Analiza embrionalnych i larwalnych włókien mięśniowych szkieletu danio pręgowanego z preparatów zdysocjowanych

Mięsień szkieletowy to wysoce wyspecjalizowana tkanka odpowiedzialna za generowanie sił skurczowych niezbędnych do motoryki. Skurcz jest inicjowany w procesie znanym jako sprzężenie wzbudzenie-skurcz (EC), który przekształca sygnały elektryczne w uwalnianie wapnia z zapasów wewnątrzkomórkowych^1,2 . Wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia aktywuje sarkomer do skrócenia i wytworzenia siły. Wiele specyficznych składników maszynerii molekularnej odpowiedzialnych za pośredniczenie w przekazywaniu połączeń nerwowo-mięśniowych³, sprzężeniu EC^4,5 i skurczach zależnych od aktyny-miozyny⁶ nadal jest przedmiotem intensywnych badań. Ponadto zidentyfikowano i zbadano bardzo szczegółowo białka, które stabilizują błonę mięśniową podczas skurczu^7,8 i pośredniczą w sygnalizacji między włóknem mięśniowym a macierzą zewnątrzkomórkową^7,9.

Mutacje w wielu genach ważnych dla struktury i funkcji mięśni zostały zidentyfikowane jako przyczyny chorób mięśni szkieletowych u ludzi (http://www.musclegenetable.org/). Choroby te, klasyfikowane ogólnie jako miopatie szkieletowe i dystrofie mięśniowe na podstawie cech klinicznych i histopatologicznych, są związane z osłabieniem mięśni, niepełnosprawnością przez całe życie i wczesną śmiertelnością^10,11 . Danio pręgowany okazał się znakomitym systemem do modelowania i badania chorób mięśni szkieletowych^{u ludzi 8,12,13} . Został on wykorzystany do walidacji nowych mutacji genów⁸, zdefiniowania nowych aspektów patofizjologii choroby^14,15 oraz identyfikacji nowych podejść terapeutycznych^15,16 . Moc danio pręgowanego w badaniu chorób mięśni u ludzi wiąże się z dużą liczbą potomstwa, szybkim rozwojem struktury i funkcji mięśni, jasnością optyczną zarodka danio pręgowanego oraz łatwością manipulacji genetycznej i farmakologicznej rozwijającego się danio pręgowanego¹⁷.

My i inni^12,18,19 opracowaliśmy ostatnio prostą technikę szybkiej i efektywnej izolacji włókien mięśniowych od rozwijającego się danio pręgowanego. Metodologia ta umożliwiła bardziej szczegółowe badanie włókien mięśniowych niż jest to możliwe w przypadku analizy całego zarodka. Technika ta została wykorzystana do scharakteryzowania lokalizacji subkomórkowej białek²⁰, a także do identyfikacji ważnych cech histopatologicznych w ramach badań walidacyjnych w nowo opracowanych modelach choroby²¹. Co więcej, izolowane włókna mięśniowe mogą być dodatkowo wykorzystywane do obrazowania na żywo i do badań elektrofizjologicznych²², technik, które pozwalają na badanie kluczowych aspektów funkcjonowania mięśni. Szczegółowy protokół izolacji włókien mięśniowych, wraz z dwoma przykładami późniejszych eksperymentów analitycznych, jest szczegółowo opisany w pozostałych częściach tego manuskryptu.

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną (Czas: 1 godz.)

Powłoka szkiełek nakrywkowych pozwala na szybkie osadzanie się i przyleganie włókien mięśniowych. Można to wykonać podczas etapu dysocjacji izolacji włókien mięśniowych (krok 2 poniżej).

1. Wytnij i umieść Parafilm na dnie szalki Petriego o średnicy 60 mm (dowolnej marki).
2. Umieścić szkiełka nakrywkowe mikroskopu (o średnicy 12 mm) na Parafilm w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm lub umieścić je pojedynczo w pojedynczych dołkach z płytkami 24-dołkowymi.

Uwaga 1: Te małe okrągłe szkiełka nakrywkowe pomagają skoncentrować liczbę włókien mięśniowych i zmniejszyć nadmierne użycie przeciwciał.

Uwaga 2: Szkiełka nakrywkowe o innych rozmiarach będą działać; jednak objętości używanych odczynników i zarodków będą musiały być odpowiednio dostosowane.

