Artykuł metodologiczny

Krótko- i długoterminowa aktywność ruchowa myszy analizowana przez oprogramowanie do śledzenia wideo

20K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50252

⸱

20 czerwca 2013

 ,  ,  , 
1Department of Animal Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Pathology, Integrative Immunology and Behavior Program, University of Illinois at Urbana-Champaign

W tym artykule

Podsumowanie

Aktywność lokomotoryczna (LMA) to prosty i łatwy do wykonania pomiar zachowania u myszy. Sprzężenie oprogramowania do śledzenia wideo (VTS) i LMA pozwala na poprawę swoistości i czułości, zwłaszcza w porównaniu z ręczną metodą analizy LMA polegającą na przekraczaniu linii. Dodatkowo VTS umożliwia długoterminowe śledzenie LMA myszy.

Streszczenie

Aktywność lokomotoryczna (LMA) to prosty i łatwy do wykonania pomiar zachowania myszy i innych gryzoni. Ulepszenia w oprogramowaniu do śledzenia wideo (VTS) pozwoliły na połączenie go z testami LMA, co znacznie poprawiło swoistość i czułość w porównaniu z metodą przekraczania linii z ręcznym ocenianiem. Ponadto VTS umożliwia eksperymentowanie z wysoką przepustowością. Chociaż podobny do automatycznego śledzenia wideo używanego w teście otwartego pola (OFT), test LMA jest wyjątkowy, ponieważ pozwala myszom pozostać w klatce domowej i nie wykorzystuje przeciwlękowego bodźca jasnego oświetlenia podczas aktywnej fazy cyklu światło-ciemność. Tradycyjnie, LMA był używany przez krótkie okresy czasu (minuty), podczas gdy dłuższe badania ruchowe (godziny-dni) często wykorzystywały wszczepione nadajniki i biotelemetrię. Dzięki opcji śledzenia w czasie rzeczywistym, długoterminowe, podobnie jak krótkoterminowe testy LMA, mogą być teraz przeprowadzane za pomocą wideografii. Długoterminowe testy LMA wymagają specjalistycznej, ale łatwej w budowie klatki, tak aby żywność i woda (które zwykle znajdują się na górze klatki) nie przeszkadzały w filmowaniu. Co ważne, wideografia i VTS pozwalają na ilościowe określenie parametrów, takich jak ścieżka ruchu myszy, które są trudne lub niewykonalne do zmierzenia za pomocą przekroczenia linii i/lub biotelemetrii. Podsumowując, testy LMA w połączeniu z VTS zapewniają pełniejszy opis ruchu myszy i możliwość badania lokomocji przez dłuższy czas.

