Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.
Artykuł metodologiczny
Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metody optogenetyczne okazały się potężnym narzędziem do wyjaśniania aktywności obwodów neuronalnych leżących u podstaw różnorodnych zachowań u szerokiego zakresu gatunków. Narzędzia optogenetyczne pochodzenia mikrobiologicznego składają się z wrażliwych na światło białek błonowych, które są w stanie aktywować (np. rodopsyna kanałowa-2, ChR2) lub wyciszać (np. halorodopsyna, NpHR) aktywność neuronalną zdefiniowanych ingentynkowo typów komórek w behawioralnie istotnych skalach czasowych. Najpierw demonstrujemy proste podejście do dostarczania transgenów ChR2 i NpHR za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem do grzbietowego subiculum i regionu przedlimbicznego kory przedczołowej u szczurów. Ponieważ ChR2 i NpHR są genetycznie celowane, opisujemy zastosowanie tej technologii do kontrolowania aktywności elektrycznej określonych populacji neuronów (tj. neuronów piramidowych) osadzonych w heterogenicznej tkance z dużą precyzją czasową. Opisujemy tutaj sprzęt, niestandardowy interfejs użytkownika oprogramowania i procedury, które pozwalają na jednoczesne dostarczanie światła i zapis elektryczny z transdukowanych neuronów piramidowych w znieczulonym preparacie in vivo. Te reagujące na światło narzędzia dają możliwość zidentyfikowania przyczynowego wkładu różnych typów komórek w przetwarzanie informacji i zachowanie.
Wprowadzenie
Zdolność do aktywacji lub wyciszenia określonego typu komórki w obwodzie neuronalnym w sposób czasowo precyzyjny jest kluczowa dla zrozumienia, jak obwody neuronowe przetwarzają różne rodzaje informacji leżących u podstaw emocji i poznania. Eksperymentalna kontrola nad nienaruszoną aktywnością neuronalną wykorzystuje narzędzia do utraty / wzmocnienia funkcji (np. stymulacji elektrycznej, modulacji farmakologicznej, uszkodzenia), które nie zapewniają selektywnie wymaganych do kontrolowania określonych populacji neuronów, zarówno w skali czasowej, jak i przestrzennej. Bezpośrednio odpowiadając na te wyzwania technologiczne, opracowanie i zastosowanie genetycznie kodowalnych narzędzi światłoczułych umożliwiło neuronaukowcom kontrolowanie aktywności elektrycznej wybranych typów komórek podczas dobrze zdefiniowanych zdarzeń behawioralnych. Wiele z tych wrażliwych na światło białek jest pochodzenia mikrobiologicznego, z bramkowanym światłem kanałem kationowym, rodopsyną kanałową-2 (ChR2) 1 i napędzaną światłem pompą chlorkową, halorodopsyną (NpHR) 2,3, w powszechnym użyciu.
Główną zaletą optogenetyki jest możliwość genetycznego celowania w określone populacje komórek w heterogenicznych regionach mózgu, a technika ta została z powodzeniem zastosowana do wielu organizmów modelowych (od bezkręgowców po naczelne inne niż ludzie) 4-6. Wyhodowano wiele optogenetycznych zwierząt transgenicznych, które są dostępne na rynku 7,8, jednak tworzenie linii transgenicznych może być pracochłonne i kosztowne. Tutaj opisujemy protokół dostarczania genów ChR2 i NpHR za pośrednictwem wirusa pod promotorem CaMKIIα w korze przedlimbicznej szczura i podbrzuszu grzbietowym przy użyciu wektora rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (AAV). W obrębie przodomózgowia ekspresja CaMKIIα występuje wyłącznie w neuronach piramidowych glutaminergicznych 9. AAV jest powszechnie stosowany do badań podstawowych ze względu na jego względną łatwość produkcji i brak patogenności, a także silną i trwałą ekspresję transgenu, którą osiągnięto za pomocą tych wektorów 10. Dodatkowo przedstawiamy kroki i sprzęt do jednoczesnego dostarczania i nagrywania światła u znieczulonych szczurów z mocowaną głową.
