Jednoczesny pre- i postsynaptyczny zapis elektrofizjologiczny z kokultur nerwowo-mięśniowych Xenopus

Summary

Ten film demonstruje procedury używane do hodowli pierwotnych kultur embrionalnych komórek nerwowych i mięśniowych Xenopus oraz przydatność tego preparatu do jednoczesnego wykonywania nagrań pre- i post-synaptycznych klamerów.

Abstract

Wiele informacji na temat sprzężenia presynaptycznych prądów jonowych z uwalnianiem neuroprzekaźnika uzyskano z preparatów bezkręgowców, w szczególności z synapsy gigantycznej^{kałamarnicy 1}. Jednak poza opisywanym tu preparatem, istnieje niewiele preparatów kręgowców, w których możliwe jest jednoczesne wykonywanie pomiarów uwalniania neuroprzekaźników i presynaptycznych prądów jonowych. Embrionalne neurony ruchowe Xenopus i komórki mięśniowe mogą być hodowane razem w prostej pożywce hodowlanej w temperaturze pokojowej; Utworzą funkcjonalne synapsy w ciągu dwunastu do dwudziestu czterech godzin i mogą być używane do badania rozwoju komórek nerwowych i mięśniowych oraz interakcji synaptycznych przez kilka dni (aż do wystąpienia przerostu). Niektóre zalety tych kokultur w porównaniu z innymi preparatami kręgowców obejmują prostotę przygotowania, zdolność do utrzymania kultur i pracy w temperaturze pokojowej oraz łatwą dostępność synaps utworzonych^2-4. Preparat znalazł szerokie zastosowanie do badania właściwości biofizycznych presynaptycznych kanałów jonowych oraz regulacji uwalniania przekaźnika^5-8. Ponadto preparat znalazł zastosowanie w innych badaniach, w tym w badaniu przerostu neurytów i synaptogenezy^9-12, molekularnych mechanizmów uwalniania neuroprzekaźników^13-15, roli dyfuzyjnych przekaźników w neuromodulacji^16,17 oraz plastyczności synaptycznej in vitro ^18-19.

