Obecność stabilnych mikroRNA (miRNA) w egzosomach wzbudziła ogromne zainteresowanie jako nowy sposób komunikacji międzykomórkowej, ze względu na ich potencjalną użyteczność jako biomarkery i jako droga do interwencji terapeutycznej. Tutaj demonstrujemy oczyszczanie egzosomów z krwi i pożywek hodowlanych, a następnie ilościowy PCR w celu identyfikacji transportowanych miRNA.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Oczyszczanie i profilowanie mikroRNA egzosomów pochodzących z krwi i pożywek hodowlanych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Stabilne miRNA są obecne we wszystkich płynach ustrojowych, a niektóre krążące miRNA są chronione przed degradacją przez sekwestrację w małych pęcherzykach zwanych egzosomami. Egzosomy mogą łączyć się z błoną plazmatyczną, powodując transfer RNA i białek do komórki docelowej. Ich funkcje biologiczne obejmują odpowiedź immunologiczną, prezentację antygenu i komunikację wewnątrzkomórkową. Dostarczanie miRNA, które mogą regulować ekspresję genów w komórkach biorcy za pośrednictwem krwi, otworzyło nowe możliwości interwencji celowej. Oprócz oferowania strategii dostarczania leków lub środków terapeutycznych RNA, zawartość egzosomalna może służyć jako biomarkery, które mogą pomóc w diagnozie, określeniu opcji leczenia i rokowaniu.
Tutaj opiszemy procedurę ilościowej analizy miRNA i informacyjnych RNA (mRNA) z egzosomów wydzielanych we krwi i pożywkach do hodowli komórkowych. Oczyszczone egzosomy zostaną scharakteryzowane za pomocą analizy western blot dla markerów egzosomalnych i PCR dla interesujących mRNA. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) i znakowanie immunozłotem zostaną wykorzystane do walidacji morfologii i integralności egzosomalnej. Całkowite RNA zostanie oczyszczone z tych egzosomów, aby zapewnić, że będziemy mogli badać zarówno mRNA, jak i miRNA z tej samej próbki. Po walidacji integralności RNA za pomocą bioanalizatora, przeprowadzimy ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) o średniej przepustowości w celu identyfikacji egzosomalnego miRNA za pomocą kart Taqman Low Density Array (TLDA) i badań ekspresji genów dla interesujących nas transkryptów.
Te protokoły mogą być używane do ilościowego określania zmian w egzosomalnych miRNA u pacjentów, modelach gryzoni i pożywkach do hodowli komórkowych przed i po interwencji farmakologicznej. Zawartość egzosomalna różni się ze względu na źródło pochodzenia i warunki fizjologiczne komórek wydzielających egzosomy. Różnice te mogą dostarczyć informacji na temat tego, jak komórki i systemy radzą sobie ze stresem lub zaburzeniami fizjologicznymi. Nasze reprezentatywne dane pokazują różnice w miRNA obecnych w egzosomach oczyszczonych z krwi myszy, krwi ludzkiej i pożywki do hodowli komórek ludzkich.
Tutaj opiszemy procedurę ilościowej analizy miRNA i informacyjnych RNA (mRNA) z egzosomów wydzielanych we krwi i pożywkach do hodowli komórkowych. Oczyszczone egzosomy zostaną scharakteryzowane za pomocą analizy western blot dla markerów egzosomalnych i PCR dla interesujących mRNA. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) i znakowanie immunozłotem zostaną wykorzystane do walidacji morfologii i integralności egzosomalnej. Całkowite RNA zostanie oczyszczone z tych egzosomów, aby zapewnić, że będziemy mogli badać zarówno mRNA, jak i miRNA z tej samej próbki. Po walidacji integralności RNA za pomocą bioanalizatora, przeprowadzimy ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) o średniej przepustowości w celu identyfikacji egzosomalnego miRNA za pomocą kart Taqman Low Density Array (TLDA) i badań ekspresji genów dla interesujących nas transkryptów.