Protokół
1. Przechowywanie i przygotowanie wirusów
- Stosowanie niekompetentnych do replikacji wektorów AAV do dostarczania genów opsyny do mózgu gryzoni jest zatwierdzone do poziomu bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL-1) i wymaga odpowiednich procedur ochrony i obchodzenia się, zgodnie z publikacją rządu USA, Biosafety in Microbiology and Biomedical Laboratories, dostępną na stronie internetowej Centers for Disease Control pod adresem (http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm).
- Aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, należy pipetować wirusa z fiolki producenta do mniejszych porcji roboczych w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
- Przed wstrzyknięciem stereotaktycznym należy odczekać, aż podwielokrotność rozmrozi się na lodzie, a następnie krótko odwirować za pomocą wirówki stołowej.
- Powoli napełnij szklaną strzykawkę i igłę Hamiltona niewielką ilością silikonu lub oleju mineralnego. Upewnij się, że w cylindrze strzykawki nie ma widocznych pęcherzyków powietrza. Włożyć strzykawkę do pompy mikroiniekcyjnej i przymocować pompkę bezpośrednio do pionowego ramienia stereotaktycznego (tj. manipulatora stereotaktycznego).
- Opuścić ramię stereotaktyczne, aż końcówka igły dotknie dna probówki z podwielokrotnym wirusem. Użyj sterownika pompy mikrowtryskiwacza, aby pobrać żądaną objętość wirusa (1,5 μl dla wstrzyknięcia 1 μl).
- Wszystkie materiały i powierzchnie, które mają kontakt z wirusem, należy odkazić środkiem dezynfekującym, takim jak wybielacz chlorowy (10%).
2. Chirurgia i wstrzyknięcie wirusa
- Znieczulić zwierzę koktajlem ketaminy (szczur; 125 mg/kg, i.p.) - ksylazyna (szczur; 10 mg/kg, i.p.). Aby ocenić skuteczność znieczulenia, sprawdź odruchową reakcję na uszczypnięcie palca u nogi i w razie potrzeby podaj dodatkowe dawki ketaminy. Stosując standardowe aseptyczne metody chirurgiczne, umieść zwierzę w aparacie stereotaktycznym (David Kopf Instruments).
- Wykonaj nacięcie w linii środkowej przez skórę na szczycie czaszki zwierzęcia za pomocą małych nożyczek chirurgicznych lub skalpela. Delikatnie oddziel tkankę łączną i oczyść górną część czaszki małym skrobakiem do kości.
- Sprawdź, czy głowa zwierzęcia jest wypoziomowana w taki sposób, aby współrzędne z dla bregma i lambda były równe. Określ współrzędne stereotaktyczne dla docelowego obszaru mózgu z atlasu mózgu, takiego jak The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (George Paxinos i Charles Watson, Academic Press, 2007) lub The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates (Keith B.J. Franklin i George Paxinos, Academic Press, 2007). Zaznaczyć zamierzone miejsce wstrzyknięcia pisakiem chirurgicznym.
- Ostrożnie rozrzedź czaszkę nad obszarem docelowym za pomocą ręcznego wiertła i zatrzymaj się, gdy wiertło dotrze do dna czaszki. Za pomocą pary bardzo cienkich kleszczy usuń przerzedzoną kość, aby odsłonić oponę twardą.
- Umieść igłę strzykawki nad obszarem docelowym i opuść igłę, aż dotknie opony twardej i użyj tego punktu do obliczenia współrzędnej z. Bardzo powoli należy opuścić igłę do wstrzykiwania do mózgu, aż do osiągnięcia właściwej pozycji z. W tym protokole obszar przedlimbiczny przyśrodkowej kory przedczołowej (2,7 mm przed bregmą, ± 0,5 mm bocznie do linii środkowej i -2,2 mm od opony twardej) lub grzbietowy subiculum (-6,0 mm przed bregmą, ± 3,0 mm bocznie do linii środkowej i -2,0 mm od opony twardej) jest ukierunkowany na dorosłego samca szczura Sprague Dawley (ok. 275 g).
- Wstrzyknąć wirusa z szybkością 0,1 μl/min. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać 10 minut przed wyjęciem igły, aby uniknąć cofania się wirusa na powierzchnię mózgu.
- Użyj szwu do szycia z dołączoną igłą, aby uszczelnić skórę i nałożyć antybiotyki na ranę.