Protocol

1. Przygotowanie przedeksperymentalne

1. Przygotować następujące roztwory (patrz tabela 1 dla kompozycji): a) 1 litr NFR (Normal Frog Ringer), (b) 100 ml 10% soli fizjologicznej, (c) 100 ml CMF (roztwór wolny od Ca²⁺ / Mg²⁺), (d) 1 ml ITS (insulina-transferyna-selen, Sigma I1884), (e) 100 ml pożywki L-15, (f) 10 ml HCG (ludzka gonadotropina kosmówkowa Sigma CG-10), (g) 100 ml K⁺-roztwór wewnętrzny, h) 100 ml K⁺-roztwór wewnętrzny dla amfoterycyny B. Za pomocą osmometru prężności pary (np. Wescor model #5100C) należy sprawdzić siłę osmotyczną roztworu 1, aby upewnić się, że wynosi ona około 260 mOsM).
2. Filtrować roztwory sterylizacyjne (b) i (c). Roztwory a), b) i c) mogą być przechowywane do trzech miesięcy w temperaturze 4 °C. Przygotować roztwór (d) przez dodanie 1 ml dejonizowanego_H2Odo fiolki zawierającej liofilizowany proszek za pomocą igły strzykawkowej o rozmiarze 25 G i filtra strzykawkowego. Ten końcowy roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 30 dni.
3. Przygotować roztwór (e) w okapie z przepływem laminarnym, łącząc wszystkie składniki w zlewce lub kolbie. Przefiltrować, wysterylizować roztwór końcowy i przenieść 10 ml podwielokrotności do sterylnych probówek wirówkowych. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Przygotować HCG (roztwór (f)) dodając 10 ml dejonizowanego_H20 do fiolki zawierającej liofilizowany proszek za pomocą igły strzykawki o rozmiarze 25 G i filtra strzykawkowego. Ten końcowy roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 30 dni.
5. Wykonaj co najmniej dwa narzędzia do mikrodysekcji, przyklejając szpilkę Minutien (26002-10, Fine Science Tools) do końca szklanej pipety Pasteura za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Pozwól, aby ostry koniec szpilki wystawał poza koniec pipety na około 0,5 cm.
6. Dwa dni przed przygotowaniem kultur wywołaj hodowlę zgodnie z następującą procedurą. Zidentyfikuj gotową do rozrodu parę Xenopus, obserwując wyraźną, czerwonawą kloakę na samicy i ciemną pigmentację na płaskiej powierzchni przednich łap samca. Pojedynczo utrzymaj każdą żabę w sieci i trzymaj ją brzuszną stroną do dołu na zlewie z siatką, aby nie mogła uciec. Wstrzyknąć 1 ml roztworu (f) przez siatkę i podskórnie do jednego z grzbietowych woreczków chłonnych.
7. Umieść parę hodowlaną razem w zakrytym zbiorniku z wodą o pojemności dziesięciu galonów. Aby upewnić się, że zwierzęta nie będą deptać nowo złożonych i zapłodnionych jaj, zainstaluj siatkowaną podłogę o rozmiarze oczek około 1/2 cala, zamontowaną około 1-2 cali nad dnem zbiornika (rysunek 1A).
8. Pozostaw żaby w spokoju przez 12-48 godzin, aż zwierzęta znajdą się w ampleksusie, a zapłodnione jaja zostaną zaobserwowane na podłodze pod ekranem (ryc. 1B).
9. Wyjmij zwierzęta ze zbiornika, ale pozostaw jaja w spokoju przez co najmniej 24 godziny dłużej. Ta para żab może być ponownie rozmnażana po sześciu tygodniach.
10. Poluzować zarodki z dna zbiornika i przenieść je do czterech lub pięciu szalek hodowlanych o wymiarach 60x15 mm zawierających 10% soli fizjologicznej (roztwór b). Posortuj zarodki według etapu zgodnie ze schematem Niewkoopa i Fabera (ref. 20). Pożyteczne zarodki to te w stadium 22-24. Rycina 2A przedstawia zarodek w przybliżeniu w stadium 22, podczas gdy rysunek 2B pokazuje zarodek, który jest zbyt zaawansowany w rozwoju, aby mógł być użyteczny (w przybliżeniu stadium 28). Ważne jest, aby wybierać zarodki, które są zdrowe: idealne są te, które mają gładki wygląd z jasnobrązowymi i białymi cętkami. Zarodki, które mają duże czarne lub białe plamy, są na ogół niezdrowe i bezużyteczne.

2. Mikrodysekcja zarodków Xenopus

1. Wewnątrz okapu z przepływem laminarnym oznaczyć i napełnić mniej więcej do połowy trzy sterylne naczynia hodowlane o wymiarach 60 x 15 mm 10 % solą fizjologiczną, a jedną CMF.
2. Za pomocą sterylnej, szklanej pipety Pasteura przenieś od pięciu do dziesięciu zarodków w stadium 22-24 do jednej z naczyń zawierających 10% soli fizjologicznej. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego z zoomem stereo wewnątrz kaptura (0,6-5x z okularami 10x), usuń galaretowaty płaszcz i błonę witelinową z każdego zarodka za pomocą dwóch par sterylnych kleszczyków #5 (11251-30, Fine Science Tools). (Patrz rysunki 3A i 3B.)
3. Umyj gołe zarodki, przepuszczając je, pojedynczo, przez pozostałe dwie szalki z 10% solą fizjologiczną, a na koniec do naczynia zawierającego CMF. Używaj nowej, sterylnej pipety do każdego transferu i zminimalizuj objętość roztworu przenoszonego z naczynia na naczynie.
4. Z kolei chwyć każdy zarodek delikatnie, ale stanowczo za pomocą kleszczy i za pomocą narzędzia do mikrodysekcji opisanego w kroku 1.5 usuń cewę nerwową i związane z nią miotomy, które znajdują się w najbardziej grzbietowej części zwierzęcia. Zrób to, robiąc trzy plasterki, jeden na każdym końcu miejsca cewy nerwowej, a trzeci tuż brzusznie do niej (ryc. 4A). Przenieś każdą wypreparowaną rurkę nerwową/miotom do czystej części naczynia, z dala od granulek żółtka i innych zanieczyszczeń (ryc. 4B). Oś grzbietowo-brzuszna oraz lokalizacje cewy nerwowej i miotomów przedstawiono na rycinie 4.
5. Po około piętnastu minutach w tym roztworze (CMF) użyj kleszczy, aby podnieść pigmentowaną skórę z wypreparowanej tkanki i wyrzucić. Po dodatkowych 30-60 minutach komórki utworzą "stos piasku", gdy zostaną oddzielone od siebie (ryc. 4C).