Protokół

1. Krótkoterminowa konfiguracja i procedura LMA

  1. Krótkoterminowa konfiguracja klatki LMA
    1. Przetestuj krótkoterminowe LMA w klatce domowej myszy z pojedynczą obudową. Aby ułatwić analizę obrazu zależną od VTS, należy użyć ściółki o wysokim kontraście z kolorem myszy (tj. ciemnej ściółki dla białych myszy i jasnej ściółki dla czarnych myszy).
    2. Podczas krótkoterminowych testów LMA należy przykryć klatki przezroczystym pleksiglasem o średnicy 1/4 cala z otworami o średnicy 11 x 1/4 cala, aby zapewnić odpowiednią wentylację.
  2. Sala do krótkoterminowych testów LMA
    1. Przetestuj myszy w czystym środowisku, w którym były zaaklimatyzowane przez co najmniej 24 godziny 8.
    2. Aby oświetlić środowisko testowe, użyj lamp zaciskowych lęgowych z czerwonymi żarówkami (< 125 lumenów). Przed filmowaniem dostosuj kąt i położenie świateł, aby usunąć odblaski lub odbicia od blatów klatki z pleksiglasu.
    3. Usuń lub unikaj hałasu w pomieszczeniu powyżej 70 dB. Użyj generatora białego szumu, jeśli przerywany szum tła jest nieunikniony podczas testowania myszy.
    4. Powierzchnię badawczą, na której umieszcza się klatki w pomieszczeniu badawczym, należy przykryć papierem rzeźniczym lub laboratoryjnym o kolorze podobnym do ściółki klatki, w przypadku gdy podłoga klatki jest odsłonięta podczas filmowania.
  3. Krótkoterminowe filmowanie LMA
    1. Wyśrodkuj i umieść zamontowaną na suficie kamerę wideo z noktowizorem z co najmniej 120 GB pamięci nad obszarem nagrywania w pomieszczeniu testowym. Nie należy przekraczać możliwości rozdzielczości używanego VTS poprzez umieszczanie zbyt wielu klatek w ramce widoku kamery wideo (np. Ethovision XT 7 firmy Noldus Information Technology (Leesburg VA) może jednocześnie śledzić 8 myszy w czasie rzeczywistym).
  4. Procedura krótkoterminowego testowania LMA
    1. Przetestuj krótkoterminowe LMA podczas aktywnej/ciemnej fazy cyklu światła. Upewnij się, że czas względem cyklu światła jest taki sam we wszystkich grupach, ponieważ LMA podąża za wzorcem zmierzchowym, z większą aktywnością we wczesnych i późniejszych okresach cyklu ciemnego 1. Uwzględnij zarówno osoby eksperymentalne, jak i kontrolne w każdej grupie zarejestrowanych myszy, aby zminimalizować potencjalne skutki różnic czasowych w LMA.
    2. Myszy należy indywidualnie trzymać i aklimatyzować co najmniej 24 godziny przed rozpoczęciem testów LMA 8.
    3. Umieść przegrody i klatki (zawierające pojedyncze myszy) bezpośrednio pod kamerą. Usuń z klatek cały materiał zagnieżdżający/urozmaicający, ponieważ może to zasłaniać widok myszy (np. jeśli mysz zakopuje się/zakrywa materiałem do zagnieżdżania) i zakłócać dokładność VTS. Umieść przezroczystą pokrywę z pleksiglasu na każdej nagranej klatce.
    4. Podczas filmowania kilku klatek jednocześnie upewnij się, że rozdzielczość jest zgodna z wybranym VTS. Aby ułatwić analizę VTS, umieść koszyki identycznie w każdej przegrodzie (tj. w prawym górnym rogu).
    5. Rozpocznij nagrywanie. Rozpocznij każdy film od planszy, która identyfikuje wszystkie istotne informacje eksperymentalne, aby zapewnić prawidłową identyfikację filmu, niezależnie od jakiejkolwiek dodatkowej dokumentacji niezwiązanej z filmem. Użyj timera lub stopera, aby śledzić czas trwania testu LMA (5-10 min). Jeśli informacje o chronometrażu zostaną utracone, odzyskaj je z nagrania wideo.
    6. W przypadku powtarzanych pomiarów przy użyciu krótkoterminowej metody LMA, należy zapewnić myszom dostęp do pożywienia i wody w odstępach czasu niezwiązanych z pomiarem.
    7. Podczas testowania trzymaj eksperymentatorów poza zasięgiem wzroku myszy, aby nie działały jako zewnętrzna wskazówka wizualna.
    8. Po zakończeniu testów zwróć/wymień materiał zagnieżdżający/wzbogacający, aby zmniejszyć ryzyko rozwoju zachowań podobnych do lęku 8.
  5. Krótkoterminowa analiza LMA
    1. Zapis wideo z sesji testowej należy przechowywać na nośniku archiwalnym kompatybilnym z używanym VTS. W przypadku Ethovision XT 7 używany jest dysk twardy (HDD).
    2. Odtwarzaj ponownie filmy w VTS za pomocą powiązanego odtwarzacza multimedialnego, analizując filmy w czasie rzeczywistym. Na rysunku 1 zmienne wykrywania były następujące: 2 cm/s rozpoczyna śledzenie; 1,75 cm/s zatrzymuje śledzenie.
    3. Początkowo wybierz całą podłogę klatki jako obszar zainteresowania (ROI) do śledzenia. W przypadku zaawansowanych analiz, takich jak ocena tigmotaksji, utwórz wiele zwrotów z inwestycji wewnątrz klatki.
    4. W przypadku badań o wysokiej przepustowości należy przeanalizować wszystkie klatki w filmie jednocześnie z indywidualnymi zwrotami z inwestycji w podłogę we wszystkich klatkach.
    5. Użyj VTS, aby obliczyć całkowitą przebytą odległość (cm), prędkość ruchu (cm/s) i czas trwania ruchu (s). W przypadku Ethovision XT 7 wyeksportuj wygenerowane dane do programu Microsoft Excel w celu przechowywania i dodatkowej analizy.

