Opracowaliśmy prostą, niezawodną i stosunkowo tanią metodę intubacji dotchawiczej u myszy za pomocą bezpośredniej laryngoskopii przy użyciu otoskopu z wziernikiem 2,0 mm. Technika ta jest atraumatyczna i może być stosowana do powtarzania pomiarów w przewlekłych eksperymentach. Uważamy, że jest lepsza od tracheostomii lub wcześniej opisanych technik niechirurgicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Intubacja dotchawicza u myszy za pomocą laryngoskopii bezpośredniej przy użyciu otoskopu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Myszy, zarówno dzikie, jak i transgeniczne, są obecnie głównym modelem ssaków w badaniach biomedycznych. Intubacja i wentylacja mechaniczna są niezbędne w przypadku eksperymentów na całych zwierzętach, które wymagają operacji w głębokim znieczuleniu lub pomiarów czynności płuc. Tracheostomia była standardem intubacji dróg oddechowych u tych myszy, aby umożliwić wentylację mechaniczną. Zgłaszano przypadki intubacji ustno-tchawiczej, ale nie były one z powodzeniem stosowane w wielu badaniach ze względu na znaczne trudności techniczne lub konieczność stosowania wysoce specjalistycznego i drogiego sprzętu. W tym artykule przedstawiono technikę laryngoskopii bezpośredniej z użyciem otoskopu wyposażonego we wziernik 2,0 mm i przy użyciu cewnika dożylnego 20 G jako rurki dotchawiczej. Wykorzystaliśmy tę technikę szeroko i niezawodnie do intubacji i przeprowadzenia dokładnej oceny czynności płuc u myszy. Ta technika okazała się bezpieczna, a w doświadczonych rękach zasadniczo nie tracono zwierząt. Co więcej, technika ta może być stosowana do wielokrotnych badań myszy w modelach przewlekłych.
Wprowadzenie
Mysz laboratoryjna wyparła praktycznie wszystkie gatunki jako główny model biologii i patobiologii ssaków. Mysz laboratoryjna jest najmniejszym gatunkiem ssaków, który wyraźnie i obszernie wykazał, że jest wartościowy jako model ludzkiej choroby i okazał się nieoceniony w naszym zrozumieniu biologii i chorób człowieka. Krótki czas ciąży i znacznie niższe koszty pozwoliły na opracowanie i badanie myszy zerowych i transgenicznych jako powszechnego narzędzia w badaniach biomedycznych. Jednak wielkość przeciętnej myszy laboratoryjnej (20-25 g) ograniczyła ich badanie w badaniach fizjologicznych lub chirurgicznych, w związku z czym niektórzy badacze badają większe gatunki ssaków. Przeszkodą w wykorzystaniu myszy w tych badaniach jest trudność napotkana przy technikach intubacji, które pozwoliłyby na pomiary fizjologiczne lub rozległe zabiegi chirurgiczne w głębokim znieczuleniu. Tracheostomia 1 była stosowana jako standardowa technika zamiast intubacji ze względu na większą łatwość wykonania tej techniki i niewielkie wymagane umiejętności. Jednak tracheostomia nie sprzyja badaniom nad chirurgią przewlekłą lub rekonwalescencyjną; W związku z tym ogranicza się do ostrych eksperymentów. Tracheostomia może być również zmienną zakłócającą w badaniach, w których ważne jest zapalenie lub wrażliwe odruchy fizjologiczne.
Nasze laboratorium wypróbowało większość technik opisanych przez innych badaczy i uznało je za niewystarczające z różnych powodów. Tracheostomia jest zbyt traumatyczna i wywołuje krwawienie oraz zapalenie dróg oddechowych. O wiele bardziej problematyczne jest to, że nie da się tego powtórzyć. Wiele stosunkowo nieinwazyjnych technik, które wymagają niewielkiej inwestycji w sprzęt, nie jest wystarczająco niezawodnych. Inne techniki wymagają drogiego sprzętu, który jest trudny do uzasadnienia bez pewności, czy sprzęt sprawdzi się w konkretnym zastosowaniu. W związku z tym staraliśmy się opracować nietraumatyczną technikę, która wymagałaby jedynie niewielkiej inwestycji w specjalistyczny sprzęt, mogłaby być wykonana szybko i niezawodnie, mogłaby być powtarzana w modelach przewlekłych i mogłaby być stosowana u dużej liczby zwierząt. Tutaj przedstawiamy taką technikę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie zwierząt
- Uzyskaj myszy starsze niż 8 tygodni i ważące więcej niż 20 g (mniejsze myszy mogą być zaintubowane przez eksperta).
- znieczulenie
- Wstrzyknąć myszom po 20 mg/kg ketaminy i ksylazyny dootrzewnowo jako środek znieczulający. (Dawka ta jest niewystarczająca do pełnego znieczulenia myszy, ale ułatwia bezpieczne przeniesienie, po intubacji, do wentylacji mechanicznej).Jednakże może być konieczne dostosowanie dawek w zależności od odpowiedzi znieczulenia w porozumieniu z lekarzem weterynarii).
