$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Fiksacja
Utrwalacze są rakotwórcze; noś rękawiczki i trzymaj je w dygestoriach. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie inkubacje przeprowadza się na lodzie, a wszystkie roztwory należy przefiltrować przed użyciem. Używaj odczynników klasy mikroskopii elektronowej.
Dzień 1
- Po warunkach eksperymentalnych (np. wstrzyknięcie wirusa, leczenie farmakologiczne), umieść membranę z organotypowymi plastrami hipokampa na polistyrenowej szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm zawierającej lodowaty bufor fosforanowy 0,1 M (bufor fosforanowy Sorensena), pH 7,3. Dodaj 1 - 2 ml 0,1 M buforu fosforanowego bezpośrednio na plastry, aby były zimne.
KRYTYCZNY KROK: Zawsze używaj świeżo przygotowanych i utrwalaczy. Upewnij się, że pH buforu mieści się w pożądanym zakresie. Niezastosowanie się do tego może spowodować uszkodzenie struktur komórkowych.
- Aby wyizolować podpole CA1 wycinka, użyj jednorazowego skalpela, aby delikatnie przeciąć plasterek obok DG, równolegle do warstwy komórek CA1 (Rysunek 1). Następnie wytnij pozostały plasterek pionowo, aby usunąć subpole CA3 i subiculum. Wytnij róg plasterka, aby pomóc zidentyfikować górną powierzchnię tkanki.
UWAGA: W przypadku, gdy nie jest wymagane dostarczenie interesującego nas białka wirusa, cały wycinek tkanki można naprawić po usunięciu podłoża za pomocą delikatnego płukania lodowatego buforu. Następnie następuje wycięcie CA1.
KRYTYCZNY KROK: Śledź górną część tkanki, aby później prawidłowo podzielić siatki.
- Ostrożnie usuń tkankę z błony za pomocą tylnej strony skalpela. Za pomocą pipety Pasteura delikatnie przenieś tkankę na 12-dołkową płytkę zawierającą 0,1 M bufor fosforanowy.
- Usunąć bufor z płytki i dodać 500 μl - 1 ml lodowatego utrwalacza (pH 7,3) składającego się z następujących składników: 0,1% kwasu pikrynowego, 1% paraformaldehydu i 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Kwas pikrynowy może być wybuchowy po wyschnięciu. Przechowywać go zwilżonego wodą w szczelnie zamkniętym pojemniku. Przechowywać w suchym i dobrze wentylowanym miejscu.
- Wyjąć utrwalacz ze studzienki i przemyć próbki 3 razy (po 20 minut każda) w 0,1 M buforze fosforanowym.
- Inkubować przez 40 minut w 1% kwasie garbnikowym (w/v) w 0,1 M buforze maleinianu o pH 6,0.
- Przepłukać dwukrotnie (po 20 minut) w buforze maleinianowym.
- Inkubować przez 40 minut w 1% octanie uranylu (w/v) w buforze maleinianu w ciemności. Octan uranylu jest wrażliwy na światło i jest radioaktywny. Po rozpuszczeniu przykryć zlewkę preparatem Parafilm i przechowywać niewykorzystany bufor w ciemności w temperaturze 4 °C.
- Przepłukać dwukrotnie (po 20 minut) w buforze maleinianowym.
- Inkubować przez 20 minut w 0,5% chlorku platyny (w/v) w buforze maleinianu.
- Przepłukać dwukrotnie (po 20 minut) w buforze maleinianowym. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą gotowe do dalszego przetwarzania.
2. Odwodnienie i osadzanie
Tlenek propylenu jest rakotwórczy. Unikaj oparów, pracując z nim w dygestorium. Używaj absolutnego, w 100% czystego etanolu, który nie zawiera śladu wody. Rozcieńczyć ten absolutny etanol, aby uzyskać różne stężenia do odwodnienia.
Dzień 2
- Inkubować przez 5 minut w 50% etanolu, a następnie przez 5 minut w 70% etanolu.
- Inkubować przez 15 minut w świeżo przygotowanej 1% p-fenylenodiaminie (PPD) w 70% etanolu.
- Spłucz trzy razy w 70% etanolu.
- Inkubować przez 5 minut w 80% etanolu, a następnie przez 5 minut w 95% etanolu.
- Inkubować w 100% etanolu dwa razy po 5 minut.
- Przygotować szklane fiolki z zakrętkami i upewnić się, że są czyste i całkowicie suche. Przenieść plastry do szklanych fiolek i oznaczyć każdą fiolkę w prosty i wyraźny sposób.
- Inkubować przez 5 minut w stosunku 1:1 etanol:tlenek propylenu.
- Inkubować w 100% tlenku propylenu dwa razy po 5 minut.
- Dodaj żywicę (Epon) do każdej fiolki, aby uzyskać mieszaninę 1:1 z tlenkiem propylenu. Delikatnie mieszaj przez 2 godziny. Nie należy potrząsać fiolkami zbyt rygorystycznie, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, które mogłyby przeszkadzać w zatapianiu.
- Dodaj żywicę, aby uzyskać mieszaninę 3:1 z tlenkiem propylenu i mieszaj przez 2 godziny.
- Przenieś do 100% żywicy i inkubuj O/N.
