Artykuł metodologiczny

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

DOI:

10.3791/50291

⸱

2 września 2013

 ,  , 
1Institute for Behavioral Genetics, University of Colorado Boulder, 2Department of Psychology and Neuroscience, University of Colorado Boulder

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody optogenetyczne okazały się potężnym narzędziem do wyjaśniania aktywności obwodów neuronalnych leżących u podstaw różnorodnych zachowań u szerokiego zakresu gatunków. Narzędzia optogenetyczne pochodzenia mikrobiologicznego składają się z wrażliwych na światło białek błonowych, które są w stanie aktywować (np. rodopsyna kanałowa-2, ChR2) lub wyciszać (np. halorodopsyna, NpHR) aktywność neuronalną zdefiniowanych ingentynkowo typów komórek w behawioralnie istotnych skalach czasowych. Najpierw demonstrujemy proste podejście do dostarczania transgenów ChR2 i NpHR za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem do grzbietowego subiculum i regionu przedlimbicznego kory przedczołowej u szczurów. Ponieważ ChR2 i NpHR są genetycznie celowane, opisujemy zastosowanie tej technologii do kontrolowania aktywności elektrycznej określonych populacji neuronów (tj. neuronów piramidowych) osadzonych w heterogenicznej tkance z dużą precyzją czasową. Opisujemy tutaj sprzęt, niestandardowy interfejs użytkownika oprogramowania i procedury, które pozwalają na jednoczesne dostarczanie światła i zapis elektryczny z transdukowanych neuronów piramidowych w znieczulonym preparacie in vivo. Te reagujące na światło narzędzia dają możliwość zidentyfikowania przyczynowego wkładu różnych typów komórek w przetwarzanie informacji i zachowanie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do aktywacji lub wyciszenia określonego typu komórki w obwodzie neuronalnym w sposób czasowo precyzyjny jest kluczowa dla zrozumienia, jak obwody neuronowe przetwarzają różne rodzaje informacji leżących u podstaw emocji i poznania. Eksperymentalna kontrola nad nienaruszoną aktywnością neuronalną wykorzystuje narzędzia do utraty / wzmocnienia funkcji (np. stymulacji elektrycznej, modulacji farmakologicznej, uszkodzenia), które nie zapewniają selektywnie wymaganych do kontrolowania określonych populacji neuronów, zarówno w skali czasowej, jak i przestrzennej. Bezpośrednio odpowiadając na te wyzwania technologiczne, opracowanie i zastosowanie genetycznie kodowalnych narzędzi światłoczułych umożliwiło neuronaukowcom kontrolowanie aktywności elektrycznej wybranych typów komórek podczas dobrze zdefiniowanych zdarzeń behawioralnych. Wiele z tych wrażliwych na światło białek jest pochodzenia mikrobiologicznego, z bramkowanym światłem kanałem kationowym, rodopsyną kanałową-2 (ChR2) 1 i napędzaną światłem pompą chlorkową, halorodopsyną (NpHR) 2,3, w powszechnym użyciu.

Główną zaletą optogenetyki jest możliwość genetycznego celowania w określone populacje komórek w heterogenicznych regionach mózgu, a technika ta została z powodzeniem zastosowana do wielu organizmów modelowych (od bezkręgowców po naczelne inne niż ludzie) 4-6. Wyhodowano wiele optogenetycznych zwierząt transgenicznych, które są dostępne na rynku 7,8, jednak tworzenie linii transgenicznych może być pracochłonne i kosztowne. Tutaj opisujemy protokół dostarczania genów ChR2 i NpHR za pośrednictwem wirusa pod promotorem CaMKIIα w korze przedlimbicznej szczura i podbrzuszu grzbietowym przy użyciu wektora rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (AAV). W obrębie przodomózgowia ekspresja CaMKIIα występuje wyłącznie w neuronach piramidowych glutaminergicznych 9. AAV jest powszechnie stosowany do badań podstawowych ze względu na jego względną łatwość produkcji i brak patogenności, a także silną i trwałą ekspresję transgenu, którą osiągnięto za pomocą tych wektorów 10. Dodatkowo przedstawiamy kroki i sprzęt do jednoczesnego dostarczania i nagrywania światła u znieczulonych szczurów z mocowaną głową.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przechowywanie i przygotowanie wirusów