2. Konfiguracja i procedura długoterminowego testowania LMA

  1. Długoterminowa konstrukcja koszyka do testów LMA
    1. Wytnij otwór o średnicy 5,5 cm w krótkiej ściance standardowej klatki dla myszy. Utwórz pokrycie otworu za pomocą 1/4 cala ocynkowanej siatki stalowej. Przetnij siatkę, tworząc kilka otworów 1/2 cala, aby umożliwić myszowi dostęp do jedzenia. Wypoleruj przyciętą siatkę, aby usunąć ostre krawędzie.
    2. Użyj dodatkowej siatki, aby stworzyć zewnętrzny lej zasypowy bezpośrednio połączony z siatką służącą do zakrycia otworu o długości 5,5 cm. Podłącz lej do siatki służącej do zakrycia otworu i przymocuj zespół do klatki za pomocą aluminiowych nitów.
    3. Zbuduj butelkę na wodę ze standardowego stożka o pojemności 50 ml (Corning) i gumowego korka z 1 otworem (Fisher), który jest nadmiernie nawiercony, aby umożliwić włożenie rurki bez kapania (Sta-Pure Systems). Przymocuj butelkę z wodą do klatki za pomocą taśmy rzepowej (3M) i włóż rurkę sipper przez otwór zakryty siatką.
    4. Podczas długotrwałych testów LMA należy przykryć klatki przezroczystym 1/4 cala pleksiglasu z otworami o średnicy 11 x 1/4 cala, aby zapewnić odpowiednią wentylację.
  2. Pomieszczenie do długoterminowych testów LMA
    1. Konfiguracja długoterminowego pokoju testowego LMA jest identyczna z krótkoterminową LMA. Procedura opisana jest w sekcji 1.2.
  3. Długoterminowa wideografia LMA
    1. Wyśrodkuj i umieść zamontowaną na suficie kamerę na podczerwień z systemem zabezpieczeń bezpośrednio połączoną z komputerem nad obszarem nagrywania w pomieszczeniu testowym. Rejestruj tylko taką liczbę klatek na raz, która skutkuje indywidualną rozdzielczością klatki w ramach możliwości zastosowanego VTS (np. Ethovision XT 7 może jednocześnie śledzić 8 myszy w czasie rzeczywistym).
  4. Procedura długoterminowego testowania LMA
    1. Przetestuj długoterminowe LMA podczas aktywnej/ciemnej fazy cyklu światła. Upewnij się, że czas względem cyklu światła jest taki sam we wszystkich grupach, ponieważ LMA podąża za wzorcem zmierzchowym z większą aktywnością we wczesnym i późniejszym okresie cyklu ciemnego 1. Przetestuj zarówno osoby eksperymentalne, jak i kontrolne w każdej grupie zarejestrowanych myszy, aby zapewnić minimalizację potencjalnych skutków różnic czasowych w LMA.
    2. Myszy testowe należy indywidualnie trzymać i aklimatyzować w zmodyfikowanych klatkach przez co najmniej 24 godziny.
    3. Umieść przegrody i klatki (zawierające pojedyncze myszy) bezpośrednio pod kamerą. Usuń wszystkie materiały zagnieżdżające/wzbogacające z klatek, aby zapewnić niezakłócony widok myszy. Zagrzebanie się myszy w materiale zagnieżdżonym zakłóci zdolność VTS do śledzenia myszy. Umieść przezroczystą pokrywę z pleksiglasu na każdej z klatek, które mają być nagrywane.
    4. W przypadku nagrywania kilku klatek jednocześnie upewnij się, że rozdzielczość jest zgodna z wybranym VTS. Aby ułatwić analizę VTS, umieść klatki identycznie w każdej przegrodzie (tj. w prawym górnym rogu).
    5. Długoterminowe testy LMA są zazwyczaj analizowane w czasie rzeczywistym, a zapis wideo zwykle nie jest tworzony. Nagranie wideo można nagrać za pomocą dodatkowej kamery lub za pomocą nagrywarki DVD połączonej z główną kamerą. Pamiętaj, aby prowadzić szczegółowe zapisy informacji o poszczególnych myszach i grupach.
    6. Skonfiguruj VTS do analizy w czasie rzeczywistym. Cała podłoga klatki powinna obejmować zwrot z inwestycji w śledzenie. Ustaw zwrot z inwestycji dla wszystkich rejestrowanych klatek. Użyj VTS, aby obliczyć całkowitą przebytą odległość (cm), prędkość ruchu (cm/s) i czas trwania ruchu (s). Na rysunku 2 zmienne wykrywania były następujące: 2 cm/s rozpoczyna śledzenie; 1,75 cm/s zatrzymuje śledzenie.
    7. Rozpocznij nagrywanie długoterminowego LMA myszy. Monitoruj czas trwania długoterminowych testów LMA za pomocą zegara skojarzonego z komputerem analizującym.
