Ocena opróżniania żołądka u nieotyłych myszy z cukrzycą za pomocą testu oddechowego [13C]-oktanowego

Podsumowanie

Oznaczanie opróżniania żołądka za pomocą nieinwazyjnego testu oddechowego [¹³C]-oktanowego do śledzenia gastroparezy u samic myszy NOD LtJ.

Streszczenie

Badania opróżniania żołądka na myszach były ograniczone przez niemożność śledzenia zmian opróżniania żołądka u tego samego zwierzęcia, ponieważ najczęściej stosowane techniki wymagają zabijania zwierząt i pośmiertnego odzyskiwania posiłku^1,2. Takie podejście zapobiega badaniom podłużnym mającym na celu określenie zmian w opróżnianiu żołądka wraz z wiekiem i postępem choroby. Powszechnie stosowany test oddechowy z kwasem oktanowym [¹³C] dla ludzi³ został zmodyfikowany do stosowania u myszy^4-6 i szczurów⁷, a wcześniej wykazaliśmy, że ten test jest wiarygodny i reaguje na zmiany w opróżnianiu żołądka w odpowiedzi na leki i podczas progresji choroby cukrzycowej⁸. W tej prezentacji wideo wyjaśniona jest zasada i praktyczna implementacja tego zmodyfikowanego testu. Podobnie jak w poprzednim badaniu, wykorzystano myszy NOD LtJ, model cukrzycy typu 1⁹. U części tych myszy rozwijają się objawy gastroparezy, powikłania cukrzycy charakteryzującego się opóźnionym opróżnianiem żołądka bez mechanicznej niedrożności żołądka¹⁰.

Ten artykuł pokazuje, jak wyszkolić myszy do testów, jak przygotować posiłek testowy i uzyskać dane o opróżnianiu żołądka w ciągu 4 godzin oraz jak analizować uzyskane dane. Analizator izotopów węgla zastosowany w niniejszym badaniu nadaje się do automatycznego pobierania próbek powietrza od maksymalnie 12 myszy jednocześnie. Technika ta pozwala na podłużną obserwację opróżniania żołądka u większych grup myszy z cukrzycą lub innymi długotrwałymi chorobami.

Wprowadzenie

Niniejszy artykuł opisuje kwestie techniczne i metodologiczne związane z nieinwazyjnym pomiarem opróżniania żołądka u myszy. Postępując zgodnie z opisanym tutaj protokołem, badacze mogą w sposób niezawodny i powtarzalny monitorować zmiany w opróżnianiu żołądka wynikające z rozwoju choroby, badać wpływ środków farmakologicznych na opróżnianie żołądka oraz śledzić reakcję opróżniania żołądka na leczenie chorób podstawowych lub wad^6,8,11,12. W poprzednich publikacjach wykazano, że zastosowanie testów oddechowych z kwasem oktanowym z ¹³C jest użyteczną metodą pomiaru opróżniania żołądka u ludzi i zwierząt^3,8. W niniejszej pracy szczegółowo opisano procedury niezbędne do uzyskania wiarygodnych danych w okresie od 6 do 8 miesięcy, co jest konieczne w przypadku podłużnego badania opróżniania żołądka u myszy z cukrzycą. Zaletą stosowania tego protokołu w porównaniu z wcześniej opublikowanymi metodami jest pewność badacza, że uzyskane dane będą wiarygodne i powtarzalne. Ponadto opisany tutaj zautomatyzowany system pobierania i analizy próbek gazu zwiększa liczbę zwierząt, które mogą być monitorowane jednocześnie w badaniu. Ogólnym celem niniejszej pracy jest zidentyfikowanie kluczowych czynników, które zapewniają habituację myszy do testu oraz redukują zmienność uzyskanych wyników.

W celu pomiaru opróżniania żołądka in vivo myszy są poddawane postowi przez noc, a następnie umieszczane w przezroczystych plastikowych komorach testowych ze stałym przepływem powietrza. Po adaptacji myszy do rurek wyznaczane są bazowe poziomy wydychanego ¹³CO₂, a przepływ powietrza jest odpowiednio regulowany. Następnie podajemy posiłek testowy składający się z żółtka jaja wymieszanego z kwasem oktanowym znakowanym ¹³C. Ponieważ myszy są głodne i przeszkolone, zazwyczaj zjadają posiłek testowy w ciągu 2 min. Podany kwas oktanowy nie jest wchłaniany w żołądku, lecz zostaje przejęty w dwunastnicy i zmetabolizowany w wątrobie do ¹³CO₂, który jest uwalniany i wydychany, co prowadzi do wzbogacenia powietrza otaczającego w ¹³CO₂. Próbki powietrza są pobierane w określonych odstępach czasu i analizowane za pomocą analizatora izotopów węgla. Etapem ograniczającym w całym tym procesie jest opróżnianie żołądka, a pulmonalne wydalanie ¹³CO₂ bezpośrednio odpowiada opróżnianiu żołądka z oznakowanego posiłku.