- Przebieg czasowy ekspresji funkcjonalnej ChR2 i NpHR z wektorów AAV będzie się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego i miana wirusa. W tym eksperymencie nagrania in vivo wykonano 18-21 dni po wstrzyknięciu.
3. Dostarczanie światła i rejestracja in vivo neuronów eksprymujących ChR2 lub NpHR
- Podłącz elektrodę wolframową (~1-1,5 MΩ, MicroProbes) do szklanej rurki kapilarnej (Fisher Scientific) za pomocą super kleju.
- Użyj narzędzia do zdejmowania izolacji ze światłowodów (Thorlabs), aby odsłonić goły koniec światłowodu wielomodowego (rdzeń o średnicy 200 μm, Thorlabs) i wyczyść końcówkę światłowodu etanolem. Bardzo delikatnie naciąć końcówkę włókna diamentowym nożem w kształcie klina (Thorlabs) i ostrożnie usunąć nadmiar włókna (np. drobnymi kleszkami). Włókno powinno łatwo się rozszczepiać przy nacięciu.
- Podłącz końcówkę FC światłowodu do złącza PC na porcie wyjściowym lasera z pojedynczą diodą o mocy 200 mW (www.Lumiphy.com) o żądanej długości fali. Upewnij się, że podczas pracy z laserami zawsze noszone są odpowiednie okulary ochronne.
- Zmierz intensywność lasera na końcówce światłowodu za pomocą miernika mocy optycznej (www.Lumiphy.com ). W przypadku nagrań in vivo natężenie światła wynoszące zaledwie 20-100 mW/mm2 może niezawodnie wywołać odpowiednio aktywację lub wyciszenie aktywności neuronalnej za pośrednictwem ChR2 lub NpHR.
- Włóż światłowód do rurki kapilarnej. Umieść końcówkę włókna około 500 μm nad końcówką elektrody wolframowej i zawiąż cienką nić szwu dwukrotnie w kilku punktach w pobliżu końcówki, tak aby elektroda i włókno były proste. Upewnij się, że odległość między końcówką elektrody a najbliższym węzłem jest wystarczająco duża, aby można było wprowadzić ją do obszaru docelowego.
- Przygotuj zwierzę jak w krokach 2.1 i 2.2 powyżej. Użyj początkowej kraniotomii jako przewodnika, aby stworzyć nowe, czyste małe okienko w czaszce do pozycjonowania optrody (www.Lumiphy.com ). Wykonaj małe nacięcie na oponie twardej za pomocą cienkiej igły.
- Ostrożnie opuść optrodę przez okienko czaszki i do mózgu do transdukowanego obszaru za pomocą mikromanipulatora (Narishige). Następnie powoli przesuwaj optrodę w krokach co 10-50 μm, aż do pojawienia się ogniwa reagującego na światło.
- Niestandardowy interfejs użytkownika oprogramowania (NeuroLux Pro www.Lumiphy.com) napisany w LabVIEW (National Instruments) służy do sterowania laserem z pojedynczą diodą oraz do wizualizacji i rejestrowania bieżącej aktywności neuronalnej. Nagrane sygnały są przechwytywane za pomocą wzmacniacza ExAmp-20K (Kation Scientific) z filtrem pasmowo-przepustowym (0,3-8 kHz) oraz karty analogowo-cyfrowej National Instruments (NI USB-6009). Interfejs użytkownika NeuroLux Pro umożliwia wybór wejść analogowych (wybierz dwa kanały dla sygnału neuronalnego i TTL) oraz wyjścia cyfrowego. Użytkownik może zdefiniować częstotliwość próbkowania (20 kHz), okres linii bazowej (przed oświetleniem) i okres po świetle. Użytkownik może zdefiniować szerokość, częstotliwość i okres stymulacji laserowej TTL (jeśli częstotliwość wynosi 20 Hz, a okres stymulacji wynosi 500 ms, dostarczanych jest 10 impulsów laserowych o zdefiniowanej szerokości impulsu). Użytkownik może również wybrać ciągły dopływ światła (np. Rysunek 1). W przypadku powtarzających się nagrań użytkownik może również zdefiniować liczbę ciągów impulsów i odstęp między pociągami. Dane można pobierać z nagrywaniem na dysk lub bez niego.