    8. Podczas testowania trzymaj wszystkich eksperymentatorów poza zasięgiem wzroku myszy, aby nie działały jako zewnętrzna wskazówka wizualna.
    9. Po zakończeniu testów zwróć/wymień materiał zagnieżdżający/wzbogacający, aby zmniejszyć ryzyko rozwoju zachowań podobnych do lęku 8.
  5. Długoterminowa analiza LMA
    1. Długoterminowa analiza LMA odbywa się w czasie rzeczywistym bez generowania nagrania wideo. Wyeksportuj dane do programu Microsoft Excel w celu przechowywania i analizy, jeśli używasz Ethovision XT 7.
    2. Aby wygenerować nagranie wideo na potrzeby długotrwałego LMA, użyj dodatkowej kamery. Upewnij się, że dodatkowa kamera ma wystarczającą pojemność pamięci wystarczającą do przechowywania potencjalnie długich nagrań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przykład wyników krótkotrwałego testu LMA z powtarzanymi pomiarami przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek ten pokazuje, że po podaniu lipopolisacharydu (LPS) myszy utrzymywane w klatkach z indywidualną wentylacją (IVC) szybciej odzyskują krótkotrwałą aktywność lokomotoryczną niż myszy utrzymywane w klatkach w środowisku otoczenia (AEC) 6. Choć początkowy spadek aktywności lokomotorycznej jest podobny w grupach po iniekcji LPS, powrót do podstawowego poziomu LMA jest szybszy u myszy z IVC, podobni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Objawy choroby u myszy obejmują letarg, utratę zainteresowania otoczeniem społecznym i środowiskowym, złe samopoczucie i anoreksję 2-3. U myszy i innych gryzoni LMA można wykorzystać do oceny choroby po aktywacji immunologicznej 4-5. Dodatkowo, długoterminowe LMA oferuje możliwość śledzenia ruchu przez okres 24 godzin (lub dłużej), umożliwiając analizę wywołanych leczeniem zmian w zachowaniu okołodobowym lub zaburzeń we wzorcach snu / czuwania. LMA ma kilka zalet w porównaniu z innymi testami na cho...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Wsparcie: To badanie było wspierane przez National Institutes of Health (DK064862, NS058525 i AA019357 GGF).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kamera wideoSonyHDR-XR500VInne, podobne kamery wideo również mogą działać. Format przechowywania plików (kodek/kontener) musi być zgodny z używanym VTS. Zaleca się, aby przy początkowym tworzeniu VTS najpierw wybrać VTS i współpracować z dostawcą w celu wyboru odpowiedniej kamery, zwłaszcza w odniesieniu do kompatybilności formatu pliku i rozdzielczości wideo.
Nieprzezroczyste przegrody koszykoweProdukowane na zamówienie w oparciu o określone wymiary koszyka. Aby ułatwić analizę obrazu, przegrody powinny być w kolorze zbliżonym do ściółki klatki. Strukturalnie stałe dzielniki są preferowane, ponieważ przyspieszają konfigurację między eksperymentami na wielu myszach, takimi jak te obejmujące powtarzające się pomiary. Solidne, przenośne przegrody klatkowe mogą być wykonane z nieprzezroczystego tworzywa sztucznego o średnicy 1/2 cala i połączone za pomocą szeregu zakładek krzyżowych.
Jasna lub ciemna ściółka (przeciwny kolor sierści myszy)Dostępne w kilku dystrybutorach artykułów dla zwierząt laboratoryjnych, w zależności od lokalizacji.
klatek z pleksiglasuWykonane na zamówienie w oparciu o wymiary klatki.
Oprogramowanie do automatycznego śledzenia wideo (EthoVision XT 7)Noldus Information TechnologyIstnieje wielu producentów VTS, wystarczy użycie innego oprogramowania.
Komputer PCDell Inc.Zobacz minimalne wymagania dostawców oprogramowania VTS dla komputerów PC .generator
białego szumuDohmDSW zależności od potrzeb dostępne są różne generatory białego szumu.
Lampy zaciskowe do wylęgu z czerwonymi żarówkami Dostępnychjest kilka rozmiarów i stylów. Wymagana liczba zależy od wielkości pomieszczenia/potrzeb oświetleniowych. Nie przekraczaj 125 lumenów w pomieszczeniu testowym.
Ławka laboratoryjna lub papierPapier powinien pasować lub być bardzo podobny kolorystycznie do ściółki klatki.
Przezroczyste blaty rzeźniczy