  1. Stosowanie niekompetentnych do replikacji wektorów AAV do dostarczania genów opsyny do mózgu gryzoni jest zatwierdzone do poziomu bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL-1) i wymaga odpowiednich procedur ochrony i obchodzenia się, zgodnie z publikacją rządu USA, Biosafety in Microbiology and Biomedical Laboratories, dostępną na stronie internetowej Centers for Disease Control pod adresem (http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm).
  2. Aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, należy pipetować wirusa z fiolki producenta do mniejszych porcji roboczych w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
  3. Przed wstrzyknięciem stereotaktycznym należy odczekać, aż podwielokrotność rozmrozi się na lodzie, a następnie krótko odwirować za pomocą wirówki stołowej.
  4. Powoli napełnij szklaną strzykawkę i igłę Hamiltona niewielką ilością silikonu lub oleju mineralnego. Upewnij się, że w cylindrze strzykawki nie ma widocznych pęcherzyków powietrza. Włożyć strzykawkę do pompy mikroiniekcyjnej i przymocować pompkę bezpośrednio do pionowego ramienia stereotaktycznego (tj. manipulatora stereotaktycznego).
  5. Opuścić ramię stereotaktyczne, aż końcówka igły dotknie dna probówki z podwielokrotnym wirusem. Użyj sterownika pompy mikrowtryskiwacza, aby pobrać żądaną objętość wirusa (1,5 μl dla wstrzyknięcia 1 μl).
  6. Wszystkie materiały i powierzchnie, które mają kontakt z wirusem, należy odkazić środkiem dezynfekującym, takim jak wybielacz chlorowy (10%).

2. Chirurgia i wstrzyknięcie wirusa

  1. Znieczulić zwierzę koktajlem ketaminy (szczur; 125 mg/kg, i.p.) - ksylazyna (szczur; 10 mg/kg, i.p.). Aby ocenić skuteczność znieczulenia, sprawdź odruchową reakcję na uszczypnięcie palca u nogi i w razie potrzeby podaj dodatkowe dawki ketaminy. Stosując standardowe aseptyczne metody chirurgiczne, umieść zwierzę w aparacie stereotaktycznym (David Kopf Instruments).
  2. Wykonaj nacięcie w linii środkowej przez skórę na szczycie czaszki zwierzęcia za pomocą małych nożyczek chirurgicznych lub skalpela. Delikatnie oddziel tkankę łączną i oczyść górną część czaszki małym skrobakiem do kości.
  3. Sprawdź, czy głowa zwierzęcia jest wypoziomowana w taki sposób, aby współrzędne z dla bregma i lambda były równe. Określ współrzędne stereotaktyczne dla docelowego obszaru mózgu z atlasu mózgu, takiego jak The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (George Paxinos i Charles Watson, Academic Press, 2007) lub The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates (Keith B.J. Franklin i George Paxinos, Academic Press, 2007). Zaznaczyć zamierzone miejsce wstrzyknięcia pisakiem chirurgicznym.
  4. Ostrożnie rozrzedź czaszkę nad obszarem docelowym za pomocą ręcznego wiertła i zatrzymaj się, gdy wiertło dotrze do dna czaszki. Za pomocą pary bardzo cienkich kleszczy usuń przerzedzoną kość, aby odsłonić oponę twardą.
  5. Umieść igłę strzykawki nad obszarem docelowym i opuść igłę, aż dotknie opony twardej i użyj tego punktu do obliczenia współrzędnej z. Bardzo powoli należy opuścić igłę do wstrzykiwania do mózgu, aż do osiągnięcia właściwej pozycji z. W tym protokole obszar przedlimbiczny przyśrodkowej kory przedczołowej (2,7 mm przed bregmą, ± 0,5 mm bocznie do linii środkowej i -2,2 mm od opony twardej) lub grzbietowy subiculum (-6,0 mm przed bregmą, ± 3,0 mm bocznie do linii środkowej i -2,0 mm od opony twardej) jest ukierunkowany na dorosłego samca szczura Sprague Dawley (ok. 275 g).
  6. Wstrzyknąć wirusa z szybkością 0,1 μl/min. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać 10 minut przed wyjęciem igły, aby uniknąć cofania się wirusa na powierzchnię mózgu.
  7. Użyj szwu do szycia z dołączoną igłą, aby uszczelnić skórę i nałożyć antybiotyki na ranę.
  8. Przebieg czasowy ekspresji funkcjonalnej ChR2 i NpHR z wektorów AAV będzie się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego i miana wirusa. W tym eksperymencie nagrania in vivo wykonano 18-21 dni po wstrzyknięciu.

