Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza embrionalnych i larwalnych włókien mięśniowych szkieletu danio pręgowanego z preparatów zdysocjowanych

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50259

⸱

13 listopada 2013

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Pediatrics and Neurology, University of Michigan

W tym artykule

Podsumowanie

Danio pręgowany to nowy system do modelowania zaburzeń mięśni szkieletowych u ludzi. Opisujemy szybką i skuteczną metodę izolowania włókien mięśniowych mięśni szkieletowych od embrionalnego i larwalnego danio pręgowanego. Metoda ta pozwala uzyskać preparat z włókien mięśniowych o dużej gęstości, odpowiedni do badania morfologii pojedynczych włókien mięśni szkieletowych, lokalizacji subkomórkowej białek i fizjologii mięśni.

Streszczenie

Danio pręgowany okazał się cennym modelem do badania funkcji mięśni szkieletowych i do badania chorób mięśni ludzkich. Pomimo wielu zalet oferowanych przez analizę in vivo mięśni szkieletowych u danio pręgowanego, wizualizacja złożonego i drobno ustrukturyzowanego środowiska białkowego odpowiedzialnego za funkcjonowanie mięśni, zwłaszcza w całych zarodkach, może być problematyczna. Przeszkoda ta wynika z niewielkich rozmiarów mięśni szkieletowych danio pręgowanego (60 μm) i jeszcze mniejszych rozmiarów sarkomeru. Tutaj opisujemy i demonstrujemy prostą i szybką metodę izolowania włókien mięśniowych szkieletu z zarodków i larw danio pręgowanego. Dołączamy również protokoły, które ilustrują techniki postprepakuracji przydatne do analizy struktury i funkcji mięśni. W szczególności szczegółowo opisujemy późniejszą immunocytochemiczną lokalizację białek mięśni szkieletowych oraz analizę jakościową stymulowanego uwalniania wapnia za pomocą obrazowania wapnia w żywych komórkach. Ogólnie rzecz biorąc, ten artykuł wideo przedstawia prostą i skuteczną metodę izolacji i charakterystyki włókien mięśniowych szkieletu danio pręgowanego, technikę, która stanowi kanał dla niezliczonych późniejszych badań nad strukturą i funkcją mięśni.

Wprowadzenie

Mięsień szkieletowy to wysoce wyspecjalizowana tkanka odpowiedzialna za generowanie sił skurczowych niezbędnych do motoryki. Skurcz jest inicjowany w procesie znanym jako sprzężenie wzbudzenie-skurcz (EC), który przekształca sygnały elektryczne w uwalnianie wapnia z zapasów wewnątrzkomórkowych1,2 . Wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia aktywuje sarkomer do skrócenia i wytworzenia siły. Wiele specyficznych składników maszynerii molekularnej odpowiedzialnych za pośredniczenie w przekazywaniu połączeń nerwowo-mięśniowych3, sprzężeniu EC4,5 i skurczach zależnych od aktyny-miozyny6 nadal jest przedmiotem intensywnych badań. Ponadto zidentyfikowano i zbadano bardzo szczegółowo białka, które stabilizują błonę mięśniową podczas skurczu7,8 i pośredniczą w sygnalizacji między włóknem mięśniowym a macierzą zewnątrzkomórkową7,9.

Mutacje w wielu genach ważnych dla struktury i funkcji mięśni zostały zidentyfikowane jako przyczyny chorób mięśni szkieletowych u ludzi (http://www.musclegenetable.org/). Choroby te, klasyfikowane ogólnie jako miopatie szkieletowe i dystrofie mięśniowe na podstawie cech klinicznych i histopatologicznych, są związane z osłabieniem mięśni, niepełnosprawnością przez całe życie i wczesną śmiertelnością10,11 . Danio pręgowany okazał się znakomitym systemem do modelowania i badania chorób mięśni szkieletowychu ludzi 8,12,13 . Został on wykorzystany do walidacji nowych mutacji genów8, zdefiniowania nowych aspektów patofizjologii choroby14,15 oraz identyfikacji nowych podejść terapeutycznych15,16 . Moc danio pręgowanego w badaniu chorób mięśni u ludzi wiąże się z dużą liczbą potomstwa, szybkim rozwojem struktury i funkcji mięśni, jasnością optyczną zarodka danio pręgowanego oraz łatwością manipulacji genetycznej i farmakologicznej rozwijającego się danio pręgowanego17.