3. Przygotowanie kokultur nerwowo-mięśniowych

1. Rozmrozić 10 ml probówki z pożywką hodowlaną i aseptycznie dodać 70 μl ITS i 35 ng/ml BDNF (Sigma B3795).
2. Oznaczyć i napełnić sterylne szalki hodowlane o średnicy 35 mm (FD35-100 World Precision Instruments) mniej więcej do połowy pożywką hodowlaną L-15 (roztwór (e)), po jednej dla każdego wypreparowanego zarodka.
3. Wykonaj pipetę do powlekania, chwytając każdy koniec szklanej pipety Pasteura, trzymając zwężającą się część nad płomieniem. Rozsuń końce na około 10 cm, a następnie oderwij koniec, aby uzyskać końcówkę o średnicy około 0,2 mm.
4. Użyj pipety do posiewu, aby zassać "stos piasku" z jednego zarodka, minimalizując ilość pobranego roztworu. Wyrzuć komórki na dno naczynia hodowlanego. Ułóż komórki w kilka linii. Obserwuj posiane niezróżnicowane komórki (ryc. 5A i 5B).
5. Pozostaw naczynia z posiaczonymi komórkami w spokoju przez co najmniej piętnaście minut, aby dać komórkom czas na przyczepienie się do naczynia.

4. Łata zaciskająca synapsy nerwowo-mięśniowe

1. Po 12-24 godzinach w hodowli posiane komórki nabierają wyraźnych cech morfologicznych: komórki mięśniowe stają się wrzecionowate, a neurony rdzeniowe wydłużają długie procesy (ryc. 6). Funkcjonalny kontakt synaptyczny między żylakami neurytów a komórkami mięśniowymi można potwierdzić za pomocą jednoczesnych sparowanych zapisów elektrofizjologicznych. "M", "S" i "V" odnoszą się odpowiednio do komórki mięśniowej, somy neuronalnej i żylaków presynaptycznych.
2. Przygotuj dwie elektrody plastrowe do rejestracji: jedną dla żylaków presynaptycznych i jedną dla komórki mięśniowej.
3. Dla elektrody presynaptycznej przygotować roztwór zawierający amfoterycynę w następujący sposób: Dodać 100 μl DMSO do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej zawierającej 5 mg amfoterycyny B (Sigma A4888). Wiruj ten roztwór przez 10 sekund. Następnie dodać 10 μl tego roztworu do drugiej probówki do mikrowirówki, która zawiera 625 μl K⁺-wewnętrznego roztworu amfoterycyny B (roztwór (h)). Wir jak wyżej.
4. Wypełnić elektrodę presynaptyczną roztworem wewnętrznym K⁺ zawierającym amfoterycynę, przygotowanym w kroku 4.3, a elektrodę postsynaptyczną roztworem wewnętrznym K⁺ (roztwór (g)).
5. Zastąp pożywkę w naczyniu hodowlanym NFR i przenieś ją do odwróconego mikroskopu wyposażonego w optykę z kontrastem fazowym.
6. Umieść obie elektrody tuż nad odpowiednimi celami. Uzyskaj konfigurację całej komórki z elektrodą komórki mięśniowej przed konfiguracją perforowanej łaty z elektrodą żylaków.
7. Aby potwierdzić funkcjonalność synapsy, należy zdepolaryzować żylaki za pomocą wzmacniacza patch clamp (np. Axopatch 200B, Molecular Devices) pod kontrolą oprogramowania (np. przez pCLAMP 9, Molecular Devices) i obserwować jednoczesne prądy presynaptyczne i postsynaptyczne. Rysunek 7 przedstawia prądy obserwowane w odpowiedzi na depolaryzujące kroki napięcia podawanego do żylaków presynaptycznych w krokach co 10 mV od -30 mV do +40 mV. Prądy wewnętrzne obserwowane w komórce presynaptycznej są przenoszone przez Na⁺ i Ca²⁺, a prądy zewnętrzne przez K⁺. Prądy rejestrowane w komórce postsynaptycznej są odpowiedziami na neuroprzekaźnik uwalniany z żylaków i są przenoszone głównie przez Na⁺ przez kanały nikotynowego receptora acetylocholiny.