3. Dostarczanie światła i rejestracja in vivo neuronów eksprymujących ChR2 lub NpHR

  1. Podłącz elektrodę wolframową (~1-1,5 MΩ, MicroProbes) do szklanej rurki kapilarnej (Fisher Scientific) za pomocą super kleju.
  2. Użyj narzędzia do zdejmowania izolacji ze światłowodów (Thorlabs), aby odsłonić goły koniec światłowodu wielomodowego (rdzeń o średnicy 200 μm, Thorlabs) i wyczyść końcówkę światłowodu etanolem. Bardzo delikatnie naciąć końcówkę włókna diamentowym nożem w kształcie klina (Thorlabs) i ostrożnie usunąć nadmiar włókna (np. drobnymi kleszkami). Włókno powinno łatwo się rozszczepiać przy nacięciu.
  3. Podłącz końcówkę FC światłowodu do złącza PC na porcie wyjściowym lasera z pojedynczą diodą o mocy 200 mW (www.Lumiphy.com) o żądanej długości fali. Upewnij się, że podczas pracy z laserami zawsze noszone są odpowiednie okulary ochronne.
  4. Zmierz intensywność lasera na końcówce światłowodu za pomocą miernika mocy optycznej (www.Lumiphy.com ). W przypadku nagrań in vivo natężenie światła wynoszące zaledwie 20-100 mW/mm2 może niezawodnie wywołać odpowiednio aktywację lub wyciszenie aktywności neuronalnej za pośrednictwem ChR2 lub NpHR.
  5. Włóż światłowód do rurki kapilarnej. Umieść końcówkę włókna około 500 μm nad końcówką elektrody wolframowej i zawiąż cienką nić szwu dwukrotnie w kilku punktach w pobliżu końcówki, tak aby elektroda i włókno były proste. Upewnij się, że odległość między końcówką elektrody a najbliższym węzłem jest wystarczająco duża, aby można było wprowadzić ją do obszaru docelowego.
  6. Przygotuj zwierzę jak w krokach 2.1 i 2.2 powyżej. Użyj początkowej kraniotomii jako przewodnika, aby stworzyć nowe, czyste małe okienko w czaszce do pozycjonowania optrody (www.Lumiphy.com ). Wykonaj małe nacięcie na oponie twardej za pomocą cienkiej igły.
  7. Ostrożnie opuść optrodę przez okienko czaszki i do mózgu do transdukowanego obszaru za pomocą mikromanipulatora (Narishige). Następnie powoli przesuwaj optrodę w krokach co 10-50 μm, aż do pojawienia się ogniwa reagującego na światło.
  8. Niestandardowy interfejs użytkownika oprogramowania (NeuroLux Pro www.Lumiphy.com) napisany w LabVIEW (National Instruments) służy do sterowania laserem z pojedynczą diodą oraz do wizualizacji i rejestrowania bieżącej aktywności neuronalnej. Nagrane sygnały są przechwytywane za pomocą wzmacniacza ExAmp-20K (Kation Scientific) z filtrem pasmowo-przepustowym (0,3-8 kHz) oraz karty analogowo-cyfrowej National Instruments (NI USB-6009). Interfejs użytkownika NeuroLux Pro umożliwia wybór wejść analogowych (wybierz dwa kanały dla sygnału neuronalnego i TTL) oraz wyjścia cyfrowego. Użytkownik może zdefiniować częstotliwość próbkowania (20 kHz), okres linii bazowej (przed oświetleniem) i okres po świetle. Użytkownik może zdefiniować szerokość, częstotliwość i okres stymulacji laserowej TTL (jeśli częstotliwość wynosi 20 Hz, a okres stymulacji wynosi 500 ms, dostarczanych jest 10 impulsów laserowych o zdefiniowanej szerokości impulsu). Użytkownik może również wybrać ciągły dopływ światła (np. Rysunek 1). W przypadku powtarzających się nagrań użytkownik może również zdefiniować liczbę ciągów impulsów i odstęp między pociągami. Dane można pobierać z nagrywaniem na dysk lub bez niego.
  9. Po nagraniu zwierzęta są znieczulane koktajlem ketaminy/ksylazyny i perfundowane przezsercowo solą fizjologiczną i paraformaldehydem (4%) w celu sprawdzenia umiejscowienia optrody i ekspresji opsyny.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia zrzut ekranu dostosowanego oprogramowania (NeuroLux Pro) opracowanego w środowisku LabVIEW (National Instruments) używanego do jednoczesnego rejestrowania aktywności neuronalnej i kontrolowania parametrów impulsów świetlnych (tj. częstotliwości impulsów, szerokości impulsów, okresu stymulacji). Program wysyła sygnał poleceń do cyfrowego urządzenia akwizycyjnego, które generuje impulsy TTL w celu sterowania laserem z pojedynczą diodą. Dodatkowo program wyświetla i przechowuje zarejestrowaną aktywność neuronalną i dostarczone sygnały TTL. Sygnały te są digitalizowane przez urządzenie akwizycyjne z określoną częstotliwością próbkowania (np. 20 kHz). Zarejestrowane sygnały są zapisywane jako dwuwymiarowa tablica o podwójnej precyzji w pliku binarnym.

