Robot, który zaprojektujemy w tym artykule, reaguje na białko P, udostępniając ładunek C, który wiąże się z receptorami na powierzchni wybranej komórki docelowej. Robot jest pokazany na rysunku 1. C może być lekiem blokującym receptory; czynnik wzrostu itp., a sposób chemicznego powiązania go z oligonukleotydem DNA musi być dostępny, który nie niszczy jego funkcji. Robot ma dwa stany. Gdy robot jest nieaktywny, bramki DNA na dwóch zewnętrznych "wargach" są hybrydyzowane, dzięki czemu robot pozostaje zamknięty, tak aby każdy załadowany w niego ładunek był bezpiecznie sekwestrowany. W obecności białka P bramki otwierają się za pomocą jednego z kilku mechanizmów (omówionych poniżej), umożliwiając robotowi otwarcie i odsłonięcie ładunku. Projektując konstrukcję, należy wziąć pod uwagę, że robot musi być na tyle elastyczny, aby zamykać się w stanie zamkniętym i skakać do stanu otwartego, gdy bramki mu na to pozwalają. Modelowanie zachowania struktury DNA integrującej komponenty termodynamiczne i mechaniczne jest trudne, a rzeczywisty obiekt może wymagać pewnych iteracyjnych ulepszeń. Niemniej jednak tutaj skupiamy się na procesie projektowym za pomocą ogólnego modelu roboczego, na którym można budować.
Uwaga:
Dla bardziej wszechstronnego zrozumienia procesu projektowania i składania origami DNA, gorąco polecamy przeczytanie oryginalnego artykułu caDNAno autorstwa Douglasa i współpracowników19, który wyjaśnia abstrakcyjną reprezentację DNA w interfejsie projektowania i jak odnosi się ona do rzeczywistej struktury molekularnej kształtu DNA 3D. Do tego artykułu dołączone są dwa filmy instruktażowe opisujące w bardzo przejrzysty sposób reprezentację i interfejs caDNAno. Dodatkowo zalecamy zapoznanie się z nowszym artykułem Dietza i współpracowników opisującym wiele ważnych aspektów i szczegółowych protokołów procesu składania, w tym narzędzia do analizy Cando21.
1. Pobierz i zainstaluj caDNAno 2.0 i Autodesk Maya 2012
Uwaga: Oprogramowanie Autodesk jest bezpłatne dla studentów i nauczycieli akademickich. Poniższe instrukcje obejmują konfigurację konta akademickiego w usłudze Autodesk.
- Utwórz konto akademickie pod adresem http://students.autodesk.com/. Po otrzymaniu wiadomości e-mail z konfiguracją konta kliknij link aktywacyjny i wypełnij swoje preferencje zgodnie z potrzebami.
- Pobierz bezpłatną wersję programu Maya 2012 z Centrum pobierania.
- Zainstaluj program Maya 2012 na swoim komputerze.
- Uruchom program Maya raz przed zainstalowaniem caDNAno 2.0.
- Pobierz i zainstaluj najnowszą wersję caDNAno 2.0 ze strony http://cadnano.org/.
- Uruchom program Maya 2012. W prawym górnym rogu graficznego interfejsu użytkownika powinna pojawić się ikona caDNAno. Kliknij ikonę, aby przejść do caDNAno.
2. Nakreśl pożądany kształt oraz ścieżkę pasma rusztowania
- Interfejs projektowy caDNAno w programie Maya składa się z 3 paneli (rysunek 2):
- Panel górny: widok kratownicy, w którym kształt jest początkowo obrysowany. Ten panel umożliwia wykonywanie operacji na poziomie podwójnej helisy i zapewnia widok przekroju kształtu.
- Dolny panel: panel edycyjny, umożliwiający pojedyncze akcje na poziomie podstawowym.
- Prawy panel: wygenerowany przez program Maya model 3D kształtu w czasie rzeczywistym
- Kliknij ikonę "Plaster miodu". Powiększanie i pomniejszanie siatki w górnym panelu można wykonać, przewijając myszą odpowiednio w górę i w dół.
caDNAno umożliwia dwie możliwe siatki projektowe, plaster miodu i kwadrat; W tym artykule użyjemy układu o strukturze plastra miodu, chociaż krata kwadratowa może być również ogólnie używana22.
