Powłoki grafenowe do implantów biomedycznych

Podsumowanie

Grafen oferuje potencjał jako materiał powłokowy dla implantów biomedycznych. W niniejszej pracy przedstawiono metodę powlekania stopów nitinolu warstwami grafenu o grubości nanometrów i określono, w jaki sposób grafen może wpływać na odpowiedź implantu.

Streszczenie

Atomowo gładki grafen jako powłoka powierzchniowa ma potencjał do poprawy właściwości implantów. Przedstawiono w ten sposób metodę powlekania stopów nitinolu warstwami grafenu o grubości nanometrów do zastosowań jako materiał stentowy. Grafen wyhodowano na podłożach miedzianych poprzez chemiczne osadzanie z fazy gazowej, a następnie przeniesiono na podłoża nitinolowe. Aby zrozumieć, w jaki sposób powłoka grafenowa może zmienić odpowiedź biologiczną, zbadano żywotność komórek śródbłonka aorty szczura i komórek mięśni gładkich aorty szczura. Ponadto zbadano wpływ powłok grafenowych na adhezję i morfologię komórek za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Komórki wybarwiono pod kątem aktyny i jąder i zauważono różnice między nieskazitelnymi próbkami nitinolu w porównaniu z próbkami pokrytymi grafenem. Całkowitą ekspresję aktyny z komórek mięśni gładkich aorty szczura stwierdzono przy użyciu western blot. Charakterystykę adsorpcji białek, wskaźnik potencjalnej trombogenności, określono dla albuminy surowicy i fibrynogenu za pomocą elektroforezy żelowej. Ponadto przeniesienie ładunku z fibrynogenu na substrat wydedukowano za pomocą spektroskopii Ramana. Stwierdzono, że powłoka grafenowa na podłożach nitinolowych spełniała wymagania funkcjonalne dla materiału stentu i poprawiała odpowiedź biologiczną w porównaniu z nitinolem niepowlekanym. Tak więc nitinol pokryty grafenem jest realnym kandydatem na materiał stentowy.

Wprowadzenie

Ostatnie trzy dekady były świadkami odkrycia nowatorskich terapii opartych na materiałach i urządzeń do leczenia chorób i diagnostyki. Nowatorskie materiały stopowe, takie jak nitinol (NiTi) i stal nierdzewna, są często stosowane w produkcji implantów biomedycznych ze względu na ich doskonałe właściwości mechaniczne. ^1-3 Pozostaje jednak wiele wyzwań związanych z cytotoksycznością materiałów egzogennych, biokompatybilnością i hemokompatybilnością. Metaliczny charakter tych stopów powoduje słabą bio- i hemokompatybilność z powodu wypłukiwania metali, braku adhezji komórek, proliferacji i zakrzepicy w kontakcie z płynącą krwią (taką jak cewniki, przeszczepy naczyń krwionośnych, stenty naczyniowe, sztuczne zastawki serca itp.). ^{1, 4, 5} Interakcja białek lub żywych komórek z powierzchnią implantu może prowadzić do silnej odpowiedzi immunologicznej, a wynikająca z tego kaskada reakcji biochemicznych może niekorzystnie wpłynąć na funkcjonalność urządzenia. Dlatego ważne jest, aby uzyskać kontrolę nad interakcjami między implantami biomedycznymi a otaczającym je środowiskiem biologicznym. Modyfikacja powierzchni jest często stosowana w celu zmniejszenia lub zapobieżenia niekorzystnej reakcji fizjologicznej pochodzącej z materiału implantu. Oczekuje się, że idealna powłoka powierzchniowa będzie charakteryzować się wysoką przyczepnością, obojętnością chemiczną, wysoką gładkością oraz dobrą hemo- i biokompatybilnością. Wcześniej wiele materiałów, w tym węgiel diamentopodobny (DLC), SiC, TiN, TiO₂ i wiele materiałów polimerowych, zostało przetestowanych jako biokompatybilne powłoki powierzchni implantów. ^{1, 6-23} Jednak materiały te nadal nie są w stanie spełnić wszystkich kryteriów funkcjonalnych dla odpowiedniej powłoki powierzchni implantu.

