Artykuł metodologiczny

Monitorowanie migracji komórek dendrytycznych za pomocą rezonansu magnetycznego 19F / 1H

DOI:

10.3791/50251

⸱

20 marca 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Clinical Research Center, A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Berlin Ultrahigh Field Facility (B.U.F.F.), Max Delbrück Center for Molecular Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śledzenie komórek za pomocą MRI zyskało niezwykłą uwagę w ostatnich latach. Protokół ten opisuje znakowanie komórek dendrytycznych cząstkami bogatymi w fluor (19F), zastosowanie tych komórek in vivo oraz monitorowanie zakresu ich migracji do drenującego węzła chłonnego za pomocą 19F/1H MRI i 19F MRS.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ciągły postęp w nieinwazyjnych metodach obrazowania, takich jak rezonans magnetyczny (MRI), znacznie poprawił naszą zdolność do badania procesów fizjologicznych lub patologicznych w organizmach żywych. Rezonans magnetyczny okazuje się również cennym narzędziem do wychwytywania przeszczepionych komórek in vivo. Początkowe strategie znakowania komórek w MRI wykorzystywały środki kontrastowe, które wpływają na czas relaksacji MR (T1, T2, T2*) i prowadzą do wzmocnienia (T1) lub wyczerpania (T2*) sygnału w miejscach, w których obecne są znakowane komórki. Środki wzmacniające T2*, takie jak ultramałe środki tlenku żelaza (USPIO), zostały wykorzystane do badania migracji komórek, a niektóre z nich zostały również zatwierdzone przez FDA do zastosowań klinicznych. Wadą czynników T2* jest trudność w odróżnieniu wygaszania sygnału tworzonego przez znakowane komórki od innych artefaktów, takich jak skrzepy krwi, mikrokrwawienia lub pęcherzyki powietrza. W tym artykule opisujemy pojawiającą się technikę śledzenia komórek in vivo, która opiera się na znakowaniu komórek cząstkami bogatymi w fluor (19F). Cząstki te są przygotowywane przez emulgowanie związków perfluorowęglowodorowych (PFC), a następnie wykorzystywane do znakowania komórek, które następnie można zobrazować za pomocą 19F MRI. Do ważnych zalet PFC do śledzenia komórek in vivo należą: (i) brak związanego z węglem 19F in vivo, co daje obrazy bez tła i pełną selektywność komórek oraz (ii) możliwość ilościowego określenia sygnału komórkowego za pomocą spektroskopii 19F MR.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śledzenie komórek in vivo jest kluczowym aspektem w kilku dziedzinach biomedycyny. W tym celu niezwykle cenne są nieinwazyjne techniki obrazowania, które mogą selektywnie lokalizować komórki przez pewien czas. Przed opracowaniem trójwymiarowego obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) śledzenie migracji komórek odpornościowych ograniczało się do analiz mikroskopowych lub biopsji tkanek. Śledzenie komórek za pomocą rezonansu magnetycznego zyskało ogromne zainteresowanie w ciągu ostatnich kilku lat, nie tylko dla immunologów badających zachowanie komórek odpornościowych in vivo, ale także dla badaczy klinicznych i komórek macierzystych. W połowie lat 90. XX wieku pierwsze badania nad nanocząstkami tlenku żelaza 1 zapoczątkowały kaskadę osiągnięć w zakresie śledzenia komórek za pomocą rezonansu magnetycznego. Cząsteczki tlenku żelaza skracają czas relaksacji MR (T2*) znakowanych komórek, a tym samym powodują zubożenie sygnału w obrazach MR. Cząsteczki tlenku żelaza zostały wykorzystane do znakowania makrofagów 2, progenitorów oligodendrocytów 3 i wielu innych typów komórek. Niektóre z tych cząstek zostały również klinicznie zatwierdzone przez FDA do oznaczania szczepionek komórkowych u pacjentów z czerniakiem 4. Ponieważ znakowanie in vivo lub ex vivo komórek cząstkami tlenku żelaza opiera się na skróceniu sygnału T2*, a to ostatnie może być również spowodowane efektami T2 * związanymi z podatnością in vivo, takimi jak mikrokrwawienia, złogi żelaza lub pęcherzyki powietrza, identyfikacja znakowanych komórek in vivo na podstawie innych wygaszań sygnału T2* w tle może być trudna 5.