My i inni12,18,19 opracowaliśmy ostatnio prostą technikę szybkiej i efektywnej izolacji włókien mięśniowych od rozwijającego się danio pręgowanego. Metodologia ta umożliwiła bardziej szczegółowe badanie włókien mięśniowych niż jest to możliwe w przypadku analizy całego zarodka. Technika ta została wykorzystana do scharakteryzowania lokalizacji subkomórkowej białek20, a także do identyfikacji ważnych cech histopatologicznych w ramach badań walidacyjnych w nowo opracowanych modelach choroby21. Co więcej, izolowane włókna mięśniowe mogą być dodatkowo wykorzystywane do obrazowania na żywo i do badań elektrofizjologicznych22, technik, które pozwalają na badanie kluczowych aspektów funkcjonowania mięśni. Szczegółowy protokół izolacji włókien mięśniowych, wraz z dwoma przykładami późniejszych eksperymentów analitycznych, jest szczegółowo opisany w pozostałych częściach tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną (Czas: 1 godz.)

Powłoka szkiełek nakrywkowych pozwala na szybkie osadzanie się i przyleganie włókien mięśniowych. Można to wykonać podczas etapu dysocjacji izolacji włókien mięśniowych (krok 2 poniżej).

  1. Wytnij i umieść Parafilm na dnie szalki Petriego o średnicy 60 mm (dowolnej marki).
  2. Umieścić szkiełka nakrywkowe mikroskopu (o średnicy 12 mm) na Parafilm w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm lub umieścić je pojedynczo w pojedynczych dołkach z płytkami 24-dołkowymi.

Uwaga 1: Te małe okrągłe szkiełka nakrywkowe pomagają skoncentrować liczbę włókien mięśniowych i zmniejszyć nadmierne użycie przeciwciał.

Uwaga 2: Szkiełka nakrywkowe o innych rozmiarach będą działać; jednak objętości używanych odczynników i zarodków będą musiały być odpowiednio dostosowane.

  1. Odmierzyć pipetą 50-200 μl roztworu poli-L-lizyny (0,01%) na każde szkło nakrywkowe na szalce Petriego.
  2. Pozostawić szkiełka nakrywkowe na co najmniej godzinę w temperaturze 37 °C. Dłuższe inkubacje nie wpłyną negatywnie na wyniki.
  3. Usunąć roztwór poli-L-lizyny ze szkła nakrywkowego i przemyć dwukrotnie co najmniej 100 μl 1x PBS.
  4. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia.
  5. Szkiełka nakrywkowe są teraz gotowe na włókna mięśniowe.

Uwaga 3: Aby zapewnić sterylność, powłokę można wykonać w kapturze i na autoklawowanych szkiełkach nakrywkowych.

Uwaga 4: Trzymaj 60-milimetrową szalkę Petriego z Parafilmem na dnie. Ta konfiguracja będzie używana podczas powlekania włókien mięśniowych i znakowania immunologicznego (późniejsze kroki).

Alternatywa 1: Zamiast powlekania szkiełek nakrywkowych bezpośrednio przed użyciem, można użyć powlekanego materiału na szkiełko nakrywkowe. Szalka Petriego o średnicy 60 mm zawierająca co najmniej 2 ml poli-L-lizyny może być przechowywana w temperaturze 4 °C i zawiera liczne szkiełka nakrywkowe. W przypadku tej alternatywy zacznij od kroku 1.5, aby przetworzyć szkiełka nakrywkowe na włókna mięśniowe.