- Wywołać znieczulenie u myszy za pomocą 3,5% izofluranu/tlenu w komorze indukcyjnej przez 90-120 sekund.
- Uważnie obserwuj częstość oddechów. Powinien stopniowo zwalniać do nie mniej niż 45 uderzeń na minutę.
2. Przygotowanie do intubacji
- Wyjmij mysz z komory indukcyjnej i mocno wyszoruj.
- Użyj wyściełanych cienkich kleszczyków, aby delikatnie wysunąć język z ust.
- Utrzymuj wyprost języka, trzymając język między dwoma palcami i stosując delikatną siłę.
- Pociągnij mysz w górę na wzierniku otoskopu ruchem pionowym.
- Spójrz przez oko otoskopu, mocno się zacierając i delikatnie pociągnij mysz do góry za język i kark .
- Przyjrzyj się uważnie strunom głosowym. W tym czasie powinny być dobrze widoczne. Przystawka krtaniowa (struktura ujścia krtani) powinna wyglądać na stosunkowo białą. Sznurki powinny się poruszać z każdym oddechem. Jeśli sznury się nie poruszają lub są słabo widoczne, lekko obróć zwierzę i delikatnie przeprostuj szyję.
- Ręką dominującą przytrzymaj cewnik o masie 20 G, 1 cal, z rurką PE10 o długości 1 cm wystającą przez końcówkę cewnika, jak ołówek i włóż go z boku wziernika. Rurka PE służy jako stylik lub bougie.
- Przeprowadź rurkę PE10 (sztylet) przez struny głosowe i przesuń cewnik 20 G (rurkę dotchawiczą) nad rurką PE, aż piasta znajdzie się na poziomie dolnego siekacza. Szybko usuń ten styl.
- Delikatnie zdejmij zwierzę ze wziernika i sprawdź położenie rurki, umieszczając zwierzę na respiratorze mechanicznym z ciągłym 2% izofluranem, aby utrzymać znieczulenie ogólne przez cały czas trwania eksperymentu. Wizualizuj wydychane powietrze (pęcherzyki) przechodzące przez pułapkę PEEP, aby potwierdzić intubację. Chociaż intubacja przełyku może spowodować powstanie kilku pęcherzyków, nie będzie ona tak wyraźna ani tak spójna z intubacją dotchawiczą. Należy również obserwować śledzenie ciśnienia w drogach oddechowych pod kątem ujemnych odchyleń (ryc. 1). Potwierdzają one prawidłowe umieszczenie rurki. Alternatywnie, umieść niewielką ilość wody w rurkach dożylnych i podłącz je do rurki ET. Weryfikacja ruchu do i z myszy za pomocą oddychania2. W przypadku intubacji przełyku śledzenie ciśnienia wykaże znacznie wyższe ciśnienie i brak ujemnych odchyleń. Chociaż CO2 przy końcu oddechu byłoby pomocne, technicznie byłoby to bardzo trudne, biorąc pod uwagę małe objętości oddechowe (~200 μl) i sprzęt do tego celu być bardzo drogie. Opisane proste techniki są w pełni wystarczające i znacznie tańsze. Jeśli znieczulenie izofluranem nie jest dostępne, wszystkie zabiegi można przeprowadzić przy użyciu ketaminy 80-120 mg/kg w połączeniu z ksylazyną 10-20 mg/kg do znieczulenia ogólnego.
3. Technika alternatywna: Laryngoskopia bezpośrednia z techniką otoskopową jest chętnie stosowana do innych celów, głównie do bezpośredniego wkraplania badanych substancji do płuc.
- Wywołać znieczulenie u zwierząt za pomocą samego izofluranu do tej procedury w dawce 3,5% przez 90-120 sekund w komorze indukcyjnej.
- Mocno odrapaj zwierzę u podstawy czaszki i delikatnie rozciągnij język drobnymi kleszczami.
- Trzymając delikatnie język, pociągnij zwierzę prosto do góry na wzierniku (niezmodyfikowanym), aż zwierzę nie będzie mogło być dalej podciągnięte.
- Struny głosowe można uwidocznić najczęściej za pomocą samej techniki, ale obróć zwierzę i nadmiernie wyprostuj szyję, aby uzyskać ich pełny widok.
- Przesunąć pipetę z żelem zawierającą inkraplec do głośni i wkraplać płyn. Ponieważ wziernik uszczelnia się z gardłem dolnym, mysz zasysa resztki płynu, które nie przechodzą przez sznurki. Można to łatwo zweryfikować za pomocą dźwięków, które mysz wydaje teraz podczas oddychania, dopóki płyn nie zostanie w pełni rozprowadzony w płucach.