Te protokoły mogą być używane do ilościowego określania zmian w egzosomalnych miRNA u pacjentów, modelach gryzoni i pożywkach do hodowli komórkowych przed i po interwencji farmakologicznej. Zawartość egzosomalna różni się ze względu na źródło pochodzenia i warunki fizjologiczne komórek wydzielających egzosomy. Różnice te mogą dostarczyć informacji na temat tego, jak komórki i systemy radzą sobie ze stresem lub zaburzeniami fizjologicznymi. Nasze reprezentatywne dane pokazują różnice w miRNA obecnych w egzosomach oczyszczonych z krwi myszy, krwi ludzkiej i pożywek do hodowli komórek ludzkich
Wprowadzenie
Krótkie, niekodujące miRNA modulują ekspresję genów poprzez wiązanie się z docelowym mRNA. Komplementarność sekwencji zasiewu ~7 par zasad umożliwia miRNA wiązanie się z docelowym mRNA, co skutkuje zahamowaniem translacji lub zmniejszeniem stabilności mRNA, co może skutkować zmniejszoną ekspresją białka docelowego 1. Badania przeprowadzone w ciągu ostatniej dekady jednoznacznie dowiodły fundamentalnej roli miRNA w pośredniczeniu w funkcjach komórkowych. Podjęto również znaczne wysiłki w celu zbadania zmian molekularnych za pośrednictwem miRNA leżących u podstaw różnych chorób 2,3. Co więcej, niedawna identyfikacja stabilnych miRNA w płynach ustrojowych 4-6 utorowała drogę do ich wykorzystania jako nowych biomarkerów nadających się do diagnozy klinicznej.
Jednym ze sposobów transportu miRNA w płynach ustrojowych są egzosomy, małe pęcherzyki, które przenoszą mRNA, białka, mediatory lipidowe i miRNA do komórek biorcy poprzez ogólnoustrojowe krążenie krwi 7-14. Powoduje to modulację ekspresji genów w komórkach biorcy i stanowi nowy mechanizm komunikacji komórkowej. Na przykład komórki mogą modulować procesy immunoregulacyjne poprzez wydzielanie i / lub wchłanianie egzosomów zawierających biomolekuły biorące udział w zapaleniu, takie jak interleukina-1β (IL1β), czynnik martwicy nowotworu-α (TNFα), transformujący czynnik wzrostu-β5 (TGFβ5) oraz miRNA, które regulują te geny 13. Ponieważ nieprawidłowa ekspresja miRNA jest powszechną cechą w różnych chorobach człowieka, cząsteczki te oferują nowe, ekscytujące możliwości odkrywania i walidacji nowych celów terapeutycznych 2.
Krążące miRNA są obecne we wszystkich płynach ustrojowych i wiadomo, że skład egzosomów różni się w zależności od komórek źródłowych, z których zostały uwolnione. W ten sposób oferują one możliwość badania stanu fizjologicznego komórek i tego, jak komórki zmieniają zdarzenia sygnalizacyjne w odpowiedzi na stres, w tym choroby. Badanie zmian w składzie egzosomów może dostarczyć informacji na temat transdukcji sygnału i zbadać ich potencjalną przydatność jako biomarkerów lub dróg interwencji terapeutycznej.
Tutaj zademonstrujemy oczyszczanie egzosomów z wielu źródeł na podstawie opublikowanych protokołów. Te egzosomy zostaną wykorzystane do izolacji RNA, a następnie qPCR w celu identyfikacji i pomiaru poziomów miRNA obecnych w egzosomach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty z użyciem próbek krwi od ludzi i gryzoni zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi. Do badania włączono ludzi po wyrażeniu świadomej zgody, zatwierdzonej przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Drexel University College of Medicine, a wszystkie procedury dotyczące badań przeprowadzanych na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt.
1. Oczyszczanie egzosomu z krwi (~5,5 godziny)
PORADY
- Ponownie zawieszamy egzosomy z jednej probówki krwi (~10 ml ludzkiej krwi i ~2 ml krwi myszy) w 300 μl buforze do lizy RNA z zestawu do izolacji miRNA mirVana.
