Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Podsumowanie

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Streszczenie

Zaawansowana niewydolność serca stanowi główne niespełnione wyzwanie kliniczne, wynikające z utraty zdolnych do życia i/lub w pełni funkcjonalnych komórek mięśnia sercowego. Pomimo optymalnej terapii farmakologicznej, niewydolność serca stanowi główną przyczynę śmiertelności i zachorowalności w krajach rozwiniętych. Głównym wyzwaniem w opracowywaniu leków jest identyfikacja testów komórkowych, które dokładnie podsumowują prawidłową i chorą fizjologię mięśnia sercowego u ludzi in vitro. Podobnie, główne wyzwania w biologii serca regeneracyjnego koncentrują się wokół identyfikacji i izolacji specyficznych dla pacjenta komórek progenitorowych serca w klinicznie istotnych ilościach. Komórki te muszą następnie zostać złożone w funkcjonalną tkankę, która przypomina natywną architekturę tkanki serca. Druk mikrokontaktowy pozwala na tworzenie precyzyjnych mikrowzorów białek, które przypominają strukturalną organizację serca, dostarczając w ten sposób geometrycznych wskazówek do przestrzennej kontroli adhezji komórek. W niniejszym artykule opisujemy nasze podejście do izolacji wysoce oczyszczonych komórek mięśnia sercowego z pluripotencjalnych komórek macierzystych różnicujących się in vitro, generowania powierzchni wzrostu komórek z mikrowzorem z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej oraz składania komórek mięśnia sercowego pochodzących z komórek macierzystych w anizotropową tkankę mięśnia sercowego.

Wprowadzenie

Pomimo ostatnich postępów w terapii medycznej, zaawansowana niewydolność serca pozostaje główną przyczyną śmiertelności i zachorowalności w krajach rozwiniętych. Zespół kliniczny wynika z utraty funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego, a następnie niezdolności niewydolnego serca do zaspokojenia potrzeb metabolicznych osób dotkniętych chorobą. Ponieważ serce ma ograniczoną zdolność regeneracyjną, autologiczny przeszczep serca jest jedyną obecnie klinicznie akceptowaną terapią bezpośrednio mającą na celu uzupełnienie utraconej funkcjonalnej tkanki serca. Istotne wady transplantacji serca, w tym ograniczona liczba serc dawców i konieczność długotrwałego leczenia immunosupresyjnego, wykluczają szerokie zastosowanie tej terapii. W rezultacie terapia medyczna stała się podstawą leczenia pacjentów z chorobami serca. Głównym wyzwaniem w opracowywaniu leków jest identyfikacja testów komórkowych, które dokładnie podsumowują prawidłową i chorą fizjologię mięśnia sercowego in vitro.

Niedawna konwergencja technologii biologii komórek macierzystych i inżynierii tkankowej otwiera nowe, obiecujące możliwości regeneracji serca. Wygenerowanie funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego z odnawialnego źródła specyficznego dla pacjenta byłoby dużym postępem w tej dziedzinie. Pozwoliłoby to na opracowanie specyficznych dla choroby testów komórkowych do opracowywania i odkrywania leków oraz położyłoby podwaliny pod medycynę regeneracyjną serca. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (ES) i, co ważniejsze, ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) stanowią potencjalnie odnawialne, specyficzne dla pacjenta źródło komorowych komórek progenitorowych i dojrzałych miocytów komorowych. Połączenie biologii komórek macierzystych i strategii inżynierii tkankowej rozwiązuje ten problem poprzez generowanie funkcjonalnej tkanki serca in vitro, która może być wykorzystana w opracowywaniu testów komórkowych do odkrywania leków lub w podejściach regeneracyjnych serca w leczeniu zaawansowanej niewydolności serca.