- Zacznij od narysowania sekcji o żądanym kształcie na lewym panelu.
Każdy okrąg reprezentuje podwójną helisę DNA. Aby wybrać helisy, które budują kształt, po prostu kliknij lewym przyciskiem myszy na ich środek (Rysunek 3). Kontynuuj helisę po helisie, aż cały kształt zostanie obrysowany. Alternatywnie kształt można narysować, naciskając lewy przycisk myszy i ciągłąc kontur kształtu. Każdą czynność można cofnąć, klikając menu Edycja i "Cofnij" lub za pomocą skrótu klawiaturowego CTRL+Z (PC) lub CMD+Z (Mac).
W tym momencie wybrane helisy przybiorą kolor żółty. W tym samym czasie dolny panel wyświetli widok z boku kształtu, składającego się z tych helis. Numeracja helis w dolnym panelu jest spójna z numeracją w górnym.
- Obserwuj dolny panel. Każda helisa jest reprezentowana przez dwa rzędy kwadratów: rzędy to dwa pasma podwójnej helisy, przy czym każdy kwadrat reprezentuje podstawę (Rysunek 4).
Pomarańczowy pionowy pasek określa, gdzie wykonywane są czynności edycyjne wzdłuż helisy. Pozycja bazowa wzdłuż siatki jest wyświetlana jako liczba nad pomarańczowym paskiem. Domyślna długość struktury helisy to 42 podstawy. Długość można zwiększyć, klikając jedną z ikon szarych strzałek w prawym górnym rogu panelu edycji i wybierając długość przedłużenia (w wielokrotnościach 21, co odpowiada dwóm pełnym zwojom helisy DNA, w których jeden obrót obejmuje 10,5 zasad) (Rysunek 4). Siatka będzie rozciągać się w kierunku wybranej strzałki.
- Aby narysować rzeczywistą ścieżkę pasma rusztowania w całym kształcie, naciśnij przycisk myszy, zacznij od pierwszej helisy i przejdź w sposób ciągły przez wszystkie helisy w tej samej kolejności, w jakiej zostały początkowo wybrane w sekcji 2.3. Należy pamiętać, że:
- Wybrane tym razem helisy zmienią kolor na pomarańczowy.
- W dolnym panelu fragmenty pasma rusztowania zostaną automatycznie narysowane na wybranych helisach.
- Prawy panel pokaże model 3D budowanego kształtu w czasie rzeczywistym. Pod koniec tego procesu w dolnym panelu zostanie automatycznie narysowany szkic ścieżki pasma rusztowania (Rysunek 5).
- Narysuj prostokąt wokół wszystkich skrajnych lewych krawędzi ścieżki szkieletu. Zwróć uwagę, że tak wybrane krawędzie będą wyświetlane na czerwono (Rysunek 6).
- Wydłuż ścieżkę szkieletu, przeciągając wybrane krawędzie jako grupę na lewą stronę siatki. Powtarzaj ten proces dla prawych krawędzi, aż ścieżka zostanie prawidłowo przedłużona. Należy zauważyć, że przedłużenie rusztowania powoduje również przedłużenie kształtu 3D w prawym panelu (Rysunek 7).
- Zlokalizuj części ścieżki szkieletu, które są odizolowane od reszty, i połącz je. Na przykład w naszym kształcie helisy 0-9 tworzą izolowaną część. Helix 9 musi być podłączony do Helix 12 (należy pamiętać, że helisy 9 i 10 nie sąsiadują ze sobą w kształcie [górny panel], więc nie można ich połączyć).
- Powiększ pasma, które mają zostać połączone, i za pomocą narzędzia "Wybierz" kliknij dowolny punkt na jednym z pasm. Po kliknięciu dowolnego punktu wzdłuż niebieskiego fragmentu rusztowania, między helisami pojawiają się ikony "mostu", oznaczające miejsca, w których dozwolone są skrzyżowania. W tych pozycjach zasady w sąsiednich helisach są zwrócone do siebie bezpośrednio, umożliwiając pasmom przechodzenie od helisy do helisy bez deformacji lub skręcania DNA. Liczba pojawiająca się obok ikony każdego mostka wskazuje numer helisy, do której zostanie przecięty (Rysunek 8).