Odkrycie warstwy węgla sp² o grubości atomu, znanej jako grafen, otworzyło drzwi do rozwoju nowych materiałów wielofunkcyjnych. Oczekuje się, że grafen będzie idealnym kandydatem do powlekania powierzchni implantów, ponieważ jest chemicznie obojętny, atomowo gładki i bardzo trwały. W niniejszym liście badamy przydatność grafenu jako powłoki powierzchniowej dla implantów biomedycznych. Nasze badania pokazują, że nitinol pokryty grafenem (Gr-NiTi) spełnia wszystkie kryteria funkcjonalne, a dodatkowo wspiera doskonały wzrost komórek mięśni gładkich i śródbłonka, prowadząc do lepszej proliferacji komórek. Stwierdzamy również, że adsorpcja albuminy w surowicy na Gr-NiTi jest wyższa niż fibrynogenu. Co ważne, (i) nasze szczegółowe pomiary spektroskopowe potwierdziły brak transferu ładunku między grafenem a fibrynogenem, co sugeruje, że powłoka grafenowa hamuje aktywację płytek krwi przez implanty, (ii) powłoki grafenowe nie wykazują żadnej znaczącej toksyczności in vitro dla linii komórkowych śródbłonka i mięśni gładkich, potwierdzając ich biokompatybilność, oraz (iii) powłoki grafenowe są chemicznie obojętne, trwałe i nieprzepuszczalne w środowisku przepływającej krwi. Te właściwości hemo- i biokompatybilne, wraz z wysoką wytrzymałością, obojętnością chemiczną i trwałością, sprawiają, że powłoki grafenowe są idealną powłoką powierzchniową.

Protokół

1. Powłoka grafenowa NiTi

1. Próbki grafenu wykorzystane w tym badaniu wyhodowano na podłożach miedzianych (Cu) przy użyciu techniki chemicznego osadzania z fazy gazowej, a następnie przeniesiono na podłoża NiTi o średnicy 4,5^mm2.
2. Folie Cu (1 cm x 1 cm) umieszczono w piecu z rurą kwarcową o średnicy 1 cala i podgrzano do 1000 °C w obecności 50 sccm H₂ i 450 sccm Ar.
3. Następnie do pieca wprowadzano metan (1 i 4 sccm) o różnym natężeniu przepływu przez 20-30 minut. Próbki ostatecznie schłodzono do temperatury pokojowej pod przepływającymi_H2, Ar i_CH4.
4. Następnie folie Cu zostały pokryte wirowo PMMA (rozcieńczonym 4% anizolem) z prędkością 4 000 obr./min, a następnie poddane obróbce cieplnej przez 5 minut w temperaturze 150 °C. Grafen dołączony do warstwy PMMA uzyskano poprzez wytrawienie folii Cu za pomocą wytrawiacza Transene Inc., wytrawiacza CE-100, a następnie płukanie w 10% HCl i wodzie dejonizowanej przez 10 minut.
5. Próbki przeniesiono na podłoża NiTi (4,5^mm2) i wyżarzano w temperaturze 450 °C w Ar (300 sccm) i_H2 (700 sccm) przez 2 godziny w celu usunięcia PMMA. Na koniec podłoża przemyto acetonem w celu rozpuszczenia pozostałości PMMA w celu uzyskania próbki Gr-NiTi. Monochromator Dilor XY z potrójną siatką został użyty do charakterystyki mikro-ramanowskiej (przy użyciu obiektywu 100X) wszystkich próbek Gr-NiTi ze wzbudzeniem 514,5 nm z lasera jonowego Ar⁺.

2. Toksyczność in vitro Gr-NiTi

Komórki śródbłonka aorty szczura (Cell application Inc.,) były hodowane na szkiełku z 8 komorami pokrytym żelatyną. W celu zbadania wzrostu komórek, nieskazitelne substraty i Gr-NiTiTi umieszczono w studzienkach bez żadnej powłoki żelatynowej. Obrazy ze skaningowej mikroskopii elektronowej uzyskano przy użyciu Hitachi S-4800 SEM. Dodatkowo, komórki mięśni gładkich aorty szczura hodowano również na 96-dołkowych płytkach CellBind jako grupę kontrolną (Corning) w zmodyfikowanym podłożu Eagle Medium (ATCC) firmy Dulbecco.