3. Odmierzyć pipetą 50-200 μl roztworu poli-L-lizyny (0,01%) na każde szkło nakrywkowe na szalce Petriego.
4. Pozostawić szkiełka nakrywkowe na co najmniej godzinę w temperaturze 37 °C. Dłuższe inkubacje nie wpłyną negatywnie na wyniki.
5. Usunąć roztwór poli-L-lizyny ze szkła nakrywkowego i przemyć dwukrotnie co najmniej 100 μl 1x PBS.
6. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia.
7. Szkiełka nakrywkowe są teraz gotowe na włókna mięśniowe.

Uwaga 3: Aby zapewnić sterylność, powłokę można wykonać w kapturze i na autoklawowanych szkiełkach nakrywkowych.

Uwaga 4: Trzymaj 60-milimetrową szalkę Petriego z Parafilmem na dnie. Ta konfiguracja będzie używana podczas powlekania włókien mięśniowych i znakowania immunologicznego (późniejsze kroki).

Alternatywa 1: Zamiast powlekania szkiełek nakrywkowych bezpośrednio przed użyciem, można użyć powlekanego materiału na szkiełko nakrywkowe. Szalka Petriego o średnicy 60 mm zawierająca co najmniej 2 ml poli-L-lizyny może być przechowywana w temperaturze 4 °C i zawiera liczne szkiełka nakrywkowe. W przypadku tej alternatywy zacznij od kroku 1.5, aby przetworzyć szkiełka nakrywkowe na włókna mięśniowe.

Alternatywa 2: Również pokrywamy szkiełka nakrywkowe poli-L-ornityną. Jest to bardziej pracochłonne, ale jest przydatne w przypadku hodowli długoterminowej, ponieważ szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-ornityną mogą być poddawane obróbce UV. Dzięki leczeniu promieniowaniem UV i starannej sterylnej technice, żywe włókna mięśniowe można zazwyczaj utrzymać w hodowli przez 4-7 dni.

2. Dysocjacja zarodków danio pręgowanego i posiewanie włókien mięśniowych (Czas: 1 do 3 godzin)

Uwaga: standardowy protokół najlepiej stosuje się do zarodków o wartości 3 dpf (dni po zapłodnieniu).

1. Przenieś zarodki danio pręgowanego do standardowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i usuń jak najwięcej nadmiaru wody dla ryb. Zazwyczaj 10-20 zarodków w probówce, choć można użyć mniej. Użycie więcej niż 20-25 zarodków często powoduje przygotowanie nadmiernej gęstości.
   1. Usuń kosmówkę przed dysocjacją, ręcznie za pomocą kleszczy #5. Alternatywnie, chemiczne usuwanie kosmówki uzyskuje się za pomocą 10-15 minutowego zabiegu Pronase. Zazwyczaj wcześniejsze usunięcie kosmówki jest konieczne tylko wtedy, gdy wymagane jest wcześniejsze potwierdzenie zmutowanego fenotypu lub morfologii lub gdy stosuje się etapy, w których zarodki są naturalnie wykluwane z ich kosmówki.
2. Dodać 900 μl pożywki niezależnej od CO₂ do probówki zawierającej zarodki.
3. Dodać 100 μl kolagenazy typu II, końcowe stężenie 3,125 mg/ml (podstawowy roztwór kolagenazy o stężeniu 31,25 mg/ml rozcieńczony w 1x PBS), aby rozpocząć dysocjację. Kolagenaza IV może być również stosowana do dysocjacji.
4. Obracaj zarodki na wytrząsarce orbitalnej i dziel się trituracją co 30 minut w RT za pomocą Pipetmana P1000 do trituracji.

Uwaga 2: Uważnie monitoruj dysocjację zarodków; nadmierna lub niedostateczna dysocjacja (szczególnie nad) to najczęstsze przyczyny niepowodzenia protokołu. Czas trawienia będzie się różnić w zależności od intensywności rozdrobnienia, liczby zarodków w probówce i wieku zarodków. Jest też często mniejsza (w porównaniu z typami dzikimi) w przypadku zarodków z mutantów mięśni szkieletowych.

Uwaga 3: Średni czas trawienia na wiek zarodka: 1 dpf = 1 godzina, 2 dpf = 1,5 godziny, 3 dpf = 2 godziny i 4 dpf = 2-2,5 godziny.