- Aby utworzyć skrzyżowania, kliknij lewym przyciskiem myszy wybraną ikonę mostu. Zostanie wygenerowane skrzyżowanie rusztowania, co oznacza, że rusztowanie przecina się w tym punkcie od helisy do helisy (rysunek 9). Powtarzaj ten proces, aż rusztowanie przejdzie przez wszystkie helisy i utworzy zamkniętą pętlę, która obejmuje cały kształt, nie pozostawiając żadnych obszarów odizolowanych od reszty kształtu.
Zauważ, że chociaż krzyżówki wydają się rozciągać na pewien dystans w oprogramowaniu, w rzeczywistości nie zawierają żadnej zasady DNA. Fizycznie "most" krzyżujący się zawiera tylko jedną jednostkę fosforanową szkieletu DNA, która łączy ze sobą dwie zasady z sąsiednich helis.
- Zanim przejdziesz do następnego kroku, upewnij się, że całe rusztowanie jest ciągłe i żadna jego część nie jest odizolowana od pozostałych.
3. Zdefiniuj osie mechanizmu otwierania
Opisywany robot otwiera się w odpowiedzi na zdefiniowany sygnał biologiczny, aby odsłonić swój ładunek. Otwieranie odbywa się w sposób przypominający muszlę, z dwiema połówkami (helisy 0-29 tworzą jedną połowę, helisy 30-61 tworzą drugą połowę) obracającymi się wokół dwóch osi. Osie są utworzone przez skrzyżowania między helisami 29-30 i 61-0, które są jedynymi skrzyżowaniami między tymi połówkami i są umieszczone tylko w lewej krawędzi siatki lub blisko niej. Prawa krawędź będzie zawierać pasma bramki (omówione poniżej).
- Usuń istniejące skrzyżowanie między helisami 29-30. Aby usunąć skrzyżowanie, kliknij punkt "kolana" w dowolnym pasmie. Pozostawia to nacięcie w obu pasmach w miejscu, w którym kiedyś znajdowała się zwrotnica. Aby zszyć nacięcia, naciśnij SHIFT i kliknij każdy z nich.
- Utwórz nową zwrotnicę między helisami 29-30 jak najbliżej lewej krawędzi siatki (Rysunek 10).
- Utwórz nowe skrzyżowanie między helisami 61 i 0 jak najbliżej lewej krawędzi siatki.
4. Zdefiniuj miejsca załączników ładunku
Po zakończeniu kreślenia ścieżki pasma rusztowania, musimy zdefiniować miejsca dołączania (ładowania) ładunku. Miejsca załadunku są w rzeczywistości pasmami zszywek, które wystają ze swoich helis jako jednosplotowe "gałęzie". Dlatego ważne jest, aby bardzo precyzyjnie określić, gdzie wzdłuż spirali występuje to rozgałęzienie, aby upewnić się, że rozciąga się ono w pożądanym kierunku. Jeśli dowolnie zdefiniujemy rozszerzenia zszywek, miejsca ładowania mogą znajdować się po zewnętrznej stronie robota, a nie po stronie wewnętrznej.
Aby upewnić się, że zszywka rozciąga się tylko w określonym kierunku, kreślimy dodatkową spiralę, która służy jako prowadnice do kierunkowego rozgałęziania zszywki od głównego korpusu. Po wysunięciu żądanej zszywki w miejscu załadunku, spirala prowadząca jest usuwana.
- Zdefiniujmy 4 miejsca załadunku skierowane w stronę wewnętrznej strony robota. Miejsca załadunku będą rozgałęziać się od helis 3, 27, 34 i 58. Dla każdego miejsca w górnym panelu kliknij helisę bezpośrednio przylegającą do tych helis, która jest skierowana w stronę wewnętrzną (Rysunek 11). Spowoduje to dodanie helis do siatki w dolnym panelu. Nie klikaj jeszcze tych helis po raz drugi.