Rysunek 2 pokazuje niestandardową optrodę składającą się z elektrody wolframowej podłączonej do światłowodu. Światłowód jest przymocowany do elektrody za pomocą cienkiej nici szwu w trzech punktach. W razie potrzeby do ich przyklejenia można użyć super kleju. Należy jednak unikać trwałego mocowania światłowodu do elektrody, ponieważ chociaż elektroda może być kilkakrotnie ponownie użyta, transmisja światła przez światłowód ulegnie degradacji przy wielokrotnym użyciu i powinna być rozszczepiana i czyszczona lub wymieniana przy każdym wstawieniu do mózgu.

Lewy panel Rysunku 3 pokazuje fluorescencyjne obrazy wzmocnionego białka żółtej fluorescencji, wskazując na rzeczywistą ekspresję ChR2 i NpHR. Zdjęcia te pokazują reprezentatywną ekspresję NpHR w podbrzuszu grzbietowym szczura (ryc. 3A) i ekspresję ChR2 w korze przedlimbicznej (ryc. 3B). Ekspresja wirusa ograniczała się głównie do grzbietowego subiculum i kory przedlimbicznej (np. zaobserwowano pewną fluorescencję w zakręcie zębatym (ryc. 3A, po lewej)). Zaobserwowano również ślady elektrody (cienka ścieżka, grot strzały) i światłowodu (gruba ścieżka, strzałka).

Lewy panel rysunku 4 pokazuje, że ChR2 wywołał czasowo precyzyjne skoki w korze przedlimbicznej szczura. Rycina 4A jest przykładowym śladem potencjałów czynnościowych wyzwalanych przez ChR2 w odpowiedzi na dostarczanie impulsów niebieskiego światła o częstotliwości 20 ms o długości 10 ms do kory przedlimbicznej szczura. Wykres rastrowy (Rysunek 4B) pokazuje indukowaną przez ChR2 aktywację w sześciu reprezentatywnych neuronach. Wszystkie zarejestrowane neurony wykazywały impulsy wywołane światłem z doskonałą wiernością. W przeciwieństwie do ChR2, NpHR szybko i odwracalnie wyciszył spontaniczną aktywność in vivo w korze przedlimbicznej szczura (prawy panel ryc. 4). Rysunek 4C jest przykładowym śladem pokazującym, że ciągłe oświetlenie kory przedlimbicznej wyrażające NpHR o długości fali 532 nm (10 s) pod promotorem CaMKllα eliminuje spontaniczną aktywność pojedynczej jednostki in vivo. Należy zauważyć, że całkowite wyciszenie aktywności przedlimbicznej komórki piramidowej jest ograniczone czasowo do 10-sekundowego ciągłego dostarczania światła. Dolny wykres rastrowy (ryc. 4D) pokazuje wyciszenie wywołane przez NpHR w sześciu reprezentatywnych neuronach. Oba zapisy in vivo są typowe dla tych uzyskanych od dorosłych szczurów Sprague-Dawley, u których dostarczenie genów opsyny drobnoustrojów za pośrednictwem AAV miało miejsce 18-21 dni wcześniej.