Alternatywa 2: Również pokrywamy szkiełka nakrywkowe poli-L-ornityną. Jest to bardziej pracochłonne, ale jest przydatne w przypadku hodowli długoterminowej, ponieważ szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-ornityną mogą być poddawane obróbce UV. Dzięki leczeniu promieniowaniem UV i starannej sterylnej technice, żywe włókna mięśniowe można zazwyczaj utrzymać w hodowli przez 4-7 dni.

2. Dysocjacja zarodków danio pręgowanego i posiewanie włókien mięśniowych (Czas: 1 do 3 godzin)

Uwaga: standardowy protokół najlepiej stosuje się do zarodków o wartości 3 dpf (dni po zapłodnieniu).

  1. Przenieś zarodki danio pręgowanego do standardowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i usuń jak najwięcej nadmiaru wody dla ryb. Zazwyczaj 10-20 zarodków w probówce, choć można użyć mniej. Użycie więcej niż 20-25 zarodków często powoduje przygotowanie nadmiernej gęstości.
    1. Usuń kosmówkę przed dysocjacją, ręcznie za pomocą kleszczy #5. Alternatywnie, chemiczne usuwanie kosmówki uzyskuje się za pomocą 10-15 minutowego zabiegu Pronase. Zazwyczaj wcześniejsze usunięcie kosmówki jest konieczne tylko wtedy, gdy wymagane jest wcześniejsze potwierdzenie zmutowanego fenotypu lub morfologii lub gdy stosuje się etapy, w których zarodki są naturalnie wykluwane z ich kosmówki.
  2. Dodać 900 μl pożywki niezależnej od CO2 do probówki zawierającej zarodki.
  3. Dodać 100 μl kolagenazy typu II, końcowe stężenie 3,125 mg/ml (podstawowy roztwór kolagenazy o stężeniu 31,25 mg/ml rozcieńczony w 1x PBS), aby rozpocząć dysocjację. Kolagenaza IV może być również stosowana do dysocjacji.
  4. Obracaj zarodki na wytrząsarce orbitalnej i dziel się trituracją co 30 minut w RT za pomocą Pipetmana P1000 do trituracji.

Uwaga 2: Uważnie monitoruj dysocjację zarodków; nadmierna lub niedostateczna dysocjacja (szczególnie nad) to najczęstsze przyczyny niepowodzenia protokołu. Czas trawienia będzie się różnić w zależności od intensywności rozdrobnienia, liczby zarodków w probówce i wieku zarodków. Jest też często mniejsza (w porównaniu z typami dzikimi) w przypadku zarodków z mutantów mięśni szkieletowych.

Uwaga 3: Średni czas trawienia na wiek zarodka: 1 dpf = 1 godzina, 2 dpf = 1,5 godziny, 3 dpf = 2 godziny i 4 dpf = 2-2,5 godziny.

  1. Przerwij trawienie, gdy nie widać całych zarodków, ale nadal widoczne są stałe kawałki - jest to niezbędne, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu.
  2. Probówki wirówkowe ze zdysocjowanymi zarodkami w ilości 0,8-2,3 x g przez 3-5 minut do osadzania komórek.
  3. Usunąć supernatant z granulowanych komórek i przemyć 2x pożywką niezależną od CO2
    4. .
  4. Dodaj świeże podłoże niezależne od CO2 w celu ponownego zawieszenia komórek. 1 ml jest zwykle używany do przygotowania 10-20 zarodków. Objętość można skalować na podstawie liczby zarodków.
  5. Za pomocą pipety P1000 przepuścić zawiesinę zarodków przez filtr 70 μm. Pomaga to usunąć niechciane zanieczyszczenia z preparatu.

Uwaga 4: Zawiesina zarodków może być przefiltrowana po raz drugi przez filtr 40 μm, aby dalej usunąć niechciane zanieczyszczenia. Po podwójnej filtracji odzysk wynosi około 800 μl z początkowej objętości 1 ml.

  1. Dodać około 50-100 μl zawiesiny włókien mionowych do każdego szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-L-lizyną.