- Po nagraniu zwierzęta są znieczulane koktajlem ketaminy/ksylazyny i perfundowane przezsercowo solą fizjologiczną i paraformaldehydem (4%) w celu sprawdzenia umiejscowienia optrody i ekspresji opsyny.
Wyniki
Rycina 1 przedstawia zrzut ekranu dostosowanego oprogramowania (NeuroLux Pro) opracowanego w środowisku LabVIEW (National Instruments), wykorzystywanego do jednoczesnego rejestrowania aktywności neuronalnej i kontrolowania parametrów impulsów światła (tj. częstotliwości impulsów, szerokości impulsu, okresu stymulacji). Program komputerowy wysyła sygnał sterujący do cyfrowego urządzenia akwizycyjnego, które generuje impulsy TTL służące do sterowania pojedynczym laserem diodowym. Dodatkowo program wyświetla i przechowuje zarejestrowaną aktywność neuronalną oraz dostarczone sygnały TTL. Sygnały te są digitalizowane przez urządzenie akwizycyjne przy określonej częstotliwości próbkowania (np. 20 kHz). Zarejestrowane sygnały są zapisywane w pliku binarnym jako dwuwymiarowa tablica o podwójnej precyzji.
Rysunek 2 przedstawia niestandardową optrodę składającą się z elektrody wolframowej przymocowanej do światłowodu. Światłowód jest mocowany do elektrody w trzech punktach za pomocą cienkiej nici chirurgicznej. W razie potrzeby do ich połączenia można użyć superglue. Należy jednak unikać trwałego mocowania światłowodu do elektrody, ponieważ choć elektrodę można wykorzystać wielokrotnie, transmisja światła przez światłowód ulega pogorszeniu przy wielokrotnym użyciu, w związku z czym przy każdym wprowadzeniu do mózgu należy go przeciąć i oczyścić lub wymienić na nowy.
Lewe panele Rysunku 3 przedstawiają obrazy fluorescencyjne wzmocnionego żółtego białka fluorescencyjnego, wskazujące na rzeczywistą ekspresję ChR2 i NpHR. Fotografie te ukazują reprezentatywną ekspresję NpHR w grzbietowej części subiculum szczura (Rysunek 3A) oraz ekspresję ChR2 w korze przedlimbicznej (Rysunek 3B). Ekspresja wirusowa była ograniczona głównie do grzbietowej części subiculum i kory przedlimbicznej (np. pewna fluorescencja była obserwowana w zakręcie zębatym (Rysunek 3A, lewo)). Zaobserwowano również ślady elektrody (cienki ślad, grot strzałki) oraz światłowodu (gruby ślad, strzałka).
Lewy panel Rysunku 4 pokazuje, że ChR2 indukował precyzyjnie czasowo zsynchronizowane wyładowania w korze przedlimbicznej szczura. Rysunek 4A przedstawia przykładowy zapis potencjałów czynnościowych wywołanych przez ChR2 w odpowiedzi na podawanie impulsów niebieskiego światła o czasie trwania 10 msec z częstotliwością 20 Hz do kory przedlimbicznej szczura. Wykres rastrowy (Rysunek 4B) pokazuje indukowaną przez ChR2 aktywację w sześciu reprezentatywnych neuronach. Wszystkie rejestrowane neurony wykazały wywołane światłem wyładowania z idealną wiernością. W przeciwieństwie do ChR2, NpHR szybko i odwracalnie wyciszał aktywność spontaniczną in vivo w korze przedlimbicznej szczura (prawy panel Rysunku 4). Rysunek 4C to przykładowy zapis pokazujący, że ciągła iluminacja światłem 532 nm (10 s) kory przedlimbicznej wykazującej ekspresję NpHR pod promotorem CaMKllα eliminuje spontaniczną aktywność pojedynczych jednostek in vivo. Należy zauważyć, że całkowite wyciszenie aktywności komórek piramidalnych kory przedlimbicznej jest zsynchronizowane czasowo z 10-sekundowym ciągłym podawaniem światła. Dolny wykres rastrowy (Rysunek 4D) pokazuje indukowane przez NpHR wyciszenie w sześciu reprezentatywnych neuronach. Obie rejestracje in vivo są typowe dla tych uzyskanych od dorosłych szczurów Sprague-Dawley, u których dostarczenie genów opsyn mikrobiologicznych za pomocą AAV miało miejsce 18–21 dni wcześniej.