- Alternatywnie podłącz rurkę PE10 do strzykawki o pojemności 0,5 ml zawierającej 50 μl płynu z bolusem powietrznym za płynem. Ostrożnie przeprowadź rurkę PE przez struny głosowe na 0,5 cm i powoli odprowadzaj zawartość do dróg oddechowych. Jednak sporadyczne urazy dolnych dróg oddechowych występują przy użyciu tej techniki bez lepszego dostarczania próbki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Intubacja z zastosowaniem powyższej techniki jest niezawodna i szybka. Prawidłowe umiejscowienie rurki endotrachealnej najłatwiej zweryfikować, obserwując pęcherzyki wydychanego gazu w zanurzonej końcówce ramienia wydechowego obwodu respiratora (zazwyczaj w pułapce PEEP) oraz ujemne odchylenia na zapisie ciśnienia w drogach oddechowych (Rysunek 1). Ujemne odchylenia na zapisie ciśnienia w drogach oddechowych są najbardziej wiarygodne. Inni autorzy wykorzystywali ruch małej kropli cieczy w drenie dożylnym...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym raporcie opisujemy prostą, niezawodną technikę intubacji myszy, która nie jest traumatyczna i może być stosowana wielokrotnie u tego samego zwierzęcia. Technikę tę można osiągnąć za pomocą prostego sprzętu laboratoryjnego lub medycznego, który można kupić za niewielką sumę. Technika laryngoskopii bezpośredniej, pierwotnie opisana przez Hastingsa i współpracowników4, może być również stosowana do różnych celów, ale głównie do dokładnego dostarczania badanych substancji do dolnych dróg oddechowych. Stwierd...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Grant Merit od Departamentu ds. Weteranów oraz grant T32-HL098062 od NHLBI z National Institutes of Health wsparły tę pracę. Pragniemy wyrazić wdzięczność za rady dr Randolpha H. Hastinga oraz za rady i wsparcie Weterynaryjnej Jednostki Medycznej VA San Diego Healthcare System.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Głowica otoskopu operacyjnego | Welch Allyn | 21700 | $188.98 |
| Uchwyt otoskopu | Welch Allyn | 71000 | $112.20 |
| Wziernik wielokrotnego użytku | Welch Allyn | 22002 | $3.98 |
| Cienkie kleszcze | Miltex | 18-779 | $107.18 |
| Mały stojak zaciskowy do trzymania otoskopu | |||
| Waporyzator izofluranu (wieloobwodowy z obsługą próżniowych gazów odlotowych) | Summit Medical | $ 3,000 | |
| Flexivent (wentylator dla zwierząt) | SCIREQ | $ 35,000 | |
| Cewnik dożylny (20 G, 1 w) | BD | 381233 | $9.62 |
| Rurka polietylenowa (PE10) (0.011 w ID, 0.024 w OD) 100 ft | Intramedic, Clay-Adams | 427401 | $115.70 |
| Ketamina 100 mg / ml (10 butelka ml) | Butler | 23061 | $10.00 |
| Ksylazyna (butelka 100 ml) | Vedco | 24105 | $20.00 |
| Izofluran (butelka 250 ml) | $15.00 | ||
| Bromek wekuronium 10 mg/10 ml | Pfizer | NDC 0069-0094-01 | $15.00 |
Bibliografia
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 8277-8281 (1991).
- Watanabe, A., Hashimoto, Y., Ochiai, E., Sato, A., Kamei, K. A simple method for confirming correct endotracheal intubation in mice. Lab. Anim. 43, 399-401 (2009).
- Orebaugh, S. L. Succinylcholine: adverse effects and alternatives in emergency medicine. Am. J. Emerg. Med. 17, 715-721 (1999).
- Hastings, R. H., Summers-Torres, D. Direct Laryngoscopy in Mice. Contemp. Lab. Anim. Sci. 38, 33-35 (1999).
- Berul, C. I., Aronovitz, M. J., Wang, P. J., Mendelsohn, M. E. In vivo cardiac electrophysiology studies in the mouse. Circulation. 94, 2641-2648 (1996).
- Ewart, S. L., Gavett, S. H., Margolick, J., Wills-Karp, M. Cyclosporin A attenuates genetic airway hyperresponsiveness in mice but not through inhibition of CD4+ or CD8+ T cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 627-634 (1996).
- Ewart, S. L., Mitzner, W., DiSilvestre, D. A., Meyers, D. A., Levitt, R. C. Airway hyperresponsiveness to acetylcholine: segregation analysis and evidence for linkage to murine chromosome 6. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 487-495 (1996).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab. 41, 128-135 (2007).
- Boll, H., et al. High-speed single-breath-hold micro-computed tomography of thoracic and abdominal structures in mice using a simplified method for intubation. J. Comput. Assist. Tomogr. 34, 783-790 (2010).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
- Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. Video-assisted orotracheal intubation in mice. Lab. Anim. 37, 204-206 (2003).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 8, 103-106 (2004).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Lab. Anim. 42, 222-230 (2008).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Cont. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J. Appl. Physiol. 106, 984-987 (2009).
- De Vleeschauwer, S. pI., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab. Anim. 45, 81-89 (2011).
- Zhao, X., et al. A technique for retrograde intubation in mice. Lab. Anim. 35, 39-42 (2006).
- Singer, T., et al. Left-sided mouse intubation: description and evaluation. Exp. Lung Res. 36, 25-30 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