Uwaga 5: Wykonaj krok 2.9 na szalkach Petriego z Parafilmem na dnie, wcześniej przygotowanym. Parafilm zapobiega spływaniu zawiesiny włókien mięśniowych z powlekanych szkiełek nakrywkowych. Szalki Petriego należy przykryć, aby zapobiec parowaniu.

  1. Pozwól włókien mięśniowych osiąść na powlekanych szkiełkach nakrywkowych przez około 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

Uwaga 6: Włókna mięśniowe zaczną się osadzać w ciągu 5-10 minut. Jednak dla dobrego przyczepienia włókien mięśniowych zaleca się co najmniej 1 godzinę (1-2 godziny). Pozostawienie włókien mięśniowych na dłuższe osiadanie nie zaszkodzi przygotowaniu. W przypadku dłuższych inkubacji (w tym przez noc) do pożywki można dodawać antybiotyki. Dzięki antybiotykom i sterylnej technice żywe kultury mogą być zwykle utrzymywane przez 1-2 dni.

  1. W tym momencie można zaobserwować żywe włókna mięśniowe. Włókna mięśniowe z zarodków 2 dpf i późniejszych będą widoczne jako komórki prążkowane i wydłużone (ryc. 1). W tym momencie włókna mięśniowe są teraz gotowe do analizy na żywo lub do znakowania immunologicznego.

Uwaga 7: Mięśnie szkieletowe z zarodków 1 dpf nie pokrywają się jako wydłużone i wyraźnie prążkowane włókna. Zamiast tego widoczne są duże miokule. Ponadto, podczas fazy granulowania po dysocjacji (krok 2.6), 1 dpf miokulek musi być odwirowywana przez co najmniej 8 minut przy 5,000 x g, aby uzyskać osad. Do analizy zarodków na tym etapie zaleca się stosowanie linii transgenicznej wykazującej ekspresję EGFP specyficznie w mięśniach szkieletowych23. Umożliwi to identyfikację komórek pochodzenia mięśniowego w porównaniu z innymi źródłami.

3. Barwienie immunologiczne fluorescencji zdysocjowanych włókien mięśniowych danio pręgowanego (czas: około 1 dzień)

3.1. Znakowanie immunologiczne

  1. Usuń część podłoża z włókien mięśniowych przyklejonych do powlekanego szkiełka nakrywkowego
  2. Napraw komórki za pomocą 4% paraformaldehydu lub metanolu. W przypadku PFA usuń 1/2 objętości nośnika i zastąp taką samą ilością PFA. Utrwalaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usuń całkowitą objętość, zastąp 50-100 μl PFA i utrwalaj przez dodatkowe 10 minut. Do utrwalania alkoholu można stosować lodowaty metanol lub aceton w temperaturze 4 °C odpowiednio przez 10 minut lub 5 minut.
  3. Umyj włókna mięśniowe co najmniej 3-5 razy za pomocą 1x PBS lub 1x PBS plus 0,1% TWEEN. Średnia objętość prania wynosi 50-100 μl na szkiełko nakrywkowe.
  4. Dodać roztwór blokujący do włókien mięśniowych (materiał roboczy) i inkubować 20-60 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór blokujący będzie się różnić w zależności od przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Dwa najczęściej stosowane w laboratorium to (1) 1x PBS, 2 mg/ml BSA, 1% surowica owcza, 0,25% Triton X-100 final i (2) 0,2% Triton X-100, 2 mg/ml (0,2% BSA) i 5% surowica owcza/kozia.
  5. Usunąć roztwór blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym lub PBS. Inkubować włókna mięśniowe przez noc w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że folia lub owiń saran szalkę Petriego zawierającą szkiełka nakrywkowe obciążone miofibrą pokryte przeciwciałem. Można dodać małe kawałki zwilżonego ręcznika papierowego, aby stworzyć nawilżoną komorę.
  6. Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe z szkiełek nakrywkowych i przemyć szkiełka nakrywkowe 3-5 razy przez 5 minut PBS lub roztworem blokującym.
  7. Dodać przeciwciało drugorzędowe o odpowiednim stężeniu rozcieńczone w 1x PBS lub roztworze blokującym przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
  8. Usuń przeciwciało wtórne i przemyj włókna mięśniowe 3-5x w PBS przez 5 minut każde w RT.