Rysunek 1. Schemat aparatury do badania opróżniania żołądka. Po całonocnym postach myszy umieszczane są w przezroczystych komorach, które umożliwiają im swobodne poruszanie się i obracanie. Rurka wlotowa zapewnia świeży i stały dopływ powietrza, a wylot prowadzi do analizatora izotopowego w celu pomiaru stosunku ¹³C do ¹²C w wydychanym powietrzu. Komora posiada również centralny port do podawania pokarmu zawierającego kwas [¹³C]-oktanowy.

Protokół

1. Trening i przyzwyczajenie myszy

1. Przed analizą umieść wszystkie myszy w komorach testowych na 2-4 godziny ze stałym przepływem powietrza, aby przyzwyczaić je do warunków testowych. To znacznie zmniejsza poziom stresu, który w przeciwnym razie mógłby spowodować nieprawidłowe wykrywanie opóźnionego opróżniania żołądka. Traktuj myszy w taki sam sposób, jak gdyby trwał eksperyment z opróżnianiem żołądka. Przygotuj żółtko jaja (patrz dalej) bez dodawania kwasu oktanowego i nakarm każdą mysz 0,2 g.
2. Powtarzaj ten proces, aż myszy będą wystarczająco wyszkolone (zwykle 2-3 razy). Myszy zazwyczaj łatwo się przyzwyczajają, o ile warunki środowiskowe są takie same.

Uwaga: Myszy nieprzyzwyczajone poruszają się przez około 1 godzinę po przeniesieniu do komory, często się kalają i oddają mocz, podczas gdy myszy przyzwyczajone szybko aklimatyzują się w nowym środowisku i spokojnie odpoczywają.

Uwaga: Podczas eksperymentu: Monitoruj zwierzęta pod kątem oznak utraty przyzwyczajenia, takich jak nadmierne oddawanie moczu, defekacja, brak zainteresowania jedzeniem jajka. W takim przypadku rozważ ponowne przyzwyczajenie się do pustej komory 1-2 razy przed uzyskaniem danych dotyczących opróżniania żołądka. Konsekwencja jest niezwykle ważna podczas wykonywania tego eksperymentu. Robienie rzeczy dokładnie w ten sam sposób za każdym razem to jedyny sposób na uzyskanie wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Obejmuje to podawanie leczenia (np. insuliny) codziennie o tej samej porze, nieoddzielanie myszy od ich współlokatorów, chyba że jest to absolutnie konieczne, poszczenie myszy i rozpoczęcie testu opróżniania żołądka w tym samym czasie oraz obchodzenie się z myszami w ten sam sposób.

2. Przygotowanie posiłku testowego zawierającego izotop

1. Zacznij od odważenia 5 g żółtka jaja w probówce sokoła o pojemności 50 ml. Powtarzaj te kroki każdego dnia eksperymentalnego, aby przygotować świeży posiłek testowy.
2. Dodać 10 μl kwasu oktanowego o stężeniu 2 μl/g do 50 ml probówki sokoła zawierającej jajko i energicznie mieszać przez 1 minutę za pomocą szpatułki w probówce sokoła.
3. Jajko jest następnie przenoszone do szklanej zlewki i podgrzewane nad palnikiem Bunsena, aż do koagulacji, a jego konsystencja będzie odpowiednia do zrobienia małych kulek. Zwykle trwa to około 30 sekund.

Uwaga: Kulki żółtka jaja powinny ważyć 0,2 g na mysz. Jest to ważne, aby utrzymać skumulowaną dawkę na stałym poziomie u wszystkich myszy.

3. Rozpoczęcie eksperymentu

1. Po przeszkoleniu i przygotowaniu do opróżniania żołądka, pościć myszy przez noc (12 godzin) na metalowym stojaku na czczo z "siatkowym dnem", aby zapobiec koprofagii. Upewnij się, że mają swobodny dostęp do wody pitnej. Ponieważ w obecnym eksperymencie wykorzystano myszy z cukrzycą, nie powinny one być na czczo dłużej niż 16 godzin.
2. Zacznij od ustawienia komór opróżniania żołądka. Używaj czystych komór i pokryw, które zostały wysuszone na powietrzu. Również wszelkie rurki łączące komory z analizatorem lub dopływem powietrza CO₂ powinny być wolne od wilgoci; Woda może zakłócać sygnał odczytywany przez analizator
3. Podłącz komory do rur wlotowych, które zapewniają stały przepływ powietrza. Następnie podłącz rurki wylotowe z komór do maszyny. Zamknij rurki i włącz przepływ powietrza.