Results

Rysunek 4B pokazuje widok grzbietowy izolowanego rdzenia kręgowego/miotomii bezpośrednio po jego usunięciu z zarodka Xenopus w stadium 22. Rysunek 4C pokazuje, że po usunięciu skóry i inkubacji w roztworze wolnym od Ca²⁺-Mg²⁺ (CMF, roztwór (c)), komórki dysocjują na "stos piasku" i są gotowe do posiewu. Bezpośrednio po posiewie w pożywce hodowlanej komórki wykazują niewielką zmienność morfologiczną (ryc. 5B), ale przybierają wyraźne kształty po dwudziestu czterech godzinach w hodowli. Komórki mięśniowe stają się wrzecionowate, podczas gdy neurony pozostają kuliste, jednocześnie wydłużając neuryty, które rozwijają żylaki w synapsach z komórkami mięśniowymi (ryc. 6). Jednoczesny zapis sparowanych łat z presynaptycznej komórki mięśniowej żylaków i postsynaptycznych (ryc. 7) ujawnia presynaptyczne prądy wewnętrzne i zewnętrzne związane z uwalnianiem neuroprzekaźnika i wynikającymi z tego pobudzającymi prądami postsynaptycznymi.

Rysunek 1. ZA: Hodowlana para żab w wiadrze godowym na górze ekranu. Z punktu widzenia Żaby w ampleksie z zapłodnionymi jajami.

Rysunek 2. ZA: "odpowiedni" zarodek w stadium 22. Z punktu widzenia "nieodpowiedni" zarodek w stadium 28. Podziałka liniowa odpowiada 1 mm.

Rysunek 3. ZA: Etap 22 zarodek przed usunięciem błony witelinowej i galaretki. Strzałka wskazuje zewnętrzną krawędź galaretowa powłoki. Błona witelinowa ściśle przylega do zarodka i jest praktycznie niewidoczna. Z punktu widzenia Nagi zarodek. Podziałka liniowa odpowiada 1 mm.

Rysunek 4. ZA: Zarodek w stadium 22 z przerywaną linią wskazującą część do wypreparowania. Z punktu widzenia Ostro izolowana grzbietowa część zarodka; "D" i "V" odnoszą się do grzbietowej i brzusznej części zarodków, podczas gdy "M" i "N" wskazują przybliżone lokalizacje mytomów i cewy nerwowej. Ład: "Stos piasku" komórek po 60 minutach w CMF. Podziałka liniowa reprezentuje 1 mm dla A i 0,5 mm dla B i C.

Rysunek 5. A: 5-krotny podgląd mocy komórek w hodowli bezpośrednio po posiewaniu. B: Ta sama kultura przy 40x. Podziałka liniowa reprezentuje 40 μm dla A i 5 μm dla B.

Rysunek 6. Połączenie nerwowo-mięśniowe w hodowli z identyfikacją somy neuronalnej (S), żylaków presynaptycznych (V) i postsynaptycznych komórek mięśniowych (M). Podziałka: 5 μm.

Rysunek 7. Prądy presynaptyczne (górne) i postsynaptyczne (dolne) obserwowane w odpowiedzi na zastosowanie przyrostowych kroków napięcia 10 mV prezentowanych dla żylaków presynaptycznych od -30 mV do +40 mV. Stopnie napięcia są wskazane obok niektórych ścieżek presynaptycznych. Potencjał podtrzymania dla obu ogniw wynosił -70 mV.