3.2. Montaż szkiełek nakrywkowych

  1. Nałóż 1-2 krople odczynnika zapobiegającego blaknięciu na szkiełko mikroskopowe.
  2. Ostrożnie podnieś powlekane i immunologiczne szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy i umieść (włóknami mięśniowymi w dół) szkiełko nakrywkowe na odczynniku zapobiegającym blaknięciu na szkiełku mikroskopowym.

Uwaga 1: Uwaga na orientację powlekanego szkiełka nakrywkowego jest kluczowa.

  1. Połóż 1-2 chusteczki Kimwipes na twardej, twardej powierzchni. Szybko odwróć szkiełko podstawowe z powlekanymi szkiełkami nakrywkowymi spoczywającymi na odczynniku zapobiegającym blaknięciu i umieść je (szkiełko nakrywkowe w dół) na chusteczkach Kimwipes.
  2. Lekko dociśnij rogi szkiełka mikroskopowego, aby usunąć nadmiar płynu zapobiegającego blaknięciu i utworzyć szczelne uszczelnienie między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym
  3. Pozostaw płyn zapobiegający blaknięciu do wyschnięcia przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie włókna mięśniowe są gotowe do obrazowania (rysunki 2A i B) lub przechowywania w temperaturze 4 °C.

4. Obrazowanie wapnia na żywych komórkach za pomocą GCaMP3

Eksperymenty z żywymi komórkami mogą być przeprowadzane na włóknach mięśniowych przed fiksacją (po kroku 2.10). Poniższy protokół opisuje obrazowanie na żywo we włóknach mięśniowych wykazujących ekspresję GCaMP324, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia, wyrażanego przez specyficzny dla mięśni szkieletowych promotor α-aktyny danio pręgowanego (pSKM)23. Alternatywnie, technikę tę można łatwo dostosować do stosowania barwników wskaźnikowych wapnia, takich jak Fura-2.

  1. Wstrzyknąć zarodkom pSKM: konstrukt GCaMP3 w stadium 1-2 komórek
  2. Przy 3 dpf zebrać larwy i przygotować włókna mięśniowe zgodnie z opisem w sekcjach 1 i 2. Pozwól włókien mięśniowych przylegać przez co najmniej 1 godzinę. Do tej techniki wymagane jest przygotowanie szkiełek nakrywkowych w naczyniach 24-dołkowych.
  3. Ostrożnie usuń nadmiar pożywki i dodaj 300 μl świeżych niezależnych pożywek CO2 w temperaturze pokojowej.
  4. Obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem. Włókna mięśniowe GCaMP3 dodatnie powinny być widoczne pod wpływem zielonej fluorescencji.
  5. W razie potrzeby skonfiguruj kamerę do nagrywania.
  6. Przygotować 30 mM roztwór kofeiny w pożywce niezależnej od CO2 . Aby pobudzić komórki, delikatnie odpipetuj 300 μl roztworu kofeiny do powiększonej studzienki. W ciągu 5-10 sekund włókna mięśniowe GCaMP dodatnie powinny reagować na kofeinę szybkim wzrostem fluorescencji (ryc. 3). Włókna mięśniowe mogą również się kurczyć. Warto zauważyć, że kofeina indukuje uwalnianie wapnia z zapasów retikulum sarkoplazmatycznego25. Inne środki, takie jak KCl26 i ryanodine4, mogą być stosowane do badania indukowalnego uwalniania wapnia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Fluorescencyjne znakowanie immunologiczne włókien mięśniowych (Rysunek 2)