W tym artykule opisujemy technikę śledzenia komórek dendrytycznych (DC) in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI) 19F/1H. Ta technologia śledzenia komórek została wprowadzona dopiero w 2005 roku6, kilka lat po tym, jak zgłoszono pierwsze rozpoznane zastosowania 19F w MRI. Jedną z ważnych zalet 19F w porównaniu ze znakowaniem komórek cząstek tlenku żelaza jest niskie biologiczne występowanie 19F w tkance; Umożliwia to bardzo selektywne śledzenie komórek za pomocą obrazów w zasadzie pozbawionych tła. Ponadto możliwe jest nałożenie sygnału 19F MR z przeszczepionych znakowanych komórek na obrazy anatomiczne uzyskane z konwencjonalnego rezonansu magnetycznego 1H. Rozdział 19Rezonans magnetyczny F/1H jest zatem istotny dla badań nad migracją komórek in vivo. Komórki badane tą metodą znakuje się 19cząstkami bogatymi w F. Do przygotowania cząstek powszechnie stosuje się perfluorowęglowodory pochodzenia syntetycznego (PFC) składające się głównie z atomów węgla i fluoru. Związki te są nierozpuszczalne w wodzie i muszą być emulgowane przed zastosowaniem in vitro lub in vivo. Typowa wielkość cząstek PFC, które zostały wykorzystane przez inne grupy do eksperymentów śledzenia in vivo 19F-MRI, waha się od 100 nm do 245 nm 6,8-10. Wykazaliśmy jednak, że skuteczność znakowania komórek dendrytycznych cząstkami perfluoro-15-crown-5-ether (PFCE) wzrasta wraz ze wzrostem wielkości cząstek (>560 nm). 11

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt muszą zostać zatwierdzone przez lokalny instytucjonalny komitet ds. dobrostanu zwierząt przed ich wykonaniem. Podczas pomiarów MR niezbędny jest odpowiedni poziom znieczulenia i monitorowanie fizjologiczne (temperatura ciała, częstość oddechów).

1. Generacja komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego myszy

  1. Wyodrębnij komórki szpiku kostnego od myszy C57BL / 6, jak opisano wcześniej 12. Protokół ten pochodzi z 1992 roku 13 i został pierwotnie opisany przez grupę Ralpha M. Steinmana (1943-2011), odkrywcy komórki dendrytycznej 14.
  2. Krótko mówiąc, wyekstrahuj piszczel i strzałkę wkrótce po złożeniu w ofierze myszy. Pracując pod okapem z przepływem laminarnym (aby zapobiec skażeniu mikrobiologicznemu), przepłucz szpik kostny na małą szalkę Petriego z pożywką płuczącą (5% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% HEPES w RPMI) 12.
  3. Przenieść zawiesinę komórkową przez sitko do komórek (oczka o rozmiarze 100 μm, nylon) do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml w celu usunięcia kości i resztek tkanki. Po kilku etapach płukania i etapie lizy 12 policz żywotne komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
  4. Zawiesić komórki szpiku kostnego w stężeniu 400 000 komórek ml-1 w pożywce hodowlanej (RPMI uzupełnione 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% HEPES i 1% L-glutaminy) zawierające 75 ng ml-1 mysiego czynnika stymulującego tworzenie makrofagów granulocytów (mGM-CSF) uzyskanych z supernatantów komórek 293FT HEK transfekowanych mysim plazmidem GMCSF. Przenieść 10 ml zawiesiny komórek (4 x 106 komórek) na szalki Petriego (100 mm x 20 mm) i inkubować w inkubatorze CO2 (37 °C, 5 % CO2 ). W dniu 3 uzupełnij starą pożywkę 10 ml świeżej pożywki (utrzymując końcowe stężenie mGM-CSF na poziomie 75 ng ml-1). W dniu 6 usuń 10 ml starej pożywki i uzupełnij 10 ml świeżej pożywki (stężenie końcowe mGM-CSF = 75 ng ml-1). W dniu 8 usuń 10 ml starej pożywki i uzupełnij 10 ml świeżej pożywki (stężenie końcowe mGM-CSF = 150 ng ml-1).
  5. W 10 dniu należy dojrzeć zróżnicowany prąd stały za pomocą 1 μg lipopolisacharydu ml-1 (LPS) przez 24 godziny.