5. Dodawanie i edycja zszywek
- Kliknij "Automatyczne zszywanie". Oprogramowanie automatycznie doda sekwencje zszywek w różnych kolorach (Rysunek 12). Zwróć uwagę, że zszywki zostały dodane do kształtu 3D w prawym panelu. Kolory zszywek są spójne dla dolnego i prawego panelu. Ponadto w lewym dolnym rogu interfejsu znajduje się wskaźnik, który wskazuje zszywkę.
Uwaga: zszywki nie mogą być ani za długie, ani za krótkie, ani okrągłe. Większość wygenerowanych tutaj zszywek nie spełnia tych kryteriów i musi być edytowana. Pierwszym krokiem w ich edycji jest automatycznie (patrz następny krok).
- Kliknij "Automatyczne łamanie". Otworzy się okno dialogowe (Rysunek 13) z prośbą o podanie parametrów zdefiniowanych przez użytkownika dla tej akcji:
- Długość docelowa (bp): przewidywana długość zszywki, jeśli to możliwe
- Minimalna długość (bp): minimalna dozwolona długość zszywki
- Maksymalna długość (bp): maksymalna dozwolona długość zszywki
- Min. odległość do xover (bp): minimalna liczba par zasad, które zszywka może przejść między swoją krawędzią a skrzyżowaniem lub między dwoma skrzyżowaniami.
Użyj parametrów domyślnych, kliknij przycisk OK. Oprogramowanie złamie zszywki zgodnie z tymi parametrami najlepiej jak potrafi (Rysunek 14).
- Usuń wszystkie skrzyżowania zszywek między helisami 29-30 i 61-0, aby umożliwić rozdzielenie tych helis i umożliwienie robotowi otwarcia. Wymazywanie krzyżujących się zszywek będzie wymagało ręcznej edycji w celu poprawienia zszywek, które w wyniku tej czynności stają się zbyt krótkie lub nieracjonalne. Aby zrobić to poprawnie, postępuj zgodnie z instrukcjami w poniższych sekcjach.
Upewnij się, że skrzyżowania rusztowań utworzone w sekcjach 3.2 i 3.3 pozostały nienaruszone.
- Rozważmy na przykład pierwsze skrzyżowanie zszywek (cyjan i) od lewej między helisami 29 i 30 (rysunek 15). Wymaż oba mostki tego skrzyżowania, klikając każdy punkt kolanowy lub mostek tak, aby wyglądał na czerwony, a następnie naciskając DELETE (Rysunek 16).
- Zszyj dwie zszywki na spirali 29, naciskając SHIFT i klikając nacięcie między nimi. Podobnie zszyj trzy zszywki na nitce 30 z jedną zszywką (Rysunek 17). Zszywki można ręcznie wydłużać lub skracać, klikając krawędź i przeciągając ją zgodnie z potrzebami. Uważaj, aby nie zaokrąglić żadnej zszywki. Rysunek 18 przedstawia przerwę między helisami 29-30 po pełnej edycji zwrotnic zszywek. Powtórz ten proces dla helis 0 i 61 i ręcznie edytuj wszystkie zszywki w każdej helisie.
- Zlokalizuj zszywki, które są narysowane grubą linią, co oznacza, że wymagają dalszej edycji. Zbadaj każdy z nich i popraw go w razie potrzeby. Na przykład zszywki, które są zbyt krótkie, można wymazać (Rysunek 19) lub przedłużyć, jeśli to możliwe.
6. Utwórz miejsca ładowania i bramy
- Drugi raz kliknij helisy miejsca wczytywania w górnym panelu, a następnie wydłuż powstałe fragmenty pasma rusztowania w dolnym panelu, klikając krawędź i przeciągając ją zgodnie z potrzebami (Rysunek 20).