Głównym wyzwaniem w regeneracji serca było zidentyfikowanie optymalnego typu komórek. Badano szeroki wachlarz komórek¹, jednak do tej pory, chociaż odkryto różne multipotencjalne prekursory kardiogenne z różnych źródeł, identyfikacja źródła komórek, które spełnia krytyczne wymagania, takie jak zaangażowanie w los komórek miogennych, utrzymanie zdolności do ekspansji in vivo lub in vitro i skład do funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego okazało się głównym problemem². Wcześniej opisaliśmy podwójny transgeniczny system mysi, który umożliwia izolację wysoce oczyszczonych populacji zaangażowanych komórek progenitorowych komorowych (CVP) z komórek ES różnicujących się in vitro. Wyhodowaliśmy nową podwójnie transgeniczną mysz, która wykazuje ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego dsRed pod kontrolą zależnego od Isl1 wzmacniacza genu MEF2c i wzmocnionego białka zielonej fluorescencji pod kontrolą specyficznego dla serca wzmacniacza Nkx2,5. W oparciu o ten dwukolorowy fluorescencyjny system reporterowy, pierwsze i drugie komórki progenitorowe pola serca z rozwijających się komórek ES można wyizolować za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) zgodnie z ich ekspresją genów MEF2c i Nkx2,5. CVP przypominają miocyty serca w oparciu o wzorce ekspresji markerów mięśnia sercowego oraz cechy strukturalne i funkcjonalne³, co jest bardzo obiecujące dla celów regeneracji tkanki serca.

Chociaż w dziedzinie inżynierii tkankowej dokonano wielu postępów, naśladowanie natywnej architektury komórkowej pozostaje kluczowym wyzwaniem. Konwencjonalne metody radzenia sobie z tym wyzwaniem obejmują sadzenie biologicznych lub syntetycznych rusztowań z komórkami in vitro. Ze względu na szereg wad rusztowań, w tym szybką degradację, ograniczoną stabilność fizyczną i mechaniczną oraz niską gęstość komórek^1,4,5 , podjęliśmy próbę inżynierii tkanki bez rusztowań. Chociaż komórki serca mogą modyfikować swoje lokalne mikrośrodowisko poprzez wydzielanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej, mają bardziej ograniczoną zdolność do organizowania się w miocyty serca w kształcie pręcików przy braku sygnałów zewnątrzkomórkowych. W związku z tym wymagany jest szablon, który zapewnia komórkom odpowiednie wskazówki przestrzenne i biologiczne do skomponowania funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego. Druk mikrokontaktowy rozwiązuje to wyzwanie, zapewniając prostą i niedrogą technikę precyzyjnej kontroli kształtu, organizacji i funkcji komórek^6-8, z których wszystkie mają kluczowe znaczenie dla generowania wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego. Polega ona na zastosowaniu mikroteksturowanych stempli polidimetylosiloksanu (PDMS) o rozmiarach elementów do 2 μm⁹, które umożliwiają osadzanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej na podłożach PDMS w precyzyjnych wzorach, a tym samym wpływają na adhezję komórkową w przestrzeni.

Proponujemy połączenie technologii bioinżynierii tkankowej z biologią komórek macierzystych w celu wygenerowania anizotropowej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego. W związku z tym demonstrujemy tutaj nasze niedawno opublikowane podejście do następujących elementów: (1) generowania mikrowzorów powierzchni białek na podłożach PDMS za pomocą drukowania mikrokontaktowego w celu wygenerowania matrycy dla wyrównanej tkanki mięśnia sercowego, (2) izolacji wysoce oczyszczonych komórek progenitorowych serca z komórek ES różnicujących się in vitro oraz (3) połączenia obu technik w celu wygenerowania wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego.

Protokół

Protokół generowania wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego można podzielić na trzy główne części. Wytwarzanie wzorca z mikrowzorem przy użyciu technik miękkiej litografii nie jest uważane za część poniższego protokołu, ale może być wykonane w oparciu o ustaloną metodę⁶.

1. Mikrokontaktowy druk fibronektyny na podłożach PDMS

1. Wymieszać elastomer Sylgard 184 (Dow Corning) PDMS w stosunku 10:1 do utwardzacza i odgazować zespół za pomocą eksykatora, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
2. Utwardź PDMS na wcześniej wyprodukowanym wzorcu z grzbietami o szerokości 20 μm i wysokości 2 μm, oddzielonymi odstępami 20 μm przez 2 dni w temperaturze pokojowej lub 4 godziny w temperaturze 65 °C, aby uzyskać stemple PDMS z mikroteksturą.

* Utwardzanie w eksykatorze jest wysoce zalecane w celu wyeliminowania wszelkich pęcherzyków powietrza.

3. Wirowanie PDMS na szklanych szkiełkach nakrywkowych (np. 22x22 mm) z prędkością 5 000 obr./min przez 2 minuty za pomocą powlekarki Headway Spin Coater w celu uzyskania cienkich i równych podłoży PDMS o grubości 15 μm.
4. Wyczyść stemple 70% etanolem, aby usunąć cząsteczki kurzu i brudu. Pozwól im wyschnąć na powietrzu.