2. Znakowanie komórek dendrytycznych za pomocą 19cząstek bogatych w F

  1. Podczas 24-godzinnego etapu dojrzewania (1,5) oznaczyć prąd stały cząstkami 1 mM bogatego w fluor perfluoro-15-crown-5-etheru (PFCE) (500-560 nm) również przez 24 godziny. Przygotować duże cząstki znakowane fluorem przez emulgację PFCE w Pluronic F-68 (całkowita objętość 2,5 ml) przy użyciu sonotrody tytanowej zaburzającej działanie komórek i stosując ciągły program impulsowy (amplituda 100%, moc = 250 W) przez 60 sekund.
  2. Postępując zgodnie z powyższymi etapami inkubacji, zebrać dojrzałe i znakowane fluorem DC za pomocą skrobaka do komórek hodowli tkankowych, przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować przy 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Aby zmyć wszelkie resztki cząstek i martwe komórki, pozostaw zebrane komórki do przylegania na naczyniach z poli-L-lizyny. Aby przygotować się do tego etapu, należy pokryć szalki Petriego poli-L-lizyną (1 mg ml-1) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie zmyć niezwiązaną poli-L-lizynę PBS.
  4. Inkubować nad pobranymi komórkami na płytkach pokrytych poli-L-lizyną w podłożu niezawierającym surowicy i pozostawić komórkom do przylegania (1 godzina w temperaturze 37 °C, 5% CO2 ).
  5. Zmyć pożywkę, aby usunąć nieprzylegające komórki, pozostałe cząstki i martwe komórki, a następnie przemyć trzykrotnie wstępnie podgrzanym (37 °C) PBS.
  6. Zebrać przylegające komórki przez traktowanie trypsyną-EDTA (0,25% trypsyna-EDTA, 3 minuty inkubacji w temperaturze 37 °C).
  7. Po kolejnym etapie wirowania z płukaniem, ponownie zawiesić wymaganą ilość dojrzałego DC w sterylnym PBS bez surowicy.
  8. Aby ustalić, czy komórki zostały pomyślnie znakowane, zaleca się sprawdzenie charakterystyki fizykochemicznej komórek za pomocą cytometrii przepływowej (FACS). Rozproszenie boczne (SSC) powinno ujawnić zwiększoną ziarnistość w tych komórkach, jak opisano wcześniej 11. Należy również pamiętać, że fibroblasty mogą zanieczyszczać kultury DC i mogą również równolegle pobierać cząstki 19F. Dlatego czystość DC powinna być oceniana (poprzez pomiar procentowej zawartości komórek CD11c+CD11b+ za pomocą FACS) przed zastosowaniem in vivo.

3. Aplikacja in vivo 19komórek dendrytycznych znakowanych F

  1. Podawać DC (10,6 - 10,7) w objętości 50 - 100 μl śródskórnie do tylnych kończyn myszy C57BL/6, umieszczając mysz w uchwycie i ostrożnie wkładając igłę 26 1/2 G w górne warstwy skóry przed aplikacją (użyć strzykawek tuberkulinowych o pojemności 0,5 ml z przymocowanymi na stałe igłami, aby zminimalizować martwą objętość). Aby zapewnić odpowiednią aplikację śródskórną, ważne jest, aby wprowadzona część igły była częściowo widoczna pod skórą. Jeśli igła nie jest już widoczna, oznacza to, że igła została wprowadzona zbyt głęboko w warstwy skóry. W przypadku osoby nieprzeszkolonej aplikacja śródskórna może być wykonywana w znieczuleniu.
  2. Zobrazuj kończyny za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo fluor (19F) / proton (1H) (patrz następna sekcja) 21 godzin po wstrzyknięciu.