Rysunek 5 przedstawia wynik powtórnej stymulacji ChR2 piramidowego neuronu przedlimbicznego szczura. Puls niebieskiego światła (10 msec) był podawany z częstotliwością 20 Hz przez 5 sec (łącznie 100 impulsów). Przebiegi napięcia wywołanych światłem impulsów elektrycznych były rejestrowane powtarzalnie co 2 min podczas 2-godzinnej sesji pomiarowej (łącznie 61 powtórzeń). Nawet przy zastosowaniu tego protokołu stymulacji powtórzeniowej, ChR2 indukował stabilne i silne wyładowania w odpowiedzi na podawanie światła.
Ryciny 6 i 7 przedstawiają wyniki fotoinhibicji indukowanej przez NpHR oraz fotoaktywacji aktywności neuronów subikularnych szczura sterowanej przez ChR2. Podobnie jak w przypadku kory przedlimbicznej, NpHR i ChR2 były w stanie pośredniczyć w indukowanym światłem, zsynchronizowanym czasowo hamowaniu i aktywacji neuronów subikularnych transdukowanych opsynami z wysoką powtarzalnością.
Rycina 1. Zrzut ekranu interfejsu oprogramowania NeuroLux Pro do jednoczesnego dostarczania światła i rejestracji elektrofizjologicznej. Przedstawiony zapis pokazuje wywołane przez NpHR wyciszenie spontanicznej aktywności komórki piramidowej kory przedlimbicznej szczura w odpowiedzi na 10 s ciągłego dostarczania światła o długości fali 532 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Rysunek 2. Powiększony obraz niestandardowej optrody. Światłowód został wprowadzony do szklanej kapilary przymocowanej do elektrody wolframowej i utrwalonej do elektrody za pomocą nici chirurgicznej. Odległość od środka do środka między końcówką elektrody a końcówką światłowodu wynosi około 500 μm.
Rycina 3. Ekspresja wirusowa i rozmieszczenie optrody. (Lewo) Zdjęcia przedstawiają reprezentatywną ekspresję NpHR w grzbietowym podkładzie (A) oraz ekspresję ChR2 w korze przedlimbicznej (B). (Prawo) Schemat przedstawiający miejsce wykonania każdego zdjęcia. Grot strzałki i strzałka na każdym zdjęciu wskazują odpowiednio położenie elektrody wolframowej oraz włókna optycznego. SUB: podkład, DG: zakręt zębaty, PL: kora przedlimbiczna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę.
Rycina 4. In vivo rejestracje elektrofizjologiczne z kory przedlimbicznej szczura po transdukcji ChR2 lub NpHR. (A) Przykładowy zapis potencjałów czynnościowych wywołanych przez ChR2 w odpowiedzi na dostarczenie impulsów światła niebieskiego (473 nm) z częstotliwością 20 Hz (10 msec, niebieski pasek). (B) Wykres rastrowy pokazujący indukowane przez ChR2 kolce w sześciu reprezentatywnych neuronach. Aktywność każdej jednostki jest zaznaczona kropką. (C) Przykładowy zapis supresji aktywności spontanicznej indukowanej przez NpHR podczas ciągłego naświetlania światłem zielonym (532 nm) (10 sec, zielony pasek). (D) Wykres rastrowy pokazujący indukowane przez NpHR wyciszenie w sześciu reprezentatywnych neuronach. Aktywność każdej jednostki jest zaznaczona kropką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Rycina 5. Repetytywne wywoływanie impulsowania o częstotliwości 20 Hz za pomocą ChR2 w piramidowym neuronie przedlimbiczny szczura in vivo. (A) Przebiegi napięcia dla impulsowania wywołanego światłem, zarejestrowane w punktach czasowych 0, 30, 60, 90, 120 min po rozpoczęciu pomiarów. (B) Raster plot pokazujący wszystkie 61 powtórzeń (2 min odstępu między próbami, łącznie 120 min) aktywacji indukowanej światłem. Aktywność każdej jednostki zaznaczono kropką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Rycina 6. Rejestracje elektrofizjologiczne in vivo z grzbietowej części podkolecia szczura po transdukcji NpHR. (A) Przykładowy zapis pokazujący, że ciągłe naświetlanie światłem o długości 532 nm przez 10 s (zielony pasek) grzbietowej części podkolecia wykazującej ekspresję NpHR eliminuje aktywność spontaniczną. (B) Średnie przebiegi fal dwóch zarejestrowanych jednostek z powyższego zapisu. Do identyfikacji dwóch odrębnych neuronów zastosowano próg amplitudy. (C) Wykres rastrowy przedstawiający pięć powtórzeń wywołanego przez NpHR wyciszenia tych jednostek. Aktywność każdej jednostki zaznaczono kropką).