- Aby oczyścić egzosomy z pożywki do hodowli komórkowych, pożywka jest wirowana z prędkością 500 x g przez 10 minut w celu usunięcia komórek, a następnie filtrowana przez filtr 0,22 μm po odwirowaniu przy 12 000 x g. Oczyszczanie egzosomów z pożywki do hodowli komórkowych nie wymaga rozcieńczania w PBS, płukania PBS ani drugiego etapu ultrawirowania.
- Jeśli oczyszczone egzosomy będą używane do badań proteomicznych, dodanie etapu wirowania gradientu sacharozy po etapie ultrawirowania zmniejszy ilość agregatów białkowych i zanieczyszczeń 15.
- Obserwowana morfologia egzosomów może się różnić w zależności od zarówno źródła, jak i etapów przetwarzania TEM. Nie zaobserwowaliśmy morfologii w kształcie miseczki dla egzosomów, która wcześniej była przypisywana różnicom w przetwarzaniu próbek 9,15. Nasze obrazy TEM, w tym znakowanie immunozłotem, są podobne do poprzednich doniesień z różnych źródeł, w tym egzosomów pochodzących z krwi, dróg żółciowych i kory mózgowej 9,16,17.
- Odwróć 5x rurkę pokrytą EDTA zawierającą krew i umieść pionowo w temperaturze pokojowej na 10-60 minut.
- Wirować przy 2 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Zebrać wierzchnią warstwę, osocze, w probówkach o pojemności 15 ml i trzymać na lodzie.
- Rozcieńczyć płyn o równej objętości PBS. Wirować 30 minut przy 2.000 x g w temperaturze 4 °C.
- Przenieść do probówek wirówkowych, dodać 1X PBS do całkowitej objętości 24 ml i odwirować 45 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
- Przenieść do probówek ultrawirówek i odwirować przez 2 godziny przy 110 000 x g w temperaturze 4 °C.
- Zawiesić osad w PBS i odwirować przez 1 godzinę przy 100 000 x g w temperaturze 4 °C.
- Zawiesić osad w odpowiednim buforze (bufor do lizy RNA).
- Zawiesić w buforze PBS lub RIPA odpowiednio do mikroskopii elektronowej i analizy western blot.
2. Oczyszczanie RNA za pomocą zmodyfikowanego zestawu do izolacji miRNA mirVana (~1 godz.)
PORADY
- Przygotuj obszar do izolacji RNA, nosząc środki ochrony osobistej (PPE), przecierając powierzchnie i pipety RNase Zap, oraz używając sterylnych końcówek i probówek filtrujących.
- Chociaż protokół od dostawcy daje możliwość oczyszczenia tylko miRNA, zawsze izolujemy całkowite RNA, w tym mRNA i miRNA, abyśmy mogli badać oba z tej samej próbki.
- Dodanie etapu leczenia DNazy na kolumnie usuwa ślady DNA, które mogą być obecne. W zależności od źródła egzosomów, doniesiono, że DNA jest nieobecne w egzosomach oczyszczonych z niektórych źródeł, w tym mysich i ludzkich linii komórek tucznych 8, ale chromosomalne sekwencje DNA wykryto w egzosomach oczyszczonych z pożywki hodowanych kardiomiocytów 18.
- Zmniejszyliśmy objętość roztworu myjącego 1 do 350 μl (Krok 2.4 poniżej), ponieważ sprzedawca dostarcza tylko tyle roztworu Wash 1 na jedno dodanie 700 μl. Jeśli objętość nie zostanie zmniejszona, nie pozostanie wystarczająca ilość roztworu do wykorzystania całej zawartości zestawu. Pozostałe kroki zostały wykonane zgodnie z zaleceniami producenta.
- Dodać 1/10 objętości dodatku homogenatu miRNA (30 μl) i inkubować na lodzie przez 10 minut.
- Ekstrakt o objętości kwas-fenol:chloroform równej początkowej objętości lizatu. Odwirować i odzyskać górną fazę w świeżej probówce.
- Dodać 1,25 objętości 100% etanolu (375 μl). Wir. Nakładać na wkład filtra i odwirowywać przez 15 sekund przy 10 000 x g.