4. Rezonans magnetyczny in vivo 19f/1h

Szczegółowe instrukcje dotyczące konfiguracji skanów MR odnoszą się do skanera MR Bruker korzystającego z oprogramowania sterującego Paravison (wersja 5.1). Nazwy odnoszące się do funkcji i elementów specyficznych dla dostawcy zostały wyróżnione kursywą. W przypadku innych skanerów MR może być konieczne dostosowanie tych czynności zgodnie z wytycznymi producenta.

  1. Zorganizuj dostęp do dedykowanego skanera MR dla małych zwierząt. Aby uzyskać odpowiednią jakość obrazu, system o natężeniu pola magnetycznego 9,4 Tesli lub większym oraz dostosowane cewki o częstotliwości radiowej (np. cewka RF 1H/19F o podwójnej regulowanej objętości, średnica wewnętrzna 35 mm, długość 50 mm; Rapid Biomed, Würzburg, Niemcy).
  2. Przed wykonaniem rezonansu magnetycznego należy przygotować konfigurację skanera MRI do znieczulenia i monitorowania fizjologicznego. Upewnij się, że maska oddechowa legowiska/uchwytu dla zwierząt jest podłączona do systemu izofluranu, a sonda temperatury i podkładka oddechowa są podłączone do zdalnego systemu monitorowania zwierząt (np. Model 1025, SA Instruments Inc., Nowy Jork, USA). Ten ostatni służy do monitorowania parametrów życiowych zwierzęcia, takich jak temperatura ciała i oddychanie.
  3. Znieczulenie myszy za pomocą narkozy wziewnej za pomocą komory myszy podłączonej do systemu izofluranu. Dostosuj natężenie przepływu powietrza iO2 odpowiednio na poziomie 0,2 l min-1 i 0,1 l min-1 oraz 3% izofluranu (dostosowanego z parownika) przez około 2 minuty, aż do osiągnięcia wymaganego poziomu znieczulenia (brak reakcji po uszczypnięciu palca). Optymalne natężenia przepływu mogą się różnić w zależności od używanej konfiguracji. Należy pamiętać, że wysokie natężenie przepływu może prowadzić do odwodnienia. Jak wspomniano powyżej, przez cały czas wymagane jest dokładne monitorowanie stanu zwierząt.
  4. Umieść mysz na brzuchu na łóżku/uchwycie skanera MR dla małych zwierząt (Rysunek 1).
  5. Utrzymując stałe natężenie przepływu powietrza iO2, wyreguluj parownik izofluranu na 0,8 - 1,5%, aż do osiągnięcia optymalnego wzorca oddychania. Zalecana częstość oddechów wynosi 50 - 70 oddechów na minutę.
  6. Podczas eksperymentu utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 36-37 °C, stosując system cyrkulacji ciepłej wody (lub alternatywnie ciepłego powietrza).
  7. Podczas pomiaru utrzymuj oczy myszy wilgotne sterylną maścią nawilżającą oczy.
  8. Po zabezpieczeniu zwierzęcia na uchwycie obrazowania i połączeniach z systemem monitorowania, przesuń uchwyt na środek cewki RF 1H/19F (która znajduje się w izośrodku magnesu skanera zwierząt).