1. W celu zbadania żywotności komórek, komórki (zarówno komórki śródbłonka, jak i mięśni gładkich) wysiewano w 10⁵ komórkach / studzienka w studzienkach zawierających nieskazitelne substraty NiTi, 1 sccm lub 4 sccm Gr-NiTi, gdzie podany sccm odpowiada przepływowi metanu stosowanemu we wzroście CVD grafenu. Komórki hodowano przez żądany okres czasu w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 ,} wymieniając pożywkę co drugi dzień.
2. W końcowym punkcie czasowym pożywka została usunięta, a do każdej studzienki dodano świeżą pożywkę zawierającą 0,5 mg/ml bromku tetrazolium tiazolylu (lub MTT uzyskanego z Sigma). Komórki były następnie inkubowane przez dodatkowe 3 godziny. W przypadku testu MTS pożywkę usunięto w końcowym punkcie czasowym i zastąpiono 120 μl roztworu roboczego MTS (wodny roztwór Cell Tier 96, Promega) i inkubowano przez 3 godziny.
3. Następnie delikatnie usunięto pożywkę i do każdej studzienki dodano 100 ml dimetylosulfotlenku (Sigma). Po odczekaniu 10 minut na rozpuszczenie kryształów MTT, roztwór przeniesiono na inną płytkę dołka. Do testu MTS do studzienek nie dodano dimetylosulfotlenku. Zawartość studni została przeniesiona na nowy talerz.
4. Absorbancję odczytano przy długości fali 490 nm, a procentową żywotność określono przez normalizację absorbancji do średniej absorbancji nieskazitelnej próbki NiTi. Wykonano co najmniej pięć powtórzeń dla każdego typu próbki.

3. Badania morfologii komórek pod mikroskopią konfokalną

1. Do obrazowania konfokalnego komórek mięśni gładkich aorty szczura substraty umieszczono w 8-komorowym szkiełku (Thermo Scientific). Komórki wysiewano w ilości 25 000 komórek/komorę i inkubowano przez 3 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. Komórki utrwalono na podłożu za pomocą 4% formaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem przez 20 minut.
3. Przepuszczalny z 0,1% Triton-X przez 1 min.
4. Aktynę barwiono falloidyną Alexa Fluor 488 (Life Technologies). 100 μl falloidyny alexafluor 488 w stężeniu 200 jednostek/ml w metanolu dodano do 1,9 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Komórki barwiono 250 μl falloidyny alexafluor 488 przez 45 minut, a następnie dwukrotnie przemywano solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.
5. Jądra montowano za pomocą fluorescencyjnego podłoża montażowego VectaShield zawierającego DAPI (Vector Laboratories). Obrazy konfokalne zostały wykonane za pomocą aparatu Nikon Confocal TI. Jako kontrolę użyto komory obsianej komórkami bez żadnego substratu.

4. Badania adsorpcji białek

1. Wymiary podłoża mierzono suwmiarką przed rozpoczęciem eksperymentów z adsorpcją białek. Wykonano trzy pomiary z każdej strony próbek o powierzchni około kwadratu i uśredniono, aby uzyskać długość i szerokość.
2. Każdą próbkę, nieskazitelny NiTi, 1sccm i 4sccm Gr-NiTi inkubowano z 1 mg/ml albuminy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub 1 mg/ml fibrynogenu w PBS w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
3. Podobne próbki połączono w probówce mikrowirówkowej z 200 μl redukcyjnego buforu do próbek i gotowano przez 5 minut.
4. Próbki następnie rozcieńczono w buforze Tris/Glycine/SDS (Bio-Rad) i przepuszczono przez 4-15% żel do elektroforezy poliakrylamidowej Tris (Bio-Rad) pod napięciem 90 V przez 100 minut.
5. Żele zostały następnie wybarwione SYPRO Red. Rozcieńczyć roztwór podstawowy SYPRO Red (Life Technologies) w stosunku 1:5 000 w 7,5 v/v% kwasie octowym. Plamić żele przez 60 min.
6. Żele obrazowe za pomocą Flourchem SP (Alpha Innotech). Intensywność fluorescencji określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ. Intensywność fluorescencji z każdej próbki znormalizowano przez całkowitą powierzchnię substratu, a adsorpcję fibrynogenu porównano z adsorpcją albuminy.