- Ręcznie dodaj zszywki do tych fragmentów rusztowania, umieszczając pomarańczowy pionowy pasek w żądanej pozycji wzdłuż rusztowania, przechodząc przez helisy prowadzące na lewym panelu, przytrzymując SHIFT i klikając. Spowoduje to dodanie prekursora zszywek na każdej helisie (Rysunek 21).
- Rozszerz również prekursory zszywek na pełną długość, klikając i przeciągając.
- Znajdź czerwone ikony mostka, oznaczające dozwolone pozycje skrzyżowania między pasmem prowadzącym (na przykład spirala 62) a obudową (na przykład spirala 3).
- Wybierz najdogodniejszą lokalizację, w której chcesz wprowadzić skrzyżowanie, a następnie kliknij ikonę mostu (Rysunek 22). Dogodna lokalizacja wymaga minimalnej edycji istniejących zszywek w obudowie.
- W spirali prowadzącej (spirala 62) usuń część zszywki, która nie jest częścią miejsca załadunku, i skróć część uczestniczącą do żądanej długości. Pożądana długość powinna zapewniać zarówno specyfikę załadunku różnych rodzajów ładunków, jak i siłę wiązania. Zazwyczaj 18-merowy ogon powinien wystarczyć. Upewnij się, że zszywka pozostaje narysowana cienką linią, w przeciwnym razie edytuj ją, aż będzie.
- W razie potrzeby zmodyfikuj zmienione zszywki.
- Wymaż prowadnicę (spirala 62), pozostawiając tylko przedłużenie zszywki.
- Powtórz kroki 6.4-6.8 dla wszystkich miejsc ładowania (Rysunek 23).
7. Projektowanie pasm bram
Pasma bramy są jedynymi pasmami, z wyjątkiem osi, łączącymi helisy 29-30 i 61-0. W przeciwieństwie do osi, pasma bramki nie są skrzyżowaniami. Zamiast tego hybrydyzują, tworząc dwuniciowy segment, który służy jako czujnik dla wybranego biologicznego wkładu. Po przemieszczeniu dupleksów bramki cały robot może entropicznie obracać się wokół osi i otwierać.
- Zlokalizuj odpowiednie pozycje dla pasm bramy. Będą to zszywki na helisach 29, 30, 61 i 0.
- Na przykład sprawdź region bramy 29-30. Po prawej stronie siatki znajdują się wygodne pasma zszywek flankujące helisy 29 i 30, które mogą być używane jako pasma bramek. Zwróć uwagę, że są one zwrócone w przeciwnych kierunkach.
- Kliknij krawędź jednej z potencjalnych pasm bramki, aby wysunąć ją poza kształt. Jeśli krawędź leży nad skrzyżowaniem rusztowania, jego wybór można uprościć, upewniając się, że można wybrać tylko "Stap" (les), klikając "Rusztowanie" (składanie) na pasku narzędzi "Do wyboru" w prawym górnym rogu interfejsu.
- Rozciągnij obie zszywki, aby utworzyć pasma bramki. Edytuj zszywki, jeśli wymaga tego to rozszerzenie (Rysunek 24). Powtórz to dla pasm bramek helis 0 i 61.
Należy zauważyć, że na razie rzeczywista długość nie ma znaczenia, ponieważ DNA czujnika (np. aptamer) zastąpi sekwencje nici bramki na etapie zakończenia sekwencji.
8. Wybierz sekwencję rusztowania
- Kliknij narzędzie "Seq". Umieść kursor w dowolnym miejscu na linii rusztowania i kliknij. Otworzy się okno dialogowe z prośbą o wybranie źródła DNA rusztowania (Rysunek 25).
- Wybór źródła DNA w dużej mierze zależy od wielkości robota. Na przykład M13mp18 ssDNA (p7249) i jego rozszerzone pochodne (p7308 itp.), które generalnie były wybierane dla dużych kształtów origami DNA, pasują, gdy nić rusztowania ma długość ~ 7 kb. Jeśli rusztowanie o zaprojektowanym kształcie jest znacznie krótsze niż wybrane źródło, nadmiar nici rusztowania, który nie jest hybrydyzowany z żadną zszywką, utworzy pętlę ssDNA wystającą ze złożonego kształtu. Podczas gdy zwykle nie stanowi to większego problemu w przypadku stosunkowo krótkich pętli, długie pętle o długości wielu kb mogą drastycznie zakłócać składanie i działanie robota. Dlatego ważne jest, aby dopasować wybrane źródło do długości rusztowania kształtowego.