- Dodać połowę zalecanej objętości roztworu miRNA Wash Solution 1 (350 μl) i odwirować przez 15 sekund przy 10 000 x g.
- Dodać 10 μl DNazy 1 do 70 μl buforu RDD (Qiagen) dla każdej próbki. Dodać 80 μl do kolumny i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodać roztwór płuczący 1 (350 μl) i odwirować przez 15 sekund przy 10 000 x g.
- Dodać roztwór płuczący 2/3 (500 μl) i odwirować przez 15 sekund przy 10 000 x g. POWTÓRZYĆ.
- Eluować za pomocą 40 μl 95 °C, wolnego od nukleazH2O.
- Oznaczyć stężenie RNA i rozcieńczyć RNA do 100 ng/μl.
3. Profilowanie miRNA egzosomów z krwi za pomocą kart TLDA (Taqman Low Density Array) (~6,5 godziny)
PORADY
- Przygotuj obszar do izolacji RNA, nosząc środki ochrony osobistej, przecierając powierzchnie i pipety RNase Zap, oraz używając sterylnych końcówek i probówek filtrujących.
- Etap pre-amplifikacji (pre-amp) jest zalecany dla 1-350 ng RNA (próbki 350-1,000 ng nie wymagają kroku pre-amp po syntezie cDNA). Ważne jest, aby określić, czy przedwzmacniacz jest niezbędny dla Twojej próbki, ponieważ wszystkie próbki muszą być traktowane w równych warunkach. Krok przedwzmacniacza zwiększa koszty, a wartości Ct mają dolną akceptowalną wartość odcięcia (32 zamiast 40).
- Przydatne jest przygotowanie reakcji cDNA w probówkach zamiast na płytce, w zależności od liczby kart, które można uruchomić w ciągu jednego dnia. Zminimalizuje to zamrażanie i rozmrażanie próbek cDNA, które nie zostaną przetworzone tego samego dnia.
- Egzosomy zebrane z różnych źródeł mają różne ilości RNA. Protokół ten pozwala na uzyskanie maksymalnie 3 μl matrycy RNA do reakcji syntezy cDNA. W zależności od źródła, ilość egzosomalnego RNA, którą można wyizolować, może być ograniczona. Podczas gdy typowa tkanka dałaby wystarczającą ilość RNA, aby cDNA zostało zbudowane ze 100 ng RNA w objętości 3 μl, egzosomy z ludzkiej krwi lub pożywki do hodowli komórek ludzkich często zawierają mniej RNA, a cDNA musi być wykonane z mniejszej ilości materiału wyjściowego. Egzosomy krwi myszy zawierają wyższe poziomy RNA i można uzyskać co najmniej 100 ng w 3 μl.
- Aby przygotować cDNA z oczyszczonego RNA przy użyciu starterów odwrotnej transkryptazy Megaplex Pools (grupa A i grupa B zawierają startery dla miRNA na kartach mikroprzepływowych Array A i B), rozmrozić składniki reakcji na lodzie.
- Oznacz dwie probówki o pojemności 1,5 ml bez RNaz do reakcji RT starterami z puli A lub starterami z puli B i dodaj składniki w kolejności wykresu. Dodać co najmniej jedną dodatkową objętość składników na 2 lub więcej reakcji lub przygotować mieszankę wzorcową zgodnie z zaleceniami dostawcy.
| Składnik reakcji RT | Stężenie składników | Objętość dla 1 próbki (całkowita V/próbka = 4,5 μl) |
| Woda wolna od nukleaz | 0,20 μl | |
| Bufor Megaplex RT (10X) | 1X | 0,80 μl |
| dNTP (100 mM) | 4,4 mln | 0,20 μl |
| MgCl2 (25 mM) | 5 mM | 0,90 μl |
| Inhibitor RNazy (20U/μl) | 2 U | 0,10 μl |
| Podkłady Megaplex RT A lub B (10X) | 1X | 0,80 μl |
| Odwrotna transkryptaza MultiScribe | 75 U | 1,50 μl |
- Odwróć probówki 6 razy i krótko odwiruj. Następnie odpipetować 4,5 μl RT mieszać z 8-probówkowymi paskami MicroAmp lub 96-dołkową płytką reakcji optycznej MicroAmp.