Uwaga: Nałóż bardzo małą ilość wazeliny na koniec pokrywy, aby łatwo się zamknęły i były bezpiecznie zamknięte. To szczelne uszczelnienie jest niezbędne do zebrania całego dwutlenku węgla wytwarzanego przez myszy.

4. Procedury eksperymentalne

1. Zacznij od zważenia każdej myszy. Masa ciała jest miarą ich utrzymującego się dobrego stanu zdrowia. Następnie umieść każdą mysz w odpowiedniej komorze. Oczywiście ważne jest, aby w tym czasie powietrze przepływało do komór.
2. Aby rozpocząć pomiar, pozwól myszom zaaklimatyzować się w komorach przed regulacją poziomu powietrza.
3. Gdy myszy wydają się spokojne, co może potrwać kilka minut, dostosuj natężenie przepływu powietrza dla każdej komory myszy. Może to być różne dla każdej myszy. Zazwyczaj przepływ powietrza jest regulowany na początku eksperymentu, aby upewnić się, że wydychany CO₂ osiąga poziomy wykrywalne przez dowolny używany sprzęt i aby upewnić się, że poziom pozostaje wystarczająco niski, aby zapewnić zdrową wymianę powietrza. Stosujemy początkowe poziomy CO₂ w zakresie od 1 000 do 1 500 części na milion.
4. Jeśli masz trudności z regulacją, sprawdź, czy nie ma wycieków powietrza. Następnie powtórz proces dla każdej z komór i obserwuj kolejną rundę pomiarów, aby sprawdzić, czy korekty przepływu powietrza skorygowały poziom CO₂ . Ważne jest, aby uzyskać stały odczyt wyjściowy przed karmieniem myszy. Używamy maszyny z funkcją autokalibracji. Jeśli tak nie jest, należy sprawdzić kalibrację.
5. Kiedy to zostanie osiągnięte, podaj mączkę jajeczną pierwszej myszy i zapisz czas, w którym każda mysz otrzymuje pokarm.
6. Przeprowadzamy procedurę przez 4 godziny, aby uzyskać wartości wystarczające do dopasowania krzywej wzbogacania ¹³CO₂ dla każdej myszy. Sprawdzaj myszy co 30-60 minut, aby upewnić się, że poziom CO₂ jest nadal bezpieczny dla myszy.
7. Przygotuj nowe pudełka z jedzeniem przed końcem testu, aby myszy mogły zacząć jeść natychmiast po zakończeniu testu.

Wyniki

Reprezentatywny zestaw danych od trzech różnych myszy przedstawiono na Rysunku 2. Czarny wykres reprezentuje punkty danych od myszy z prawidłowym opróżnianiem żołądka. Przedstawia on frakcję ¹³C odzyskaną z wydychanego powietrza, wyrażoną jako procent podanej dawki na godzinę w funkcji czasu. Niebieska krzywa pochodzi od myszy z przyspieszonym opróżnianiem żołądka z wartością T half wynoszącą 40 min, a czerwona krzywa od myszy z opóźnionym opróżnianiem żołądka z wartością T half wynoszącą 168 ...

Dyskusja

Opisana w niniejszym artykule technika pozwala na wielokrotny i nieinwazyjny pomiar in vivo opróżniania żołądka w stanie stałym u myszy. System ten ma tę zaletę, że zwierzęta nie są skrępowane w komorze pomiarowej, co pozwala im na swobodne poruszanie się i obracanie. Ponieważ jest to nieznane środowisko, myszy nadal muszą być szkolone i przyzwyczajane do komór testowych, aby zapobiec wpływowi stresu na opróżnianie żołądka. Ogólnie rzecz biorąc, zakładamy, że dane dotyczące opróżniania żołądka są wiarygodne, jeś...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Źródło stałego dopływu powietrza, przepływu i składu	Centralny dopływ powietrza w placówce
Komora do pobierania próbek o pojemności 130 ml z wlotem i wylotem powietrza oraz otworem do podawania żywności Plastikowe rurki do doprowadzania powietrza	Własne
kwasu oktanowego	Cambridge (Andover, MA)	CLM-293-1
Aby przygotować mączkę jajeczną: mała zlewka 50 ml plastikowa tuba Palnik Bunsena jajko szpatułka	Dowolny dostawca		Staraj się być konsekwentny w stosunku do dostawcy jaj, ponieważ zawartość składników odżywczych i smakowitość jaj mogą mieć wpływ spożycie i opróżnienie żołądka z posiłku
Analizator izotopów dwutlenku węgla	Los Gatos Research Inc. (Mountain View, Kalifornia)

badawczejlaboratoria izotopowe