Discussion

Kluczowymi etapami udanej wspólnej hodowli neuronów ruchowych i komórek mięśniowych jest wykorzystanie odpowiednio zaawansowanych zarodków powstałych w wyniku indukowanej hodowli żab Xenopus oraz staranne, aseptyczne rozwarstwienie niezróżnicowanych neuronów rdzeniowych i mioblastów. Zapłodnione jaja należy pozostawić w spokoju, dopóki nie osiągną około 10 stadium, ponieważ wcześniejsze ich przeniesienie często zatrzymuje ich rozwój. Zdrowe zarodki można rozpoznać po gładkim wyglądzie i brązowo-białym nakrapianym zabarwieniu. Zarodki w stadium 22-24 są najbardziej przydatne, ponieważ jest to moment podczas rozwoju, tuż po zamknięciu cewy nerwowej i przed znacznym zróżnicowaniem miocytów. Ponadto komórki ze starszych zarodków nie dysocjują dobrze w CMF. Należy zachować ostrożność podczas usuwania błony witeliny, ponieważ silnie przylega ona do zarodka. Błonę należy rozerwać ostrymi kleszczami, aby zarodek wyszedł nienaruszony. Innym ważnym środkiem ostrożności jest ostrożne umieszczenie komórek na dnie naczynia hodowlanego (zamiast pozwalania im tam osiąść). Ta metoda jest preferowana, ponieważ zwiększa prawdopodobieństwo, że komórki będą przylegać do naczynia hodowlanego.

Funkcjonalne neuroprzekaźnictwo między nerwem a mięśniem można określić za pomocą samego zapisu postsynaptycznego i często można je ustalić, obserwując spontaniczny skurcz mięśni po unerwieniu. Nieunerwione komórki mięśniowe nie drgają w hodowli. Sam zapis postsynaptyczny jest przydatny do rejestrowania miniaturowych prądów lub potencjałów płytki końcowej, ale pomiary uwolnienia wywołanego wymagają stymulacji presynaptycznej, a korelacja prądów pre- i postsynaptycznych wymaga podwójnego patch-clamp.

Oprócz opisanej tutaj metody zapisu sparowanych plastrów, preparat ten daje możliwość wprowadzenia trzeciej pipety do somy neuronalnej⁵ Pozwala to na wygenerowanie potencjału czynnościowego, który może rozprzestrzeniać się do żylaków presynaptycznych i prowadzić do uwolnienia neuroprzekaźnika. Ponadto przypuszczalne czynniki, które uważa się za pośredniczące lub modulujące przekaźnictwo synaptyczne, mogą być wprowadzane po obu stronach synapsy: za pomocą pipety komórek mięśniowych lub poprzez dyfuzję z trzeciej pipety umieszczonej w somie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insulina-Transferyna-Selen	Sigma	I1884
Ludzka gonadotropina kosmówkowa	Sigma	CG-10
Osmometr ciśnienia pary	Wescor	5100C
Szpilki	Minutien Narzędzia naukowe	26002-10
Amfoterycyna B	Sigma	A4888
Kleszcze	Narzędzia do nauki	11251-30
Nazwa rozwiązania Przepis (a) NFR (Normalny dzwonek żaby (w mM) 116 NaCl, 2 KCl, 1,8 CaCl2, 5 Na+-HEPES, pH 7,35, (b) 10% soli fizjologicznej 10 ml NFR+90 ml dejonizowany H2O (c) CMF (Ca2+ /Mg2+-free solution) 125 NaCl, 2 KCl, 1,2 EDTA, 5 Na+-HEPES, pH 7,35, (e) L-15 Pożywka hodowlana 50 ml Pożywka L-15 (Sigma L1518) + 50 ml NFR. g) K+-roztwór wewnętrzny (w mM) 116 KCl, 1 NaCl, 1 MgCl2, 10 EGTA, 5 HEPES, pH 7,3 (h) K+-wewnętrzny roztwór dla amfoterycyny B (w mM) 52 K2SO4, 38 KCl, 1 EGTA, 5 HEPES, pH 7,3
Tabela 1.