Rysunek 5 pokazuje wynik wielokrotnej stymulacji ChR2 szczurzego przedlimbicznego neuronu piramidowego. Impuls światła niebieskiego (10 ms) był dostarczany z częstotliwością 20 Hz przez 5 sekund (łącznie 100 impulsów). Ślady napięcia wywołanego światłem były wielokrotnie rejestrowane co 2 minuty podczas 2-godzinnej sesji nagraniowej (łącznie 61 powtórzeń). Nawet przy użyciu tego powtarzalnego protokołu stymulacji, ChR2 indukował stabilne i silne skoki w odpowiedzi na dostarczanie światła.

Rysunki 6 i 7 pokazują wyniki indukowanego przez NpHR fotoinhibicji i fotoaktywacji aktywności neuronów podwyspowych szczurów za pomocą ChR2. Podobnie jak w przypadku kory przedlimbicznej, NpHR i ChR2 były w stanie pośredniczyć w indukowanym światłem hamowaniu i aktywacji neuronów podwyspowych transdukowanych przez opsynę z wysoką odtwarzalnością.

figure-results-1
Rysunek 1. Zrzut ekranu interfejsu oprogramowania NeuroLux Pro do jednoczesnego dostarczania światła i rejestracji elektrofizjologicznej. Pokazany ślad pokazuje wywołane przez NpHR wyciszenie spontanicznej aktywności przedlimbicznej komórki piramidowej szczura w odpowiedzi na 10 sekund ciągłego dostarczania światła o długości fali 532 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

figure-results-2
Rysunek 2. Obraz o dużej mocy niestandardowej optrody. Światłowód jest wprowadzany do szklanej rurki kapilarnej przymocowanej do elektrody wolframowej i przymocowanej do elektrody za pomocą nici do szwu. Odległość od środka do środka między końcówką elektrody a końcówką z włókna wynosi około 500 μm.

figure-results-3
Rysunek 3. Ekspresja wirusa i umieszczenie optrody. (Po lewej) Fotografie pokazują reprezentatywną ekspresję NpHR w podbrzuszu grzbietowym (A) i ekspresję ChR2 w korze przedlimbicznej (B). (Po prawej) Schemat przedstawiający miejsce, w którym zostało wykonane każde zdjęcie. Grot strzałki i strzałka na każdym zdjęciu wskazują położenie odpowiednio elektrody wolframowej i światłowodu. SUB: subiculum, DG: zakręt zębaty, PL: kora przedlimbiczna. Kliknij tutaj, aby powiększyć rysunek.

figure-results-4
Rysunek 4. Zapisy elektrofizjologiczne in vivo z kory przedlimbicznej szczura transdukowanej ChR2 lub NpHR. (A) Przykładowy ślad potencjałów czynnościowych wyzwalanych przez ChR2 w odpowiedzi na dostarczenie impulsów światła niebieskiego (473 nm) o częstotliwości 20 Hz (10 ms, niebieski pasek). (B) Wykres rastrowy pokazujący indukowany przez ChR2 skok w sześciu reprezentatywnych neuronach. Każda aktywność jednostki jest wykreślana jako kropka. (C) Przykładowy ślad wywołanego przez NpHR tłumienia spontanicznej aktywności podczas ciągłego zielonego (532 nm) oświetlenia światłem (10 sekund, zielony pasek). (D) Wykres rastrowy pokazujący wyciszenie wywołane przez NpHR w sześciu reprezentatywnych neuronach. Każda aktywność jednostki jest wykreślana jako kropka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

figure-results-5
Rysunek 5. Powtarzające się pobudzanie 20 Hz ChR2 w przedlimbicznym neuronie piramidowym szczura in vivo. (A) Ślady napięcia wywołanego światłem impulsowym uzyskane w punktach czasowych 0, 30, 60, 90, 120 min po rozpoczęciu zapisów. (B) Wykres rastrowy przedstawiający wszystkie 61 powtórzeń (2 minuty interwału między próbami, łącznie 120 minut) aktywacji wywołanej światłem. Każda aktywność jednostki jest wykreślana jako kropka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