- Dodać 100 ng RNA i dostosować objętość do 3 μl za pomocą wody uzdatnionej DEPC lub dodać 3 μl całkowitego RNA, wymieszać końcówką pipety i uszczelnić probówki lub płytkę. Krótko wirować i inkubować na lodzie przez 5 minut.
- Załaduj reakcję do maszyny PCR i uruchom ją w następujących warunkach (zgodnie z zaleceniami protokołu Applied Biosystems Megaplex Pools):
| scena | Najwyższa temp | Godzina |
| Cykl (40x) | 16 °C | Czas trwania: 2 min |
| 42 °C | 1 min | |
| 50 °C | 1 sekund | |
| trzymać | 85 °C | Czas trwania: 5 min |
| trzymać | 4 °C | ∞ |
- Przechowuj cDNA w temperaturze -20 °C (dobre przez co najmniej tydzień) lub kontynuuj etap pre-Amp, który może być przechowywany przez tydzień.
- Rozmrozić startery PreAmp dla puli A i grupy B na lodzie i odwrócić, aby wymieszać. Wiruj miks główny wzmacniacza Taqman Pre-Amp i utrzymuj go również na lodzie.
- Postępuj zgodnie z tabelą, dodając co najmniej jedną dodatkową objętość składników dla 2 lub więcej reakcji lub przygotuj mieszankę wzorcową zgodnie z zaleceniami dostawcy.
| Składnik reakcyjny przedwzmacniacza | Objętość na 1 próbkę |
| Woda wolna od nukleaz | 7,5 μl |
| Taqman PreAmp Master Mix (2X) | 12,5 μl |
| Megaplex PreAmp Primery A lub B (10X) | 2,5 μl |
- Odpipetować 2,5 μl produktu RT do 8-probówek MicroAmp lub 96-dołkowej płytki reakcji optycznej MicroAmp i dozować 22,5 μl mieszanki reakcyjnej PreAmp do każdej studzienki.
- Uszczelnij płytkę, inkubuj na lodzie przez 5 minut, a następnie załaduj próbkę do maszyny do PCR. Uruchom w następujących warunkach.
| scena | Najwyższa temp | Godzina |
| trzymać | 95 °C | Czas trwania: 10 min |
| trzymać | 55 °C | Czas trwania: 2 min |
| trzymać | 72 °C | Czas trwania: 2 min |
| Cykl (12x) | 95 °C | 15 sekund |
| 60 °C | Czas trwania: 4 min | |
| trzymać | 99.9 °C | Czas trwania: 10 min |
| trzymać | 4 °C | ∞ |
- Po zakończeniu reakcji przedwzmacniacza krótko odwirować probówki lub płytkę, a następnie dodać 75 μl 0,1X TE pH 8,0 do każdej studzienki lub probówki.
- Zamknij, wymieszaj i krótko odwiruj. Rozcieńczony produkt należy przechowywać przez tydzień w temperaturze -20 °C lub kontynuować ładowanie płytki.
- Połącz następujące elementy w probówce 1,5 ml na lodzie bez RNaz.
| składnik | Objętość na 1 kartę |
| Taqman Uniwersalny PCR Master Mix, bez AmpErase UNG (2X) | 450 μl |
| Rozcieńczony produkt preAmp | 9 μl |
| Woda wolna od nukleaz | 441 μl |
- Odwróć probówkę, aby wymieszać i krótko odwirować. Dozować 100 μl mieszanki reakcyjnej PCR do każdego portu karty Taqman MicroRNA Array.
- Odwirować kartę 2 x 1 000 x g przez 1 minutę. Zapieczętuj kartę i uruchom ją za pomocą szablonu dostarczonego ze starterami w instrukcji Applied Biosystems i 384-dołkowymi ustawieniami Taqman Low Density Array. Używamy systemu Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR.