  9. Ustaw pozycję myszy w taki sposób, aby kolano leżało w izośrodku magnesu, albo metodą automatyczną (np. za pomocą lasera pozycjonującego połączonego z napędzanym silnikiem uchwytem na zwierzęta), albo poprzez ręczne obliczenie odległości, na jaką uchwyt musi zostać przesunięty do magnesu, aby dotrzeć do izocentrum.
  10. W celu potwierdzenia prawidłowego ułożenia zwierzęcia w skanerze i późniejszego zaplanowania geometrii wycinka obrazu (tj. rozmiaru, położenia i obrotu w przestrzeni), należy pozyskać obrazy zwiadowcze w trzech standardowych orientacjach (osiowej, czołowej, strzałkowej) przy użyciu metod akwizycji obrazów o szybkiej i niskiej rozdzielczości (np. protokół TriPilot, który wykorzystuje sekwencję impulsów FLASH).
  11. Dostrój cewkę RF do częstotliwości rezonansowej 1H (np. 400.1 MHz dla 9.4 T) i do częstotliwości rezonansowej 19F (np. 376.3 MHz dla 9.4 T) i dopasuj impedancję charakterystyczną cewki do 50 Ohm za pomocą monitora strojenia skanera MR dla zwierząt. Dostrajanie i dopasowywanie jest konieczne, aby osiągnąć optymalne warunki do nadawania i odbioru sygnału.
  12. Wykonaj niezbędne automatyczne ustawienia systemowe, w tym podkładkowanie w celu precyzyjnego dostrojenia jednorodności pola magnetycznego (np. ADJ_SHIM), regulację częstotliwości systemowej w celu dostrojenia RF do częstotliwości Lamor myszy (np. ADJ_SF) oraz wzmocnienie referencyjne w celu dostosowania amplitudy RF (np. ADJ_REFG). Wszystkie te ustawienia są ważne, aby statyczne i zmienne pola magnetyczne (B0, B1) w obszarze zainteresowania były jak najbardziej jednorodne.
  13. Zdobądź drugi zestaw obrazów zwiadowczych (jak powyżej) wzdłuż trzech orientacji ortogonalnych, po ustawieniu pola widzenia (FOV) tak, aby obie kończyny dolne były widoczne od miednicy do stopy (dł. x szer. x wys. = 50 x 25 x 25 mm). Obrazy te służą do zaplanowania orientacji końcowych skanów 3D 1H/19F.
  14. Ustaw protokół TurboRARE 3D dla 1H-scan: TR/TE = 1,500/53 ms, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, RARE Factor = 16 (czas skanowania ok. 60 min). Dostosuj FOV za pomocą obrazów zwiadowczych, rozpocznij skanowanie (sygnalizacja świetlna).
  15. Załaduj pojedynczą impulsową sekwencję FID z TR co najmniej 1,000 ms. Otwórz Edit Scan i ustaw nucleus na 19F. Użyj ręcznych ustawień wzmocnienia, usuwając zaznaczenie automatycznego wzmocnienia referencyjnego w Metodzie edycji w Przyborniku.
  16. Rozpocznij pomiar bez rejestrowania danych, aby wyświetlić sygnał MR w czasie rzeczywistym przy użyciu GSP (go setup). Jeśli sygnał spektralny 19F w oknie akwizycji jest zbyt niski, dodaj więcej średnich w metodzie edycji i/lub moduluj tłumik impulsów (suwak TX0 lub SP0), aż sygnał będzie wyraźnie widoczny. Dostosuj częstotliwość podstawową, aby wyśrodkować pik widmowy 19F przy 0 Hz w oknie akwizycji. Zastosuj częstotliwość podstawową i