-throughput quantitative analysis of nucleic acid reactivity information resolved by capillary electrophoresis. RNA. 14, 1979-1990 (2008).
  19. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).
  20. Pang, P. S., Elazar, M., Pham, E. A., Glenn, J. S. Simplified RNA secondary structure mapping by automation of SHAPE data analysis. Nucleic Acids Res. 39, e151(2011).
  21. Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 97-102 (2009).
  22. Darty, K., Denise, A., Ponty, Y. VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure. Bioinformatics. 25, 1974-1975 (2009).
  23. Byun, Y., Han, K. PseudoViewer: web application and web service for visualizing RNA pseudoknots and secondary structures. Nucleic Acids Res. 34, 416-422 (2006).
  24. Brown, T., Brown, D. J. S. Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach. Eckstein, F. , IRL Press. 20(1990).
  25. Legiewicz, M., et al. The RNA Transport Element of the Murine musD Retrotransposon Requires Long-range Intramolecular Interactions for Function. J. Biol. Chem. 285, 42097-42104 (2010).
  26. Steen, K., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Syntheis of 1-methyl-8-nitroisatoic anhydride (1M7). Protocol Exchange. , (2011).
  27. Mortimer, S. A., Weeks, K. M. A fast-acting reagent for accurate analysis of RNA secondary and tertiary structure by SHAPE chemistry. J. Am. Chem. Soc. 129, 4144-4145 (2007).
  28. Mitra, S., Shcherbakova, I. V., Altman, R. B., Brenowitz, M., Laederach, A. High-throughput single-nucleotide structural mapping by capillary automated footprinting analysis. Nucleic Acids Res. 36, e63(2008).
  29. Giddings, M. C., Severin, J., Westphall, M., Wu, J., Smith, L. M. A software system for data analysis in automated DNA sequencing. Genome Res. 8, 644-665 (1998).
  30. Aviran, S., et al. Modeling and automation of sequencing-based characterization of RNA structure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11069-11074 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sondowanie SHAPEelektroforeza kapilarnaodwrotna transkrypcjaoprogramowanie RNAStructurereaktywno nukleotyd wpseudo ograniczenia energetycznezautomatyzowana elektroforeza kapilarnaoprogramowanie ShapeFinderprzewidywanie in silico
Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.