Dzień 3
- Próbki warstwowe umieszcza się między paskami tworzywa sztucznego ACLAR i utwardza przez 24 godziny w temperaturze 60 °C.
3. Podział i montaż na rusztach
Dzień 4
- Wytnij półcienkie (0,5 μm) odcinki i zabarwij 1% błękitu toluidynowego + 1% boraksu, aby określić prawidłową orientację próbek.
- Wytnij ultracienkie odcinki (60 nm) i zamontuj na rusztach niklowych, po jednej sekcji na siatkę.
4. Immunohistochemia
Wszystkie i woda powinny być przefiltrowane przed użyciem.
Dzień 5
- Umieść kroplę (~50 μl) 1% buforu Tween-20/fosforanowego (T/PB), pH 7,5, na kawałku czystego Parafilmu na płaskiej powierzchni. Delikatnie podnieś siatkę czystymi kleszczami za krawędź i spławiaj ją na buforze, przeciąć w dół i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Spuść nadmiar cieczy z siatki, kładąc sekcję do góry na bibule filtracyjnej, a następnie unosić się na 50 mM glicyny w T/PB przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
KRYTYCZNY KROK: Aby uniknąć nadmiernego 'przenoszenia' roztworów z jednej kropli roztworu na drugą podczas inkubacji, odcedź nadmiar płynu, delikatnie dotykając krawędzi siatki na bibułę filtracyjną #1 pomiędzy każdą wymianą roztworu. Usuń również wszelkie roztwory uwięzione między ramionami kleszczy EM przytrzymujących siatkę, delikatnie odprowadzając kawałkiem bibuły filtracyjnej między ramionami kleszczy, upewniając się, że sekcje nie wyschną całkowicie.
- Osuszyć siatkę bibułą filtracyjną, a następnie unosić się na roztworze blokującym zawierającym 2,5% BSA i 2,5% surowicy zwierzęcia przeciwciała drugorzędowego w T / PB przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (w T/PB) w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C. Optymalny czas i temperatura inkubacji, a także stężenie przeciwciał muszą zostać określone doświadczalnie.
- Umyj kratkę trzy razy (po 2 minuty) za pomocą T/PB.
- Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (1:20 anty-króliczym lub anty-mysim sprzężonym ze złotem 10 nm) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Umyj trzy razy (po 2 minuty) za pomocą T/PB.
- Postfix z 2% aldehydem glutarowym w T/PB przez 5 min.
- Przemyć trzy razy (po 2 minuty) preparatem T/PB, a następnie trzykrotnie (po 2 minuty) przefiltrowaną wodą.
- Inkubować z 2% octanem uranylu w wodzie przez 10 minut.
Podczas barwienia siatki, przygotuj komorę wolną odCO2, umieszczając kawałek Parafilmu na środku szklanej szalki Petriego. Następnie umieść 4-6 granulek NaOH w naczyniu wokół Parafilmu, aby wchłonąć CO2 z powietrza. Trzymaj górę zamkniętą przez kilka minut. Użyj pipety Pasteura i szybko przenieś niewielką objętość roztworu cytrynianu ołowiu Reynoldsa do Parafilmu na szklanej szalce Petriego. Otwórz górną część na tyle, aby włożyć pipetę Pasteura, aby zminimalizować ponowne wprowadzenie CO2 do komory.
UWAGA: Aby przygotować roztwór cytrynianu ołowiu Reynoldsa, zagotuj 100 ml dejonizowanej wody w kuchence mikrofalowej i pozwól mu ostygnąć w hermetycznym pojemniku. W kolbie miarowej o pojemności 50 ml z korkiem wymieszać 1,33 g azotanu ołowiu, 1,76 g cytrynianu sodu i 30 ml przegotowanej wody, energicznie wstrząsając przez 1 minutę. Następnie wstrząsaj z przerwami przez 30 minut. Do tego mętnego roztworu dodać 8 ml 1 M wodorotlenku sodu i powoli odwrócić kolbę kilka razy. Rozwiązanie stanie się jasne. Doprowadzić roztwór do 50 ml z przegotowaną wodą. Przechowywać roztwór szczelnie zamknięty. Jeśli pojawi się osad, wyrzuć i zrób nowy.
- W trzech mniejszych zlewkach przygotuj ciepłą, świeżo przegotowaną wodę dejonizowaną. Zmyj octan uranylu, zanurzając siatkę w pierwszej zlewce i delikatnie obracaj nią przez 30 sekund. Powtórz ten krok w pozostałych dwóch zlewkach.
- Otwórz górną część szklanej szalki Petriego na tyle, aby umieścić siatkę na kropli roztworu cytrynianu ołowiu Reynoldsa. Jeśli to możliwe, noś przy tym maskę, aby uniknąć wdychania cytrynianu ołowiu i zapobiec tworzeniu się osadu. Inkubować przez 10 minut.
- Otwórz górę na tyle, aby wyjąć siatkę. Unikaj wdychania cytrynianu ołowiu. Umyj kratkę trzy razy, zanurzając ją kolejno w trzech zlewkach w ciepłej, świeżo przegotowanej wodzie destylowanej. Pozostaw siatkę do wyschnięcia na kawałku bibuły filtracyjnej, przekrój do góry. Próbka jest teraz gotowa do pracy pod mikroskopem elektronowym.