Opisana jest dokładna, krótka, wyrafinowana i tania metoda, która ocenia długość telomerów w wielu tkankach i gatunkach za pomocą qRT-PCR. Ponadto opiszemy prosty test do oceny aktywności telomerazy jako uzupełniający test szkieletowy dla długości telomerów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
długość telomerów i aktywność telomerazy; Yin i Yang starzenia się komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Telomery to powtarzające się sekwencje DNA na końcach chromosomów, które są zróżnicowane pod względem długości, a u ludzi mogą osiągnąć długość 15 000 par zasad. Telomer służy jako bioprotekcyjny mechanizm ścierania chromosomów przy każdym podziale komórki. Po pewnym czasie telomery stają się zbyt krótkie, aby umożliwić replikację, proces, który może prowadzić do niestabilności chromosomów lub śmierci komórki. Długość telomerów jest regulowana przez dwa przeciwstawne mechanizmy: ścieranie i wydłużanie. Wyczerpanie następuje, gdy każda komórka się dzieli. Natomiast wydłużenie jest częściowo modulowane przez enzym telomerazę, który dodaje powtarzające się sekwencje na końcach chromosomów. W ten sposób telomeraza może odwrócić mechanizm starzenia się i odmłodzić żywotność komórek. Są to kluczowe elementy w utrzymaniu życia komórkowego i są wykorzystywane do oceny starzenia się komórek. W tym manuskrypcie opiszemy dokładną, krótką, wyrafinowaną i tanią metodę oceny długości telomerów w wielu tkankach i gatunkach. Metoda ta wykorzystuje dwa kluczowe elementy: tandemowe powtórzenia sekwencji telomerów i czułość qRT-PCR do wykrywania różnicowej liczby kopii badanych próbek. Ponadto opiszemy prosty test do oceny aktywności telomerazy jako uzupełniający test szkieletowy dla długości telomerów.
Wprowadzenie
Telomery to powtarzające się sekwencje heksameru DNA (TTAGGG) znajdujące się na końcach chromosomów. W każdej replikacji komórki te końce chromosomów są skracane. Jeśli staną się zbyt krótkie, chromosomy mogą ulegać fuzjom końców telomerów, nieprawidłowej rekombinacji i degradacji. Tak więc utrzymanie wystarczającej długości telomerów odgrywa ważną rolę w stabilności chromosomów i ochronie komórek 38. Utrzymanie długości telomerów ma również kluczowe znaczenie dla genów znajdujących się w pobliżu końców chromosomów, ponieważ replikacja DNA nie może trwać do samego końca chromosomów 1-2. W związku z tym zapobieganie skracaniu telomerów może popr....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Protokół długości telomerów19
1. Izolacja DNA
Większość metod izolacji DNA może być użyta. Nasze laboratorium preferuje zestaw Qiagen DNeasy (#69506) do źródeł krwi. W zależności od źródła DNA, takiego jak policzek lub inne źródła, można zastosować inną metodę izolacji.
2. Elementarze
Wszystkie startery są rozcieńczane do stężenia 100pmole/μl w wodzie klasy PCR i przechowywane w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą potrzebne. Zapasy robocze podkładów są świeże i przechowywane w temperaturze 20 °C przez krótki okres czasu (kilka miesięcy). Standardo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przykład analizy długości telomerów metodą qRT-PCR przedstawiono na Rysunku 1. Na panelu w lewym górnym rogu próbki oznaczone kolorem czerwonym i zielonym reprezentują rozmieszczenie badanych osób na płytce 96-dołkowej. Na panelu w prawym górnym rogu przedstawiono krzywą amplifikacji. Każdy badany jest analizowany za pomocą dwóch testów (telomeru i genu pojedynczej kopii), które są wykonywane w trzech powtórzeniach. Ze względu na różną liczbę kopii DNA uzyskanych w dwóch testach u wybranych osób, liczba .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Długość telomerów stanowi unikalny marker komórkowy do badania zestresowanej i starzejącej się komórki oraz oferuje wgląd w mechanizmy starzenia. Ponieważ po raz pierwszy zasugerowano jego rolę w starzeniu się, przeprowadzono wiele badań dotyczących długości telomerów z wiekiem, długowiecznością, chorobami związanymi z wiekiem, nowotworami i stresem. Przez dziesięciolecia złotym standardem pomiarów długości telomerów była analiza końcowych fragmentów restrykcyjnych przy użyciu hybrydyzacji południowej. Jednak ostatnio ro.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ilościowe wykrywanie telomerazy | Allied Biotech | MT3012 | |
| Qiagen DNeasy Kit | Qiagen | 69506 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master, Gotowa do użycia mieszanka reakcyjna gorącego startu do PCR w czasie rzeczywistym na bazie SYBR Green I przy użyciu LightCycler 480 Instrument | Roche Diagnostics | 4707516 |
Bibliografia
- Blackburn, E. H. Structure and Function of Telomeres. Nature. 350 (6319), 569-573 (1991).
- Gilson, E., Ségal-Bendirdjian, E. The Telomere Story or the Triumph of an Open-Minded. Research. Biochimie. 92 (4), 321-326 (2010).
- Wu, X., Amos, C. I., Zhu, Y., Zhao, H., Grossman, B. H., Shay, J. W.,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