* Stemple mogą być używane kilka razy, jednak zaleca się regularne odnawianie znaczków PDMS ze względu na ścieranie powierzchni w miarę upływu czasu.

5. Umieść stemple w urządzeniu do czyszczenia plazmowego SPI Plasma-Prep II i przetwarzaj przez 1 minutę w temperaturze 275 mTorr, aby powierzchnie PDMS stały się hydrofilowe.

* Leczenie plazmą tlenową powinno być obserwowane. Dłuższy czas obróbki może spowodować pękanie elastomeru.

6. Sterylizuj stemple 70% etanolem przez 1 min. Szybko wysuszyć sprężonym powietrzem.

* Dalsze kroki powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać sterylność.

7. Pokryć powierzchnie stempla roztworem fibronektyny (50 μg/ml w ddH₂O). Niech się adsorbuje przez co najmniej 10 minut.
8. Strząśnij roztwór fibronektyny ze stempli i szybko wysusz sprężonym powietrzem.
9. Nawiąż konforemny kontakt między stemplami a podłożami PDMS przez 2 minuty i mocno dociśnij.
10. Przepłukać podłoża z mikrowzorami za pomocą ddH₂O. Przechowywać je w ddH₂O maksymalnie przez 2 tygodnie w temperaturze 4 °C, chyba że zostały użyte po raz pierwszy. Przechowuj pieczątki PDMS w ddH₂O.

2. Utrzymanie podwójnie transgenicznych linii embrionalnych komórek macierzystych

Najpierw przygotuj następujące podłoże do hodowli komórek ES myszy:

Mysi fibroblast embrionalny (MEF)-Medium: Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle (DMEM), 10% płodowa surowica bydlęca (FBS) ES komórka lub klasa różnicująca, 1% penicylina-streptomycyna (P/S)

Embrionalne komórki macierzyste (ESC)-Medium: DMEM, 15% FBS ES klasy komórkowej, 1% Aminokwasy endogenne (NEAA), 0,5% P/S, 0,2% Czynnik hamujący białaczkę (LIF), 0,0007% 2-merkaptoetanol (2-ME)

1. Pokryj płytki 6-dołkowe sterylną 0,1% żelatyną w_ddH2Oi pozwól jej adsorbować się przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
2. Dodać MEF-y z rozmrożonej podwielokrotności do 50 ml PBS w stożkowej probówce i odwirować je z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut. Ponownie zawiesić MEF-y w pożywce MEF.
3. Po adsorpcji odessać nadmiar żelatyny i dodać MEF-y do studzienek. Poczekaj 1 dzień na dołączenie MEF.

* Porcja 10 milionów MEFów wystarcza na 3 płytki 6-dołkowe.

4. Po przyłączeniu MEF, dodać komórki ES z rozmrożonej podwielokrotności do 50 ml PBS w stożkowej probówce i odwirować je z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki ES w pożywce ESC i dodać je do studzienek zawierających MEF. Hoduj komórki ES w pożywce ESC, aż do osiągnięcia konfluencji.

* Gdy komórki ES osiągną konfluencję, wymagane jest przechodzenie, aby uniknąć nadmiernego wzrostu i utrzymać kolonie komórek ES.

5. Przygotuj komórki ES do pasażu. Odessać pożywkę ESC i przemyć raz sterylnym PBS.
6. Odessać PBS i dodać 500 μl trypsyny. Proces: 3,5 minuty w temperaturze 37 °C.
7. Kilkakrotnie odpipetować roztwór trypsyny w górę i w dół, aby rozbić kolonie komórek ES i zneutralizować go 500 μl pożywki ESC.
8. Pasażuj komórki ES zgodnie z pożądanym stosunkiem, np. przenieś 33 μl do innego dołka z wcześniej przygotowanymi MEFami do pasażu 1/30. Utrzymuj komórki ES w ESC-Medium.

* Współczynnik przejścia 1/30 pozwala komórkom ES osiągnąć konfluencję w ciągu 3 dni. Pasaż komórek ES zgodnie z harmonogramem różnicowania in vitro.