5. Przerwij trawienie, gdy nie widać całych zarodków, ale nadal widoczne są stałe kawałki - jest to niezbędne, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu.
6. Probówki wirówkowe ze zdysocjowanymi zarodkami w ilości 0,8-2,3 x g przez 3-5 minut do osadzania komórek.
7. Usunąć supernatant z granulowanych komórek i przemyć 2x pożywką niezależną od CO₂
.
8. Dodaj świeże podłoże niezależne od CO₂ w celu ponownego zawieszenia komórek. 1 ml jest zwykle używany do przygotowania 10-20 zarodków. Objętość można skalować na podstawie liczby zarodków.
9. Za pomocą pipety P1000 przepuścić zawiesinę zarodków przez filtr 70 μm. Pomaga to usunąć niechciane zanieczyszczenia z preparatu.

Uwaga 4: Zawiesina zarodków może być przefiltrowana po raz drugi przez filtr 40 μm, aby dalej usunąć niechciane zanieczyszczenia. Po podwójnej filtracji odzysk wynosi około 800 μl z początkowej objętości 1 ml.

10. Dodać około 50-100 μl zawiesiny włókien mionowych do każdego szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-L-lizyną.

Uwaga 5: Wykonaj krok 2.9 na szalkach Petriego z Parafilmem na dnie, wcześniej przygotowanym. Parafilm zapobiega spływaniu zawiesiny włókien mięśniowych z powlekanych szkiełek nakrywkowych. Szalki Petriego należy przykryć, aby zapobiec parowaniu.

11. Pozwól włókien mięśniowych osiąść na powlekanych szkiełkach nakrywkowych przez około 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

Uwaga 6: Włókna mięśniowe zaczną się osadzać w ciągu 5-10 minut. Jednak dla dobrego przyczepienia włókien mięśniowych zaleca się co najmniej 1 godzinę (1-2 godziny). Pozostawienie włókien mięśniowych na dłuższe osiadanie nie zaszkodzi przygotowaniu. W przypadku dłuższych inkubacji (w tym przez noc) do pożywki można dodawać antybiotyki. Dzięki antybiotykom i sterylnej technice żywe kultury mogą być zwykle utrzymywane przez 1-2 dni.

12. W tym momencie można zaobserwować żywe włókna mięśniowe. Włókna mięśniowe z zarodków 2 dpf i późniejszych będą widoczne jako komórki prążkowane i wydłużone (ryc. 1). W tym momencie włókna mięśniowe są teraz gotowe do analizy na żywo lub do znakowania immunologicznego.

Uwaga 7: Mięśnie szkieletowe z zarodków 1 dpf nie pokrywają się jako wydłużone i wyraźnie prążkowane włókna. Zamiast tego widoczne są duże miokule. Ponadto, podczas fazy granulowania po dysocjacji (krok 2.6), 1 dpf miokulek musi być odwirowywana przez co najmniej 8 minut przy 5,000 x g, aby uzyskać osad. Do analizy zarodków na tym etapie zaleca się stosowanie linii transgenicznej wykazującej ekspresję EGFP specyficznie w mięśniach szkieletowych²³. Umożliwi to identyfikację komórek pochodzenia mięśniowego w porównaniu z innymi źródłami.