5. Western Blotting dla ekspresji białka

1. Western blot przeprowadzono w celu analizy całkowitej aktyny w komórkach mięśni gładkich aorty szczura. Komórki wysiewano po 10 000 komórek/substrat na 96-dołkowej płytce.
2. Komórki hodowano przez trzy dni przed usunięciem pożywki. Białko całkowite ekstrahowano przy użyciu buforu RIPA i przeprowadzono standardowy test BCA (Lamda) w celu ilościowego określenia białka całkowitego.
3. Próbki rozcieńczono do tego samego stężenia w RIPA, a następnie gotowano w redukującym buforze do próbek przez 5 minut.
4. Białka oddzielono 4-15% żelem poliakrylamidowym Tris za pomocą elektroforezy pod napięciem 90 V przez 100 minut. Do oceny masy cząsteczkowej białka wykorzystano kalejdoskopowy wzorzec białka (Bio-Rad).
5. Białka przeniesiono do membrany PVDF i zablokowano 1% roztworem beztłuszczowego mleka w proszku (Bio-Rad).
6. Całkowita aktyna została oznaczona króliczym przeciwciałem anty-szczurzym aktyny (Sigma). Do wykrycia przeciwciała pierwszorzędowego użyto zestawu chemiluminescencyjnego BM (Roche). Membrany obrazowano za pomocą sprzętu do obrazowania FlourChem SP, a intensywność fluorescencji mierzono za pomocą oprogramowania ImageJ. Intensywność fluorescencji znormalizowano przez porównanie z nieskazitelną próbką NiTi.

Wyniki

Rysunek 1. a) Grafen polikrystaliczny wyhodowany metodą CVD na foliach Cu naśladuje ziarna kryształu metalu (podziałka skali: 10 μm). b) Widmo Ramana grafenu 1 sccm (4 sccm) wykazuje intensywne (stosunkowo słabsze) pasmo G', co wskazuje na monowarstwowy (kilkuwarstwowy) charakter tak przygotowanego grafenu. c) Obraz AFM grafenu przeniesionego na NiTi wykazuje chropowatość ~5 nm. ...

Dyskusja

Biokompatybilność i cytotoksyczność: Metodą chemicznego osadzania z fazy gazowej (CVD) uzyskano próbki grafenu polikrystalicznego, które naśladowały ziarna kryształu Cu, jak pokazano na rysunku 1a. Zastosowaliśmy spektroskopię Ramana, aby potwierdzić obecność jednowarstwowego (kilkuwarstwowego) grafenu w próbkach 1 sccm (4 sccm) (patrz rysunek 1b). Wyraźnie widać, że próbki 1 sccm (4 sccm) wykazują intensywne (stosunkowo słabsze) pasmo G' wskazujące na jednowarstwowy (kilkuwarst...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
odczynnik
Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco	ATCC	30-2002
Niebieski bromek tetrazolu tiazolylu	Sigma-Aldrich	M2128
CellTiter 96 Wodny test proliferacji komórek w jednym roztworze (MTS)	Promega	G3582
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich	D8418
36,5% formaldehyd	Sigma-Aldrich	F8775
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Alexafluor 488 falloidyna	Life Technologies	A12379
Podłoże montażowe VECTASHIELD z DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Albumina surowicy ludzkiej	Sigma-Aldrich	A9511
Człowiek fibrynogen
Tris/Glicyna/SDS	Bio-Rad	161-0732
Gotowy żel Tris-HCl Żel	Bio-Rad	161-1158
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	45726
SYPRO Red	Life Technologies	S-6653
Test białka o niskiej zawartości BCA	Lamda Biotech	G1003
Precyzja Plus Kalejdoskop Białkowy Standard	Bio-Rad	161-0375
Błona PVDF Immun-Blot	Bio-Rad	162-0177
Bloker blottingu odtłuszczone mleko w proszku	Bio-Rad	170-6404XTU
Przeciwciało antyaktynowe wytwarzane u królika	Sigma-Aldrich	A2066
BM Zestaw do leczenia zaburzeń chemiluminescencji Western Blotting (mysz/królik)	Roche Applied Science
Bufor 11520709001 RIPA	Sigma-Aldrich	R0278
NiTi (51% Ni, 49% Ti)	Alfa-Aesar	44953
Sprzęt
Spektrometr Ramana	JobinYvon	Dilor XY 98
Mikroskop	konfokalny	Nikon Mikroskop
Eclipse TIThermoscientific	Czytnik
Bio-Rad	Zasilacz	164-5050	Zasilacz podstawowy PowerPac
Bio-Rad	Komórka do elektroforezy	165-8004	Mini-PROTEAN tetra cell
Bio-Rad	Kaseta z uchwytem na żel	170-3931	Kaseta z mini uchwytem na żel