Na przykład, jeśli pasmo rusztowania potrzebne do złożenia małego kształtu ma długość ~1 600 podstaw, co jest znacznie krótsze niż wstępnie ustawione źródła w oknie dialogowym, niestandardowa sekwencja może być użyta jako rusztowanie. Można wziąć pod uwagę kilka źródeł. Na przykład M13mp18 może być trawiony przez specyficzny enzym restrykcyjny, który wytwarza fragment o pożądanej długości. Zaprojektowanie takiego źródła można wykonać w NebCutter (http://tools.neb.com/NEBcutter2/) poprzez wklejenie sekwencji M13mp18 (http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/dna_sequences_maps.asp?#.UAygyzFWomR) w oknie wprowadzania NebCutter i mapowanie miejsc ograniczeń. Inną opcją jest użycie wstępnie strawionego ssDNA, takiego jak viX174 virion ssDNA HaeIII digest, dostępny w New England Biolabs.
- W oknie dialogowym kliknij "M13mp18". Zwróć uwagę, że wybrana sekwencja DNA została dodana do rusztowania i pasm zszywek w dolnym panelu.
9. Eksportuj sekwencję zszywania jako arkusz kalkulacyjny
- Kliknij "Eksportuj" na górnym pasku narzędzi i wybierz docelową nazwę pliku dla listy zszywek. Kliknij "Zapisz".
- Znajdź plik .csv docelowego i otwórz go.
- Arkusz kalkulacyjny pokazuje listę zszywek, którą można wysłać w niezmienionej postaci do firmy zajmującej się syntezą DNA. W pierwszych dwóch kolumnach wyświetlane są współrzędne początkowe i końcowe, przy czym liczba poza nawiasami oznacza numer helisy, a liczba w nawiasach oznacza pozycję bazową.
10. Przypisywanie sekwencji bram i ładowania
- Na liście zszywek zauważysz, że niektóre sekwencje zaczynają się lub kończą ciągiem znaków zapytania "?????". Te znaki zapytania oznaczają, że ponieważ żadna nić rusztowania nie hybrydyzuje z tymi specyficznymi regionami zszywek, nie można im przypisać sekwencji komplementarnych. Są to w rzeczywistości przedłużenia, które zaprojektowaliśmy dla pasm bram i miejsc załadunku, dlatego należy je teraz przypisać ręcznie.
- brama:
- Bramki określają charakter biologicznego bodźca, po którym robot przełączy się ze stanu nieaktywnego na aktywny i wystawi swój ładunek. Każda pojedyncza bramka dsDNA może kodować odpowiedź na jeden sygnał biologiczny (lub więcej), dzięki czemu można zdefiniować profil danych wejściowych wymaganych do aktywacji robota.
Załóżmy na tym przykładzie, że sygnał biologiczny wyzwalający aktywację robota jest enzymem restrykcyjnym, który może wskazywać na obecność bakterii zakaźnych.
- Po pierwsze, weź pod uwagę, że nici ssDNA bramki nie hybrydyzują natychmiast po rozgałęzieniu się z ich helis. Zaprojektowanie bramy w inny sposób może utrudnić hybrydyzację podczas składania. Dlatego każda gałąź powinna zaczynać się od ciągu dystansowego. Zazwyczaj używamy poly-T jako ciągów dystansowych, ponieważ ta sekwencja zapewnia elastyczność.
- Zakładamy również, że długość obszaru hybrydyzacji bramki wynosi 20 zasad, zawierających w środku docelowe miejsce restrykcyjne.
- W związku z tym brama może wyglądać tak:
[Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3'
[Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5'
Cyfra "....." oznacza region zszywki, który hybrydyzuje z pasmem rusztowania, dlatego ma już sekwencję i nie należy jej zmieniać.