3. Barwienie immunologiczne fluorescencji zdysocjowanych włókien mięśniowych danio pręgowanego (czas: około 1 dzień)

3.1. Znakowanie immunologiczne

1. Usuń część podłoża z włókien mięśniowych przyklejonych do powlekanego szkiełka nakrywkowego
2. Napraw komórki za pomocą 4% paraformaldehydu lub metanolu. W przypadku PFA usuń 1/2 objętości nośnika i zastąp taką samą ilością PFA. Utrwalaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usuń całkowitą objętość, zastąp 50-100 μl PFA i utrwalaj przez dodatkowe 10 minut. Do utrwalania alkoholu można stosować lodowaty metanol lub aceton w temperaturze 4 °C odpowiednio przez 10 minut lub 5 minut.
3. Umyj włókna mięśniowe co najmniej 3-5 razy za pomocą 1x PBS lub 1x PBS plus 0,1% TWEEN. Średnia objętość prania wynosi 50-100 μl na szkiełko nakrywkowe.
4. Dodać roztwór blokujący do włókien mięśniowych (materiał roboczy) i inkubować 20-60 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór blokujący będzie się różnić w zależności od przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Dwa najczęściej stosowane w laboratorium to (1) 1x PBS, 2 mg/ml BSA, 1% surowica owcza, 0,25% Triton X-100 final i (2) 0,2% Triton X-100, 2 mg/ml (0,2% BSA) i 5% surowica owcza/kozia.
5. Usunąć roztwór blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym lub PBS. Inkubować włókna mięśniowe przez noc w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że folia lub owiń saran szalkę Petriego zawierającą szkiełka nakrywkowe obciążone miofibrą pokryte przeciwciałem. Można dodać małe kawałki zwilżonego ręcznika papierowego, aby stworzyć nawilżoną komorę.
6. Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe z szkiełek nakrywkowych i przemyć szkiełka nakrywkowe 3-5 razy przez 5 minut PBS lub roztworem blokującym.
7. Dodać przeciwciało drugorzędowe o odpowiednim stężeniu rozcieńczone w 1x PBS lub roztworze blokującym przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
8. Usuń przeciwciało wtórne i przemyj włókna mięśniowe 3-5x w PBS przez 5 minut każde w RT.

3.2. Montaż szkiełek nakrywkowych

9. Nałóż 1-2 krople odczynnika zapobiegającego blaknięciu na szkiełko mikroskopowe.
10. Ostrożnie podnieś powlekane i immunologiczne szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy i umieść (włóknami mięśniowymi w dół) szkiełko nakrywkowe na odczynniku zapobiegającym blaknięciu na szkiełku mikroskopowym.

Uwaga 1: Uwaga na orientację powlekanego szkiełka nakrywkowego jest kluczowa.

11. Połóż 1-2 chusteczki Kimwipes na twardej, twardej powierzchni. Szybko odwróć szkiełko podstawowe z powlekanymi szkiełkami nakrywkowymi spoczywającymi na odczynniku zapobiegającym blaknięciu i umieść je (szkiełko nakrywkowe w dół) na chusteczkach Kimwipes.
12. Lekko dociśnij rogi szkiełka mikroskopowego, aby usunąć nadmiar płynu zapobiegającego blaknięciu i utworzyć szczelne uszczelnienie między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym
13. Pozostaw płyn zapobiegający blaknięciu do wyschnięcia przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie włókna mięśniowe są gotowe do obrazowania (rysunki 2A i B) lub przechowywania w temperaturze 4 °C.

4. Obrazowanie wapnia na żywych komórkach za pomocą GCaMP3

Eksperymenty z żywymi komórkami mogą być przeprowadzane na włóknach mięśniowych przed fiksacją (po kroku 2.10). Poniższy protokół opisuje obrazowanie na żywo we włóknach mięśniowych wykazujących ekspresję GCaMP3²⁴, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia, wyrażanego przez specyficzny dla mięśni szkieletowych promotor α-aktyny danio pręgowanego (pSKM)²³. Alternatywnie, technikę tę można łatwo dostosować do stosowania barwników wskaźnikowych wapnia, takich jak Fura-2.

1. Wstrzyknąć zarodkom pSKM: konstrukt GCaMP3 w stadium 1-2 komórek
2. Przy 3 dpf zebrać larwy i przygotować włókna mięśniowe zgodnie z opisem w sekcjach 1 i 2. Pozwól włókien mięśniowych przylegać przez co najmniej 1 godzinę. Do tej techniki wymagane jest przygotowanie szkiełek nakrywkowych w naczyniach 24-dołkowych.
3. Ostrożnie usuń nadmiar pożywki i dodaj 300 μl świeżych niezależnych pożywek CO₂ w temperaturze pokojowej.
4. Obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem. Włókna mięśniowe GCaMP3 dodatnie powinny być widoczne pod wpływem zielonej fluorescencji.
5. W razie potrzeby skonfiguruj kamerę do nagrywania.
6. Przygotować 30 mM roztwór kofeiny w pożywce niezależnej od CO_{2 .} Aby pobudzić komórki, delikatnie odpipetuj 300 μl roztworu kofeiny do powiększonej studzienki. W ciągu 5-10 sekund włókna mięśniowe GCaMP dodatnie powinny reagować na kofeinę szybkim wzrostem fluorescencji (ryc. 3). Włókna mięśniowe mogą również się kurczyć. Warto zauważyć, że kofeina indukuje uwalnianie wapnia z zapasów retikulum sarkoplazmatycznego²⁵. Inne środki, takie jak KCl²⁶ i ryanodine⁴, mogą być stosowane do badania indukowalnego uwalniania wapnia.