3. Różnicowanie in vitro podwójnych transgenicznych linii embrionalnych komórek macierzystych oraz izolacja i wysiewanie przodków serca

Najpierw przygotuj następujące podłoża niezbędne do różnicowania in vitro komórek ES:

Adaptacja-Medium: Zmodyfikowane Medium Dulbecco firmy Iscove (IMDM), 15% FBS ES klasy komórkowej, 1% NEAA, 0,5% P/S, 0,2% LIF, 0,0007% 2-ME

Differentiation-Medium: IMDM, 15% FBS Differentiation-grade. 1% NEAA, 0.5% P/S, 0.35% 0.1M Kwas askorbinowy, 0.0007% 2-ME

1. Różnicowanie in vitro rozpoczyna się, gdy komórki ES osiągną konfluencję. Pokryć 10-centymetrowe szalki hodowlane sterylną 0,1% żelatyną w ddH₂O i pozostawić do adsorpcji przez 15 minut w temperaturze 37 °C.

* Bądź świadomy czasu trwania procesu różnicowania in vitro. Potrzeba 8 dni, aby można było wyizolować komórki progenitorowe serca. Odpowiednio zaplanuj swoje eksperymenty.

2. Zbierz komórki ES tak jak poprzednio. Po adsorpcji odessać nadmiar żelatyny i dodać około 1/3-1/2 zawiesiny komórek ES do przygotowanych szalek hodowlanych zawierających pożywkę adaptacyjną. Hoduj komórki przez 2 dni.

* Wybierz ilość komórek ES do adaptacji zgodnie ze swoimi eksperymentami.

3. Zbierz przystosowane komórki ES do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej PBS, używając 1,5 ml trypsyny. Odwirować zdysocjowane komórki ES przy 1,000 obr./min przez 5 minut i ponownie zawiesić je w pożywce różnicowej.
4. Za pomocą pipety wielokanałowej należy przygotować ciała zarodkowe (EB) składające się z około 1000 komórek na 10 μl, które upuścić na 15-centymetrowych szalkach hodowlanych. Odwrócić płytki i EB kultury w postaci wiszących kropel przez 2,5 dnia w temperaturze 37 °C.
5. Po 2,5 dnia należy połączyć EB składające się z 6-8 15-centymetrowych szalek hodowlanych w jedno za pomocą pożywki różnicującej i hodować je przez kolejne 3,5 dnia w temperaturze 37 °C.
6. Po 3,5 dnia zebrać EB do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i pozostawić je opaść na dno na około 5 minut. Zassać supernatant i przemyć EB sterylnym PBS. Pozwól EB ponownie opaść na dno na około 5 minut.
7. Oddzielić EB, przetwarzając je z 2,5 ml trypsyny przez 2 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, delikatnie potrząsając probówką. Następnie dodaj 2. 5 ml sterylnego PBS do roztworu trypsyny i pipetować w górę i w dół pipetą serologiczną o pojemności 10 ml około 8-10 razy w celu rozbicia skupisk komórek. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 10 ml buforu FACS zawierającego 7,5% komórek FBS ES lub klasy różnicowania i 0,01% DAPI w PBS.
8. Odwirować zdysocjowane EB przy 1 000 obr./min przez 5 minut i ponownie zawiesić je w około 1 ml buforu FACS. Pipetować w górę i w dół pipetą o pojemności 1 ml około 8-10 razy, aby rozbić skupiska komórek.

* Dodaj bufor FACS zgodnie z szacowaną ilością zdysocjowanych EBs. Zbyt mocno skoncentrowane komórki mogą zatkać się podczas FACS, a zbyt nisko skoncentrowane komórki mogą niepotrzebnie wydłużyć czas FACS.

9. Przenieś komórki do sterylnej probówki okrągłodennej z sitkiem o wielkości 35 μm, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
10. Posortuj zróżnicowane komórki ES za pomocą cytometru przepływowego FACSAria i uzyskaj oczyszczone populacje CVP.