naciśnij Stop. Należy pamiętać, że izofluran stosowany jako znieczulenie może generować sygnał tła. Przy rezonansie magnetycznym 9,4 Tesli przesunięcie chemiczne między 19cząstkami zawierającymi F a izofluranem wynosi około 1800 Hz. Upewnij się, że szerokość pasma wzbudzenia jest mniejsza niż 3600 Hz, aby uniknąć wzbudzenia izofluranu razem z 19komórkami lub cząstkami znakowanymi F. Częstotliwość podstawowa powinna być ustawiona prawidłowo na sygnale generowanym przez 19ogniw znakowanych F. Alternatywnie, inna metoda znieczulenia może być użyta według własnego uznania.
  17. Sklonuj (zduplikuj) protokół TurboRARE 3D z poprzedniego skanowania 1H. Przejdź do opcji Edit Method (Edytuj metodę) i odznacz automatyczne wzmocnienie referencyjne (jak wyżej). Ustaw jądro 19F z Edytuj skanowanie. Zmień macierz na 128x64x64, a współczynnik RARE-Factor na co najmniej 40 (do 64). Dla TR/TE 1,000/6 ms i 64 średnich czas skanowania wynosi około 70 minut. Ustaw wzmocnienie odbiornika na 101 (przybornik) i rozpocznij skanowanie bez żadnych dalszych regulacji za pomocą GOP (go pipeline).
  18. Po zakończeniu skanowania schowaj uchwyt myszy ze skanera MR. Ostrożnie odłącz mysz od uchwytu. Jeśli mysz nie zostanie uśmiercona do analizy ex vivo (np. histologii lub spektroskopii, patrz poniżej) bezpośrednio po pomiarach MR, należy ją ściśle monitorować, aż do całkowitego wyzdrowienia po znieczuleniu. Znieczulenie ma wpływ na regulację temperatury ciała, dlatego podczas procesu rekonwalescencji umieść mysz w osobnej klatce, która jest umieszczona na ciepłej podkładce o regulowanej temperaturze. Gdy mysz całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia, wróć do klatki i do pokoju dla zwierząt.
  19. Aby nałożyć 19obrazów F na obrazy 1H, użyj opcji View Menu w tym samym oprogramowaniu (Paravison). Funkcję Podkładanie można znaleźć w obszarze Korygować. Zapisz podkładanie, załaduj nowy obraz i podświetl warstwę 19F, definiując nowy kolor z tabeli Lookup table. Aby odróżnić skany 19F od 1H, zmień próg dla wybranego koloru (wytnij tabelę przeglądową) tak, aby sygnał 19F miał wybrany kolor, a obraz tła 1H pozostał w skali szarości. Dostępne są inne programy do przetwarzania końcowego (np. ImageJ) do tworzenia nakładek obrazów 1H/19F.
  20. Jeżeli konieczne jest ilościowe oznaczanie in vivo sygnału 19F, należy postępować zgodnie z prostym protokołem ilościowym, jak opisano wcześniej 15,16. Krótko mówiąc, kwantyfikacja może być przeprowadzona poprzez umieszczenie probówki referencyjnej ze znanym stężeniem emulsji PFCE w polu widzenia obok myszy. Po uzyskaniu obrazów MR określ ilościowo intensywność sygnałów 19F za pomocą analizy obszaru zainteresowania (ROI) i porównaj z krzywą kalibracji in vitro, jak pokazano na rysunku 2.