Fluorescencyjne znakowanie immunologiczne włókien mięśniowych (Rysunek 2)

Obrazy pokazujące oczekiwany wzór znakowania fluorescencyjnego z włókien mięśniowych wybarwionych immunologicznie po udanej izolacji i posianiu. Włókna mięśniowe zostały oznaczone przeciwciałami przeciwko receptorowi anty-ryanodine (1:100) (Figura 2A) lub anty-α-aktininie (1:100) (Figura 2B) i ujawniają barwienie immunologiczne odpowiednio triady i pasma Z. Zastosowano przeciwciała drugorzędowe Alexa Fluor 555 (1:500). Obrazy wykonane za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Indukowane uwalnianie wapnia z włókna mięśniowego (Rysunek 3)

Seria paneli pokazująca reprezentatywne uwalnianie wapnia z izolowanego włókna mięśniowego potraktowanego kofeiną. Krótko mówiąc, zarodki danio pręgowanego wstrzyknięto w jednym stadium komórkowym za pomocą konstruktu pSKM: GCaMP3. Po 3 dpf zarodki zostały rozdzielone i posiane zgodnie z opisem w protokole. Do analizy wybrano włókna mięśniowe wykazujące ekspresję GCaMP3, na co wskazuje obecność zielonej fluorescencji na linii podstawowej. Używając mikropipety do podawania leku, wybrane włókno kąpano w 30 mM roztworze kofeiny w celu wywołania uwalniania wapnia. Nagrywanie wideo rozpoczęto przed zastosowaniem kofeiny i kontynuowano aż do osiągnięcia szczytowej fluorescencji. Rysunek ten pokazuje normalne uwalnianie wapnia indukowane kofeiną, a technika ta może być wykorzystana do zbadania aparatu sprzęgającego wzbudzenie-skurcz za pomocą obrazowania na żywo.

Rysunek 1. Schematyczne oś czasu dysocjacji zarodka. Kolejne panele (od góry do dołu) ilustrują poszczególne kroki, czas i sprzęt wymagany do dysocjacji zarodka. A) Selekcja zarodków do dysocjacji. Podziałka 500 μm. B) Obraz układu dysocjacji. Zarodki znajdują się w pożywce i kolagenazie podczas rotacji, aż do wystarczającej dysocjacji (krok 2 protokołu). C) Obraz obu technik powlekania włókien mięśniowych; okrągłe szkiełka nakrywkowe lub płytki 24-dołkowe (odpowiednio kroki 1 i 4 protokołu). D) Obraz w jasnym polu żywych zdysocjowanych włókien miologicznych danio pręgowanego pokrytych na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną. Strzałki oznaczają wydłużone włókna mięśniowe z 48 hpf danio pręgowanego. Podziałka 30 μm.

Rysunek 2. Znakowanie immunologiczne pojedynczych włókien mięśniowych wyizolowanych z 48 zarodków zebry zebry hpf. A) Włókno mięśniowe znakowane receptorem anty-ryanodine (RyR1), odsłaniające prążkowany wzór wzdłuż włókna zgodny z lokalizacją w aparacie sprzęgającym triada / EC. B) Włókno mięśniowe znakowane anty-α-aktyniną, wizualizujące prążki (czerwone) wzdłuż włókna mięśniowego lokalizujące się do sarkomeru i podkreślające pasma Z. Na obu zdjęciach jądra są oznaczone DAPI, widziane jako niebieskie owale. Wstawki pokazują obrazy włókna mięśniowego w większym powiększeniu na dużym obrazie. A) i B) pasek skali 30 μm.

Rysunek 3. Reprezentatywna indukowana reakcja na uwalnianie wapnia z pojedynczego izolowanego włókna mięśniowego danio pręgowanego. Wszystkie panele pokazują pseudokolorowe miofiber danio pręgowanego wyrażające GCaMP3. Przebieg czasowy wskazuje na wzrost fluorescencji GCaMP3 (kolor czerwony) w odpowiedzi na zastosowanie 30 mM kofeiny. Zapis rozpoczął się przed zastosowaniem kofeiny (0 ms) i trwał do maksymalnej odpowiedzi fluorescencyjnej (992 ms). Podziałka 30 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.