4. Analiza mRNA przez Taqmana (~1,5 godziny)
- Aby przygotować reakcję qPCR, należy wymieszać składniki reakcji w kolejności na wykresie. Wszystkie próbki zostaną przeanalizowane za pomocą sond starterowych dla interesującego nas genu, a także 18S rRNA jako genu normalizującego.
| Składnik reakcyjny Taqmana | Objętość na 1 próbkę |
| Woda wolna od nukleaz | 7 μl (dostosować na podstawie pojedynczej próbki) |
| Taqman Fast Master Mix (2X) | 10 μl |
| Sondy Taqman Primer (20x) | 1 μl |
| cDNA ze 100 ng RNA | 2 μl (dostosować na podstawie pojedynczej próbki) |
- Uruchom 96-dołkową płytkę za pomocą szybkiego bloku 96-dołkowego zgodnie z zaleceniami producenta (Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po wyizolowaniu egzosomów z krwi lub pośrodków hodowli komórkowej, czystość egzosomów można sprawdzić za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) i western blot (Rysunki 1A i 1B). Potwierdziliśmy przygotowania egzosomów z różnych źródeł za pomocą EM i western blot, wykorzystując wiele przeciwciał. Rysunek 1A przedstawia obrazy EM potwierdzające, że egzosomy są nienaruszone, mają średnicę ~30 -100 nm i zawierają CD81, co wykazano poprzez znakowanie immunozłotem. Powszechnie s...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym protokole pokazujemy kwantyfikację miRNA i mRNA z egzosomów oczyszczonych przez wirowanie różnicowe z krwi i pożywek hodowlanych. Egzosomy mają różne składniki w zależności od ich pochodzenia i biorą udział w wielu funkcjach biologicznych, w tym w odpowiedzi immunologicznej, prezentacji antygenu, komunikacji wewnątrzkomórkowej oraz transferze RNA i białek 9,11,12,19,20. Podczas gdy rozmiar i kształt jest wyznacznikiem czystości egzosomów, szereg prac przedstawiających dane EM egzosomów wskazuje, że pęche...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez fundusze z grantu Fundacji Rity Allen dla Seena Ajit. Autorzy pragną podziękować Eriki Balogh i dr Soumitrze Ghoshroy z Centrum Mikroskopii Elektronowej Uniwersytetu Południowej Karoliny za korzystanie z instrumentów, pomoc naukową i techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Vacutainer powlekany EDTA (probówki 10 ml) | BD Diagnostics | 366643 | Do oczyszczania egzosomów z ludzkiej krwi |
| Vacutainer powlekany EDTA (probówki 2 ml) | BD Diagnostics | 367841 | Do oczyszczania egzosomów z krwi myszy |
| Probówka RNA krwi PAXgene | Diagnostyka BD 762165 Do | izolacji miRNA z całkowitej krwi | |
| Zestaw do izolacji mikroRNA miRVana | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNaza 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | Do kart TLDA |
| Megaplex RT Zestaw basenu dla gryzoni v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp zestaw basenów dla gryzoni v3.0 | Applied Biosystems | ||
| Zestaw mikroRNA A+B Taqman Array gryzoni V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Zestaw Megaplex RT Human Pool V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Zestaw kart A + B Human MicroRNA Taqman Array v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman Zestaw MicroRNA RT | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman szybka uniwersalna mieszanka główna do PCR | Applied Biosystems | 4366072 | Do mRNA qRT-PCR |
| Czynnik martwicy nowotworu (sonda starterowa) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego A (sonda starterowa) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima Pierwsza nić cDNA Zestaw do syntezy dla RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | Do przeciwciała mRNA |
| HSP70 | Abcam | ab94368 | Do western blot |
| Anty-królik IgG-Gold | Sigma | G7402 | Do mikroskopii elektronowej |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Siatki węglowe o siatce niklu 300 | Mikroskopia elektronowa Nauki | FCF300-Ni | |
| Siatki węglowe miedziane 300 mesh | Mikroskopia elektronowa Nauki | FCF300-Cu | |
| Tabela 1. Tabela konkretnych odczynników. |
Bibliografia
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
- Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148(2008).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282(2011).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).
- Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
- Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22(2006).
- Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
- Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
- Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653(2012).
- Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
- Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
- El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
- Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
- Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. , (2011).
- Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
- Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