5. Spektroskopia rezonansu magnetycznego węzłów chłonnych (MRS)

  1. Po poświęceniu myszy należy usunąć węzeł chłonny podkolanowy i umieścić w małej probówce NMR o średnicy 5 mm i dodać 100 μl 2% PFA.
  2. Zainstalować cewkę spektroskopową 19F (np. cewkę toroidalną), która ma otwór co najmniej 5 mm do przytrzymania rurki NMR zawierającej węzeł chłonny.
  3. Umieść rurkę NMR wewnątrz cewki i przesuń cewkę do izocentrum magnesu.
  4. Dostrój cewkę RF do częstotliwości rezonansowej 19F (np. 376.3 MHz dla 9.4 T) i dopasuj impedancję charakterystyczną cewki do 50 Ohm za pomocą monitora strojenia skanera MR dla zwierząt. Dostrajanie i dopasowywanie jest konieczne, aby osiągnąć optymalne warunki do nadawania i odbioru sygnału.
  5. Ustaw wszystkie parametry podkładki regulacyjnej w przyborniku Cieniowanie na 0 i naciśnij przycisk Zastosuj. Zwykle nie jest konieczne stosowanie metod podkładkowania, ponieważ objętość próbki jest stosunkowo niewielka. Jeśli dostępny jest wystarczający sygnał 19F, można zastosować zautomatyzowane metody podkładkowania, częstotliwości systemu i wzmocnienia odbiornika, jak opisano powyżej.
  6. Załaduj pojedynczą impulsową sekwencję FID z TR co najmniej 1,000 ms. Otwórz Edit Scan i ustaw jądro na 19F. Użyj ręcznych ustawień wzmocnienia, usuwając zaznaczenie automatycznego wzmocnienia referencyjnego w Metodzie edycji w Przyborniku. Ustaw liczbę średnich na 1.
  7. Rozpocznij sekwencję przy użyciu protokołu GSP. Jeśli sygnał spektralny 19F w oknie akwizycji jest zbyt niski, dodaj więcej średnich w metodzie edycji i/lub moduluj tłumik impulsów (suwak TX0 lub SP0), aż sygnał będzie wyraźnie widoczny. Dostosuj częstotliwość podstawową tak, aby pik widmowy 19F znajdował się w środku okna akwizycji przy 0 Hz i zastosuj częstotliwość podstawową. Ponownie wyreguluj tłumik impulsów, aby zmaksymalizować sygnał, aby osiągnąć wzbudzenie 90 °. Gdy sygnał osiągnie maksimum, naciśnij Stop.
  8. Ustaw średnie w metodzie edycji między 64 a 256 (lub więcej, jeśli to konieczne, w zależności od sygnału) i rozpocznij akwizycję za pomocą GOP. Wykryty sygnał koreluje liniowo z liczbą średnich. Podczas kwantyfikacji należy pamiętać, że wykryty sygnał musi zostać znormalizowany do jednej średniej. Ponadto do obliczenia liczby komórek ze znormalizowanego sygnału 19F niezbędny jest wzorzec kalibracyjny znanego stężenia lub krzywa kalibracyjna (rysunek 2).
  9. Po zakończeniu skanowania usuń próbkę, umieść następną próbkę i przejdź do kroku 5.3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od osiemnastu do dwudziestu jeden godzin po aplikacji dokórnej, komórki dendrytyczne (DC) znakowane 19F migrują do drenującego węzła chłonnego podkolanowego. Ruch komórek DC przez naczynia chłonne do drenującego węzła chłonnego podkolanowego można zaobserwować poprzez nałożenie obrazów anatomicznych 1H na obrazy 19F DC (Rysunek 2A). Wcześniej opisaliśmy migrację tych komórek in vivo, a także wpływ wielkości cząsteczek 19F na immunobiologię DC, w tym na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda wykorzystująca 19F/1H MRI do śledzenia ruchu prądu stałego do węzła chłonnego daje możliwość zbadania wzorców migracji komórek odpornościowych in vivo. Komórki dendrytyczne są doskonałymi przykładami szybko migrujących komórek odpornościowych, które są w stanie manewrować przez trójwymiarowe struktury bez ścisłego przylegania do określonych substratów 17. Chociaż niska rozdzielczość przestrzenna (zakres μm) opisywanej techniki nie jest porównywalna z wysoką rozdzielczoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft dla S.W. (DFG WA 2804) oraz grant uniwersytecki dla S.W. z Centrum Badań Eksperymentalnych i Klinicznych, współpracy Centrum Medycyny Molekularnej im. Maxa Delbrücka i Wydziału Medycznego Charité w Berlinie. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy Panu Robertowi Westphalowi za wsparcie techniczne podczas stażu w naszym laboratorium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ODCZYNNIKI
C57BL/6 myszyCharles River, Berlin
RPMIGibco21875-091
FBS SuperiorBiochrom AGS 0615
HEPESGibco-Invitrogen15630-056
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
L-glutaminaGibco25030-024
Dulbecco's PBSSigma AldrichD8662
PFASanta Cruzsc-281692
Perfluoro-15-crown-5-ether ChemPur391-1996
Pluronic F-68 Sigma AldrichP5556
Szalki Petriego (35 x 10 mm)VWR, Niemcy391-1996
27 & frac12; Strzykawki GVWR, Niemcy612-0151