Rysunek 7. Powtarzalna aktywność impulsowa neuronu grzbietowej części obszaru subikularnego szczura sterowana przez CR2 o częstotliwości 20 Hz in vivo. (A) Zapisy potencjału dla aktywności impulsowej wywołanej światłem, uzyskane w punktach czasowych 0, 30, 60, 90, 120 min po rozpoczęciu pomiarów. Wstawka: typowa aktywność seryjna tej komórki. (B) Wykres rastrowy pokazujący wszystkie 61 powtórzeń (2 min odstępu między próbami, łącznie 120 min) aktywacji indukowanej światłem. Aktywność każdej jednostki zaznaczono kropką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Dyskusja
Dostępny jest szeroki wachlarz technik genetycznego ukierunkowania genów opsyny drobnoustrojów na odrębne regiony mózgu u gryzoni. Dostarczanie genów wirusowych zapewnia stosunkowo niedrogie i szybkie podejście do pośredniczenia w ekspresji ChR2 i NpHR ze specyficznością dla typu komórki. Systemy wektorów AAV są częstym wyborem do stosowania w eksperymentach optogenetycznych ze względu na wysokie miana produkcyjne, które pozostają stabilne podczas przechowywania, brak patogenności i zdolność do wytwarzania długotrwałej ekspresji genów 10. Wiele konstruktów opsyny z promotorami specyficznymi dla typu komórki jest komercyjnie dostępnych w różnych serotypach AAV z ośrodków rdzenia wektorowego, takich jak University of Pennsylvania (http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore) lub University of North Carolina w Chapel Hill (http://genetherapy.unc.edu). Jedną z wad technologii AAV jest ograniczona pojemność opakowania (~4,7 kb), co nakłada ograniczenie na rozmiar kasety transgenowej, która może być wykorzystana do celowania specyficznego dla komórki. Alternatywnie, wektory lentiwirusowe, które mają większą pojemność pakowania, są w stanie pomieścić celowanie w opsynę pod kontrolą większych sekwencji promotorowych.
Zastosowanie optrody pozwala na niezawodną detekcję sygnałów elektrofizjologicznych w połączeniu z czasowo precyzyjnym dostarczaniem światła. Jak opisano powyżej, jednak przy jego budowie potrzebna jest odpowiednia ostrożność. Ponieważ rozszczepione włókno światłowodowe jest delikatne, zbyt mocne zawiązanie nici szwu może spowodować pęknięcie włókna. Mimo że optroda może być używana do wielu nagrań, elektroda i światłowód powinny być oczyszczone (lub ręcznie rozcięte w przypadku gołego końca światłowodu) przed włożeniem, ponieważ impedancja elektrody i jakość dostarczanego światła ulegną pogorszeniu przy wielokrotnym użyciu.