Obrazy przedstawiające oczekiwany wzór znakowania fluorescencyjnego włókien mięśniowych poddanych immunostynowaniu po pomyślnej izolacji i wysiewie. Włókna mięśniowe zostały znakowane przeciwciałami przeciwko receptorowi ryanodyny (1:100) (Rycyna 2A) lub przeciwko α-aktyninie (1:100) (Rycina 2B), co ujawnia odpowiednio immunostynowanie triady oraz prążka Z. Jak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Danio pręgowany to potężny system modelowy kręgowców do badania rozwoju i funkcji mięśni in vivo25,27,28 . Okazały się również cennym zasobem w modelowaniu chorób mięśni u ludzi14,15,20,29 . Chociaż poczyniono ogromne postępy w celu przyspieszenia wykorzystania i zastosowania danio pręgowanego do badania funkcji mięśni i chorób mięśni, istnieje ciągła krytyczna potrzeba opracowania narzędzi, które pozwolą na bardziej dogłębną analizę, która uzupełni genetyczne, morfologiczne, behawioralne i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować członkom laboratorium Dowlinga (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta i William Telfer), którzy przyczynili się do rozwoju techniki i produkcji manuskryptu. Praca ta została sfinansowana przez Instytut Taubmana, Wydział Pediatrii Uniwersytetu Michigan oraz częściowo z grantów Stowarzyszenia Dystrofii Mięśniowej (JJD MDA186999) i Narodowych Instytutów Zdrowia (JJD 1K08AR054835).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowa płytkahodowlana Corning3524
10x PBSInvitrogen Gibco70011
CO2 Niezależna pożywkaInvitrogen Gibco18045
Kolagenaza typu IIWorthington BiochemicalLS004186Lot 41H12764
Kolagenaza typu IVWorthingtonBiochemical L5004188
8% ParaformaldehydMikroskopia elektronowa Nauki157-8
MetanolSigma322415
Triton X-100SigmaX100
BSASigmaA2153
Surowica owczaSigmaS3772
Surowica koziaSigmaG9023
Szkiełka nakrywkoweFischerbrand12-545-82 12CIR-1D
Poli-L-LizynaSigmaP4707
PronaseSigmaP5147
40 μ m FiltrBD Biosciences352340
70 μ m FiltrBD Biosciences352350
Odczynnik przeciw blaknięciu Prolong GoldInvitrogenP36931
Przeciwciało anty-&alfa-aktyninoweSigmaA5044
Przeciwciało anty-RYRAbcam34C
Alexa Przeciwciało fluoroweInvitrogenA-21425
TWEEN 20SigmaP1379
60 mm szalka PetriegoFischerbrand0875713A
Poly-L-OrnitynaSigmaP4957
Szkiełko mikroskopoweFischerbrand12-550-15
KofeinaSigmaC0750

Bibliografia

  1. Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
  2. Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling. J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).
  3. Ohno, K. Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction. Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).
  4. Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
  5. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  6. Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).
  7. Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).
  8. Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
  9. Barresi, R., Campbell, K. P. Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease. J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).
  10. Emery, A. E. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey. Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).
  11. Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. Congenital myopathies: an update. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).
  12. Bassett, D. I., Currie, P. D. The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy. Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).
  13. Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).
  14. Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5, (2009).
  15. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  16. Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).
  17. Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
  18. Nixon, S. J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).
  19. Schredelseker, J., et al. The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).
  20. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).
  21. Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy. Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).
  22. Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit. J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).
  23. Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).
  24. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
  25. Zhou, W., et al. Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants. Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).
  26. Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).
  27. Hirata, H., et al. accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1. Development. 131, 5457-5468 (2004).
  28. van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
  29. Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).
  30. Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).
  31. Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres. J. Physiol. 564, 451-464 (2005).
  32. Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs. Nature. 346, (1990).
  33. Sakowski, S. A., et al. A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture. J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).
  34. Nakano, Y., et al. Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation. Development. 137, 1689-1698 (2010).
  35. Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
  36. Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zarodkowe larwy danio pr gowanegoizolacja w kien mi niowychpowlekanie poli L lizyndysocjacja zarodkamikroskopia immunofluorescencyjnaobrazowanie wapniatraktowanie kolagenazlokalizacja bia ek mi niowychsprz enie wzbudzenie skurcz
Analiza embrionalnych i larwalnych włókien mięśniowych szkieletu danio pręgowanego z preparatów zdysocjowanych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.