*Opracowaliśmy wieloetapową strategię bramkowania, aby izolować wysoce oczyszczone kolorowe komórki. Krótko mówiąc, najpierw skupiamy się na amplitudzie rozproszenia do przodu (FSC-A) i amplitudzie rozproszenia bocznego (SSC-A) (rysunek 1A). Dzięki temu możemy oddzielić całe komórki od resztek komórkowych. Następnie bramkujemy FSC-A i Forward Scatter-Width (FSC-W) (Rysunek 1B). Dzięki temu możemy wyizolować singlety komórkowe z dubletów i innych agregatów komórkowych. Następnie bramkujemy na SSC-A i Side Scatter-Width (SSC-W) (Rysunek 1C). Zwiększa to czystość singletów komórkowych. Następnie wprowadzamy barwienie DAPI, aby wyizolować żywe komórki (DAPI-ujemne) od komórek niezdolnych do życia (ryc. 1D). Następnie skupiamy się na amplitudzie fikoeryhtryny (PE-A) i amplitudzie barwnika PE-cyjaniny 7 (PE-Cy7-A), aby uzyskać prawdziwe czerwono-dodatnie ^(R+) i prawdziwe czerwono-ujemne (R-) komórki i wykluczyć autofluorescencyjne komórki czerwono-ujemne (Figura 1E). Komórki R ⁺ i R^- są następnie bramkowane oddzielnie na amplitudzie izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC-A) i PE-A w celu sortowania prawdziwych komórek zielono-dodatnich (G⁺) i prawdziwych zielono-ujemnych (G^-) w tych populacjach (ryc. 1F + 1G). Daje to 4 populacje komórek w następujący sposób: R ⁺ G ⁺, R ⁺ G^-, ^{R-G +} i ^R-G- (Figura 1H).

11. Pasywować podłoża mikrowzorzyste 1% Pluronem F-127 w ddH₂O przez 10 min. Następnie umyj je 3x sterylnym PBS.

* Pluronic F-127 to środek powierzchniowo czynny, który blokuje adhezję komórek. Wspomaga ograniczenie adhezji komórek do obszaru z mikrowzorami.

12. Przymocuj uszczelki PDMS wokół wzorzystego obszaru i mocno dociśnij. Następnie wysiewaj CVP na podłożach z mikrowzorzyskami fibronektyny.

Wyniki

FACS-oczyszczanie in vitro zróżnicowanych komórek ES ujawniło cztery odrębne populacje komórek progenitorowych (Rysunek 1). Obecność fibronektyny z mikrowzorcami została potwierdzona za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, która wykazała całkowite przeniesienie ciągłych linii fibronektyny (ryc. 2). Posiew wyizolowanych przez FACS komórek progenitorowych na mikrowzorcach fibronektyny spowodował wyrównanie R ⁺ G ⁺ i części populacji ^{R-G ...}

Dyskusja

W tym protokole przedstawiliśmy metodę izolowania oczyszczonych populacji kardiogennych komórek progenitorowych i wysiewania ich na mikrowzorcowych substratach fibronektyny, co pozwala im wyrównać się i przyjąć kształt pręcika przypominający miocyty serca. Prawidłowa organizacja komórkowa ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania tkanek^8,10 , w szczególności dla tkanki mięśnia sercowego. Wykazano, że miocyty serca rozwijają ulepszone właściwości mechaniczne^11,12 i elektrofizjologiczne

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas L-askorbinowy	Sigma-Aldrich	A4544	Przygotuj roztwór 0,1 M w dezykatorze ddH2O
, próżnia 10 cali	Nova-Tech International, Inc.	55206
4',6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI)	Life Technologies	D1306
Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle Medium	Thermo Scientific	SH30022.01
DPBS	Gibco	14190
Cytometr przepływowy FACSAria II	BD Biosciences
Płodowa surowica bydlęca ES klasy komórkowej	Gemini Bio-Products	100-106
Płodowa surowica bydlęca Klasa różnicująca	Gemini Bio-Products	100-500
Fibronektyna z osocza bydlęcego	Sigma-Aldrich	F4759	Rozpuszczać do 1 mg/ml w ddH2O
Fisherfinest Premium Szkło nakrywkowe 22x22mm	Fisher Scientific	12-548-B
Żelatyna ze skóry wieprzowej	Sigma-Aldrich	G1890	Przygotuj 0,1% roztwór w ddH2O
Headway Spin Coater	Headway Research, Inc.	PWM32-PS-CB15
Silbecco's Medium Thermo	Scientific	SH30228.01
	Samodzielnie przygotowany z linii		Przygotuj 500x roztwór podstawowy
MEM Aminokwasy endogenne	Gibco	11140-050
2-Mercapt– thanol	Sigma-Aldrich	M6250
Mysie fibroblasty embrionalne	Zbierane od 12 do 15 dnia zarodki myszy
	Gibco	15140-122
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Przygotuj 1% roztwór w ddH2O
Probówka okrągłodenna z 35 μ m Sitko do komórek	BD Biosciences	352235
SPI Plasma-Prep II Środek do czyszczenia plazmy	SPI Supplies	11005-AB
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych	Dow Corning	184 ZESTAW SIL ELAST 0,5 KG
0,25% Trypsyna-EDTA	Gibco	25200-056
Wakuometr	SPI Supplies	11019-AB