Losowy dupleks "GTGAGTT" i jego uzupełnienie zapewniają, że miejsce restrykcji nie jest częściowo otwarte i zapewnia dodatkowe zasady, aby zapewnić skuteczne trawienie przez enzym.
Znak "x" oznacza miejsce ograniczenia.
Losowy dupleks "GCTAGAG" i jego uzupełnienie zapewniają dodatkowe podstawy dla enzymu do wydajnej pracy, ale także upewniają się, że pasmo bramki jest wystarczająco długie, aby zapewnić dobre zamknięcie robota.
Przed wybraniem miejsca ograniczenia jako celu należy upewnić się, że cała konstrukcja robota, miejsca załadunku i inna część samej bramy nie są trawione przez wybrany enzym. W tym badaniu lista NEBCutter 0-cutter (enzymy, które nie przecinają całej sekwencji) wyróżniła EagI, wyizolowany z aglomeransów Enterobacter Pantoea, jako potencjalny enzym, który może wskazywać na obecność zakaźnej enterobakterii.
- Brama wygląda teraz tak (żółty oznacza miejsce ograniczenia EagI):
[Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3'
[Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5'
Należy pamiętać, że ta konstrukcja zakłada, że po roztrawieniu sekwencja "GTGAGTTCGG" (Tm = 32 °C) nie jest wystarczająco długa ani stabilna termodynamicznie, aby utrzymać robota w pozycji zamkniętej. To założenie najprawdopodobniej będzie musiało zostać zweryfikowane eksperymentalnie.
- Druga bramka może być taka sama, w takim przypadku robot reagowałby tylko na jeden enzym lub może być zaprojektowany z innym miejscem, co zwiększa specyfikę robota. Do tego samego pasma można dodać więcej miejsc ograniczeń, zwiększając złożoność i specyfikę robota.
- Miejsca załadunku:
- Miejsce załadunku może być sekwencją uniwersalną. Alternatywnie, miejsca załadunku mogą być oparte na unikalnych sekwencjach, co zmniejszy modułowość, ale poprawi kontrolę nad orientacją i proporcjami ładunku (dla różnych rodzajów ładunków).
- Wreszcie, oligonukleotydy w miejscu ładowania powinny zawierać chemiczną grupę funkcyjną umożliwiającą im koniugację z dowolnym ładunkiem: białkiem, nanocząstką itp. Upewnij się, że grupa chemiczna jest zamontowana na właściwym końcu (5' lub 3'), zgodnie z kierunkiem zszywki.
11. Symuluj wyniki w CANDO
- Po zapisaniu zadania jako pliku .json można je przesłać do CANDO w celu analizy. CANDO to oparta na elementach skończonych symulacja struktury DNA, która może oszacować jej sztywność i stabilność w roztworze21.
- Przejdź do http://cando-dna-origami.org/
- Kliknij "Prześlij plik caDNAno do analizy" i wypełnij wszystkie niezbędne informacje.
- Analiza w CANDO trwa zazwyczaj do 15-20 min. Na końcu zostanie wysłana wiadomość e-mail z informacją, że analiza została zakończona, wraz z łączem umożliwiającym pobranie wyników symulacji (Rysunek 26).
12. Zamów DNA i złóż robota
Gdy proces projektowania zostanie zakończony, a analiza CANDO wykaże zadowalające przewidywania produktu, można zamówić listę nici zszywek wygenerowaną w sekcjach 9-10. Zazwyczaj pasma zszywkowe nie wymagają szczególnego oczyszczania; zaleca się jednak, aby pasma specjalnego przeznaczenia, takie jak bramy lub miejsca załadunku, były oczyszczane za pomocą HPLC.
Następujące kroki po kolejności DNA, a mianowicie składanie, oczyszczanie i ocena produktu, w tym wizualizacja złożonej struktury za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) lub transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) wykraczają poza zakres tego artykułu i można je znaleźć w poprzednich raportach17,18,20,21 . Jako przykład przedstawiono obraz TEM zaprojektowanego tutaj robota (Rysunek 27). Przygotowanie i barwienie próbki przeprowadzono dokładnie tak, jak opisano w innym miejscu21.