figure-results-6
Rysunek 6. Zapisy elektrofizjologiczne in vivo z subiculum grzbietowego szczura transdukowanego NpHR. (A) Przykładowy ślad pokazujący, że 10-sekundowe ciągłe oświetlenie 532 nm (zielony pasek) grzbietowego subiculum wyrażającego NpHR eliminuje spontaniczną aktywność. (B) Średnie przebiegi dwóch zarejestrowanych jednostek z powyższej trasy. Próg amplitudy został wykorzystany do identyfikacji dwóch odrębnych neuronów. (C) Wykres rastrowy pokazujący pięć powtórzeń indukowanego przez NpHR wyciszania tych jednostek. Każda aktywność jednostki jest wykreślana jako kropka.

figure-results-7
Rysunek 7. Powtarzające się pobudzanie CR2 o częstotliwości 20 Hz w grzbietowym neuronie podkostnym szczura in vivo. (A) Ślady napięcia wywołanego światłem impulsowym uzyskane w punktach czasowych 0, 30, 60, 90, 120 min po rozpoczęciu zapisów. Wstawka: typowa aktywność pękania tej komórki. (B) Wykres rastrowy przedstawiający wszystkie 61 powtórzeń (2 minuty interwału między próbami, łącznie 120 minut) aktywacji wywołanej światłem. Każda aktywność jednostki jest wykreślana jako kropka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostępny jest szeroki wachlarz technik genetycznego ukierunkowania genów opsyny drobnoustrojów na odrębne regiony mózgu u gryzoni. Dostarczanie genów wirusowych zapewnia stosunkowo niedrogie i szybkie podejście do pośredniczenia w ekspresji ChR2 i NpHR ze specyficznością dla typu komórki. Systemy wektorów AAV są częstym wyborem do stosowania w eksperymentach optogenetycznych ze względu na wysokie miana produkcyjne, które pozostają stabilne podczas przechowywania, brak patogenności i zdolność do wytwarzania długotrwałej ekspresji genów 10. Wiele konstruktów opsyny z promotorami specyficznymi dla typu komórki jest komercyjnie dostępnych w różnych serotypach AAV z ośrodków rdzenia wektorowego, takich jak University of Pennsylvania (http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore) lub University of North Carolina w Chapel Hill (http://genetherapy.unc.edu). Jedną z wad technologii AAV jest ograniczona pojemność opakowania (~4,7 kb), co nakłada ograniczenie na rozmiar kasety transgenowej, która może być wykorzystana do celowania specyficznego dla komórki. Alternatywnie, wektory lentiwirusowe, które mają większą pojemność pakowania, są w stanie pomieścić celowanie w opsynę pod kontrolą większych sekwencji promotorowych.

Zastosowanie optrody pozwala na niezawodną detekcję sygnałów elektrofizjologicznych w połączeniu z czasowo precyzyjnym dostarczaniem światła. Jak opisano powyżej, jednak przy jego budowie potrzebna jest odpowiednia ostrożność. Ponieważ rozszczepione włókno światłowodowe jest delikatne, zbyt mocne zawiązanie nici szwu może spowodować pęknięcie włókna. Mimo że optroda może być używana do wielu nagrań, elektroda i światłowód powinny być oczyszczone (lub ręcznie rozcięte w przypadku gołego końca światłowodu) przed włożeniem, ponieważ impedancja elektrody i jakość dostarczanego światła ulegną pogorszeniu przy wielokrotnym użyciu.

Podczas zapisów elektrofizjologicznych ważne jest, aby optroda była wysuwana powoli. Zastosowana tu optroda ma grubość około 350 μm (elektroda wolframowa: 125 μm; rdzeń światłowodu: 200 μm) i jej szybkie obniżenie mogłoby doprowadzić do przemieszczenia się tkanki mózgowej. Artefakty wywołane światłem mogą być również brane pod uwagę przy szczególnych ustawieniach nagrywania i dostarczania światła 11-12. Chociaż nie znaleźliśmy żadnego artefaktu wywołanego światłem w naszych warunkach eksperymentalnych, nagrania poza transdukowanym obszarem mózgu mogą być potencjalnie wykorzystane jako kontrola artefaktów świetlnych. Kolejną kwestią braną pod uwagę podczas procesu nagrywania jest wymagane natężenie światła do obserwacji zmian w neuronach wyrażających ekspresję ChR2 lub NpHR, szczególnie w przypadku długotrwałych nagrań. Silne natężenie lasera i długie oświetlenie laserowe mogą spowodować uszkodzenie tkanek i/lub zmniejszoną reakcję na kolejne dostarczone światło 12-13. Do eksperymentów behawioralnych wymagane jest użycie kontrolnego wektora wirusowego w celu wyeliminowania jakiegokolwiek efektu spowodowanego ciepłem dostarczanym z włókna. Dla wielu dostępnych na rynku konstruktów optogenetycznych istnieją komplementarne konstrukty kontrolne, w których sekwencja genu opsyny została usunięta.