Nylonowe sitka do komórek (100 μ m mesh) VWR, Niemcy734-0004
Rurki NMR VWR, Niemcy634-0461
EQUIPMENT
Narzędzia do preparowaniaInkubator FST
CO2 Binder
System MR dla małych zwierzątBruker Biospin9.4T BioSpec 94/20 USR, Oprogramowanie do akwizycji i przetwarzania ParaVision<
sup>1H/19F podwójnie przestrajalna cewka RF Rapid Biomed, Wü rzburg, Niemcyśrednica wewnętrzna 35 mm, długość 50 mm
19F cewka spektroskopowa zwłasną pętlą strojenia/dopasowania, 4 zwoje, średnica wewnętrzna 5 mm, długość 10 mm, dwa kondensatory do strojenia i dopasowania
systemu inhalacji izofluranuFö hr Medical Instruments GmbH
System monitorowania zwierząt Model 1025SA Instruments Inc., Nowy Jork, USA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles. Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).
  2. Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. Magnetically labeled cells can be detected by MR imaging. J. Magn. Reson. Imaging. 7 (1), 258-263 (1997).
  3. Franklin, R. J., Blaschuk, K. L., Bearchell, M. C., Prestoz, L. L., Setzu, A., et al. Magnetic resonance imaging of transplanted oligodendrocyte precursors in the rat brain. NeuroReport. 10 (18), 3961-3965 (1999).
  4. de Vries, I. J., Lesterhuis, W. J., Barentsz, J. O., Verdijk, P., van Krieken, J. H., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nat. Biotechnol. 23 (11), 1407-1413 (2005).
  5. Liu, W., Frank, J. A. Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI. Eur. J. Radiol. 70 (2), 258-264 (2009).
  6. Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells. Nat. Biotechnol. 23 (8), 983-987 (2005).
  7. Holland, G. N., Bottomley, P. A., Hinshaw, W. S. F-19 Magnetic-Resonance Imaging. Journal of Magnetic Resonance. 28 (1), 133-136 (1977).
  8. Partlow, K. C., Chen, J., Brant, J. A., Neubauer, A. M., Meyerrose, T. E., et al. 19F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons. FASEB J. 21 (8), 1647-1654 (2007).
  9. Ruiz-Cabello, J., Walczak, P., Kedziorek, D. A., Chacko, V. P., Schmieder, A. H., et al. In vivo "hot spot" MR imaging of neural stem cells using fluorinated nanoparticles. Magn. Reson. Med. 60 (6), 1506-1511 (2008).
  10. Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model. Magn. Reson. Med. 58 (4), 725-734 (2007).
  11. Waiczies, H., Lepore, S., Janitzek, N., Hagen, U., Seifert, F., et al. Perfluorocarbon particle size influences magnetic resonance signal and immunological properties of dendritic cells. PLoS ONE. 6 (7), e21981(2011).
  12. Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging. J. Vis. Exp. (17), e773(2008).
  13. Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  14. Lanzavecchia, A., Sallusto, F. Ralph M. Steinman. 1943-2011. Cell. 147 (6), 1216-1217 (1943).
  15. Srinivas, M., Turner, M. S., Janjic, J. M., Morel, P. A., Laidlaw, D. H., et al. In vivo cytometry of antigen-specific t cells using 19F. MRI. Magn. Reson. Med. 62 (3), 747-753 (2009).
  16. Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. (19)F MRI for quantitative in vivo cell tracking. Trends Biotechnol. 28 (7), 363-370 (2010).
  17. Lammermann, T., Bader, B. L., Monkley, S. J., Worbs, T., Wedlich-Soldner, R., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  18. Liu, M. S., Long, D. M. Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography. Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).
  19. Kwiatkowska, K., Sobota, A. Signaling pathways in phagocytosis. Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).
  20. Mitragotri, S., Lahann, J. Physical approaches to biomaterial design. Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).
  21. Hoult, D. I., Richards, R. E. The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment. J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).
  22. Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. Cryogenically cooled probes - a leap in NMR technology. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).
  23. Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy. PLoS ONE. 7 (3), e32796(2012).
  24. Haacke, E. M. Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , John Wiley & Sons. (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

MRI fluoruznakowanie perfluorow glowodamicytometria przep ywowaMRI protonoweobrazowanie w z w ch onnychledzenie kom rekspektroskopia rezonansu magnetycznegospektroskopia fluoruskaner MR dla zwierz t

Powiązane artykuły