Podczas zapisów elektrofizjologicznych ważne jest, aby optroda była wysuwana powoli. Zastosowana tu optroda ma grubość około 350 μm (elektroda wolframowa: 125 μm; rdzeń światłowodu: 200 μm) i jej szybkie obniżenie mogłoby doprowadzić do przemieszczenia się tkanki mózgowej. Artefakty wywołane światłem mogą być również brane pod uwagę przy szczególnych ustawieniach nagrywania i dostarczania światła 11-12. Chociaż nie znaleźliśmy żadnego artefaktu wywołanego światłem w naszych warunkach eksperymentalnych, nagrania poza transdukowanym obszarem mózgu mogą być potencjalnie wykorzystane jako kontrola artefaktów świetlnych. Kolejną kwestią braną pod uwagę podczas procesu nagrywania jest wymagane natężenie światła do obserwacji zmian w neuronach wyrażających ekspresję ChR2 lub NpHR, szczególnie w przypadku długotrwałych nagrań. Silne natężenie lasera i długie oświetlenie laserowe mogą spowodować uszkodzenie tkanek i/lub zmniejszoną reakcję na kolejne dostarczone światło 12-13. Do eksperymentów behawioralnych wymagane jest użycie kontrolnego wektora wirusowego w celu wyeliminowania jakiegokolwiek efektu spowodowanego ciepłem dostarczanym z włókna. Dla wielu dostępnych na rynku konstruktów optogenetycznych istnieją komplementarne konstrukty kontrolne, w których sekwencja genu opsyny została usunięta.
Należy zauważyć, że zmodyfikowane warianty ChR2 o ulepszonych właściwościach i kinetyce zostały opracowane wraz z innymi opsynami wyciszającymi, które mogą być lepiej dopasowane do niektórych pytań eksperymentalnych 14-15. Na przykład nowy wariant ChR2 powstały w wyniku ukierunkowanej mutagenezy, określany jako "ChETA", może napędzać skoki neuronów o wysokiej wierności przy częstotliwościach (do co najmniej 200 Hz) wyższych niż oryginalny ChR2 14.
Połączenie dostarczania światła in vivo i jednoczesnego rejestrowania odpowiedzi neuronalnych jest kluczowym krokiem w ustaleniu związków przyczynowych między wzorcową aktywnością w genetycznie ukierunkowanych populacjach komórek a odpowiadającymi im zdarzeniami behawioralnymi zablokowanymi w czasie. Przedstawione tutaj procedury i sprzęt zapewniają proste podejście do wdrażania optogenetyki do nagrań in vivo z utrwaloną głową u gryzoni.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Institute on Drug Abuse (NIDA) grant R01 DA24040 (DCC), University of Colorado Innovative Seed Grant (DCC) oraz grant szkoleniowy NIDA T32 DA017637 (MVB).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Strzykawka | Hamilton | 7653-01 | 10 μ l |
| Wyjmowana igła | Hamilton | 7803-03 | 31 gauge, skośna końcówka |
| Pompa mikrowtryskiwacza | World Precision Instruments | UMP3 | |
| Sterownik pompy | Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| Olej silikonowy | Alfa Aesar | A12728 | |
| Laserowe okulary ochronne | Kentek | KMT-4501 | |
| Światłowód wielomodowy | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μ rdzeń o średnicy m, narzędzie do usuwania włókien 0,37 NA |
| Thorlabs | T12S21 | dla 200 μ m średnica rdzenia wielomodowego światłowodu | |
| Miernik mocy optycznej | Lumiphy LLC | a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com | |
| Fotodetektor | Newport | 818-SL/DB | |
| Niebieski laser (445-473 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com | sprzężony z 200 μ m światłowód wielomodowy z adapterem FC/PC |
| Green Laser (532 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com | sprzężony z 200 μ m światłowód wielomodowy z adapterem FC/PC |
| Tungsten/Fiber Optrode | Lumiphy LLC | a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com | Lumitrode |
| Szklana rurka kapilarna | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Hydrauliczny mikromanipulator | Narishige | MO-22 | |
| Wzmacniacz | Kation Scientific | ExAmp-20K | |
| Data Acquistion Device | National Instruments | NI USB-6009 | |
| Zagłówek gryzoni do nagrywania | Lumiphy LLC | a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com | |
| Jednostka stereotaktyczna dla małych zwierząt | David Kopf Instruments | Model 963 |
Bibliografia
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), e299(2007).
- Zhang, F., Wang, L. P., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
- Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).
- Zhao, S., Ting, J. T., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing. Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).
- Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, eg Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system. Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).
- McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS. Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).
- Cardin, J. A., Carlen, M., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).
- Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
- Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
- Chow, B. Y., Han, X., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).
Przedruki i uprawnienia