Bibliografia

  1. Goulding, E. H., Schenk, A. K., Juneja, P., MacKay, A. W., Wade, J. M., Tecott, L. H. A robust automated system elucidates mouse home cage behavioral structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20575-20582 (2008).
  2. Kent, S., Bluthé, R. M., Kelley, K. W., Dantzer, R. Sickness behavior as a new target for drug development. Trends Pharmacol. Sci. 13, 24-28 (1992).
  3. Dantzer, R. Cytokine, sickness behavior, and depression. Immunol. Allergy Clin. North Am. 29, 247-264 (2009).
  4. Godbout, J. P., et al. Exaggerated neuroinflammation and sickness behavior in aged mice following activation of the peripheral innate immune system. FASEB J. 19, 1329-1331 (2005).
  5. York, J. M., et al. The biobehavioral and neuroimmune impact of low-dose ionizing radiation. Brain Behav. Immun. 26, 218-227 (2012).
  6. York, J. M., et al. Individually ventilated cages cause chronic low-grade hypoxia impacting mice hematologically and behaviorally. Brain Behav. Immun. 26, 951-958 (2012).
  7. Jennings, M., et al. Refining rodent husbandry: the mouse. Report of the Rodent Refinement Working Party. Lab. Anim. 32, 233-259 (1998).
  8. York, J. M., Blevins, N. A., Baynard, T., Freund, G. G. Mouse testing methods in psychoneuroimmunology. Methods in Molecular Biology. 934, 243-276 (2012).
  9. Dantzer, R., O'Connor, J. C., Freund, G. G., Johnson, R. W., Kelley, K. W. From inflammation to sickness and depression: when the immune system subjugates the brain. Nat. Rev. Neurosci. 9, 46-56 (2008).
  10. Crawley, J. N. Behavioral phenotyping of rodents. Comp. Med. 53, 140-146 (2003).
  11. Karelina, K., et al. Social isolation alters neuroinflammatory response to stroke. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 5895-5900 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Badania w klatkach domowychkr tko terminowe LMAd ugo terminowe LMAanaliza ruchu myszyprzebyta odleg opomiar pr dko ciledzenie w czasie rzeczywistymmodyfikacja klatki

Powiązane artykuły