Należy zauważyć, że zmodyfikowane warianty ChR2 o ulepszonych właściwościach i kinetyce zostały opracowane wraz z innymi opsynami wyciszającymi, które mogą być lepiej dopasowane do niektórych pytań eksperymentalnych 14-15. Na przykład nowy wariant ChR2 powstały w wyniku ukierunkowanej mutagenezy, określany jako "ChETA", może napędzać skoki neuronów o wysokiej wierności przy częstotliwościach (do co najmniej 200 Hz) wyższych niż oryginalny ChR2 14.

Połączenie dostarczania światła in vivo i jednoczesnego rejestrowania odpowiedzi neuronalnych jest kluczowym krokiem w ustaleniu związków przyczynowych między wzorcową aktywnością w genetycznie ukierunkowanych populacjach komórek a odpowiadającymi im zdarzeniami behawioralnymi zablokowanymi w czasie. Przedstawione tutaj procedury i sprzęt zapewniają proste podejście do wdrażania optogenetyki do nagrań in vivo z utrwaloną głową u gryzoni.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institute on Drug Abuse (NIDA) grant R01 DA24040 (DCC), University of Colorado Innovative Seed Grant (DCC) oraz grant szkoleniowy NIDA T32 DA017637 (MVB).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka Hamilton7653-0110 μ l
Wyjmowana igłaHamilton7803-0331 gauge, skośna końcówka
Pompa mikrowtryskiwaczaWorld Precision InstrumentsUMP3
Sterownik pompyPrecision InstrumentsSYS-MICRO4
Olej silikonowyAlfa AesarA12728
Laserowe okulary ochronneKentekKMT-4501
Światłowód wielomodowyThorlabsBFL37-200200 μ rdzeń o średnicy m, narzędzie do usuwania włókien 0,37 NA
ThorlabsT12S21dla 200 μ m średnica rdzenia wielomodowego światłowodu
Miernik mocy optycznejLumiphy LLCa href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com
FotodetektorNewport818-SL/DB
Niebieski laser (445-473 nm, 100-200 mW)Lumiphy LLCa href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com sprzężony z 200 μ m światłowód wielomodowy z adapterem FC/PC
Green Laser (532 nm, 100-200 mW)Lumiphy LLCa href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.comsprzężony z 200 μ m światłowód wielomodowy z adapterem FC/PC
Tungsten/Fiber OptrodeLumiphy LLCa href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.comLumitrode
Szklana rurka kapilarnaFisher Scientific22-362-566
Hydrauliczny mikromanipulatorNarishigeMO-22
WzmacniaczKation ScientificExAmp-20K
Data Acquistion DeviceNational InstrumentsNI USB-6009
Zagłówek gryzoni do nagrywaniaLumiphy LLCa href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com
Jednostka stereotaktyczna dla małych zwierzątDavid Kopf InstrumentsModel 963
World <<<<<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  2. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), e299(2007).
  3. Zhang, F., Wang, L. P., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  4. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  5. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  6. Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).
  7. Zhao, S., Ting, J. T., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  8. Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing. Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).
  9. Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, eg Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system. Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).
  10. McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS. Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).
  11. Cardin, J. A., Carlen, M., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
  12. Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).
  13. Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
  14. Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
  15. Chow, B. Y., Han, X., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kanalrhodopsyna 2halorodopsynadostarczanie za pomoc wektor w wirusowychwstrzykiwanie stereotaktyczneelektroda wiat owodowajednoczesny pomiarelektrofizjologia in vivodostarczanie wiat a

Powiązane artykuły