Artykuł metodologiczny

Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

DOI:

10.3791/50323

⸱

23 czerwca 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Animal Science, Texas A&M University, 2Department of Biology, Texas A&M University, 3Department of Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W odróżnieniu od klasycznych reakcji zapalnych, makrofagi, które infiltrują tkanki, często wykazują spolaryzowany stan aktywacji, który odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji fizjologicznych tkanki gospodarza1-8. Po stymulacji aktywację makrofagów można podzielić na klasyczną (M1) i alternatywną (M2) aktywację2, 4, 9 . Aktywacja makrofagów M1 zależy od receptorów Toll-podobnych (TLR) i aktywacji czynnika jądrowego kappa B (NFκB) / kinazy N-końcowej c-Jun 1 (JNK1), co prowadzi do produkcji cytokin zapalnych, takich jak TNF-α i IL-1β oraz aktywacji iNOS, która powoduje zwiększoną produkcję reaktywnych form tlenu, takich jak tlenek azotku (NO) 10, 11 . W przeciwieństwie do tego, aktywacja makrofagów M2 rekrutuje szlaki PPARγ, PPARδ lub IL-4-STAT6, prowadząc do alternatywnej, przeciwzapalnej (M2) aktywacji, która jest związana z regulacją w górę receptora mannozy CD206 i arginazy 1(Arg1) 6, 12-14 .

Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) stanowią idealny model in vitro do zrozumienia mechanizmów kontrolujących polaryzację aktywowanych makrofagów15. W szczególności aktywacja makrofagów M1 może być indukowana przez stymulację lipopolisacharydami (LPS), podczas gdy polaryzacja makrofagów M2 może być indukowana przez IL-4 i / lub IL-13. Dojrzałe makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego i aktywowane makrofagi można zidentyfikować za pomocą analizy cytometrii przepływowej pod kątem ekspresji antygenów powierzchniowych, w tym CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 i CD869, 16, 17. Ponadto zmiany w produkcji cytokin i szlakach sygnalizacji komórkowej związane z polaryzacją makrofagów można mierzyć odpowiednio za pomocą ilościowego RT-PCR i western blot. Podsumowując, makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego myszy mogą służyć jako odpowiedni model do badania polaryzacji makrofagów in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja komórek szpiku kostnego

  1. Odizoluj kości udowe i piszczelowe od 6-8 tygodniowych myszy, spłucz włosy, a następnie rozetnij kość.
  2. Użyj igły 21G i strzykawki o pojemności 10 ml, aby wypłukać szpik do zimnego, inaktywowanego termicznie płodowego surowicy bydlęcej PBS + 2% (FBS) (3-5 ml / mysz).
  3. Przepuść szpik przez igłę 21G 4-6 razy, aby oddzielić komórki.
  4. Przepuść komórki przez sitko o wielkości 70 μm, aby usunąć grudki komórek, kości, włosy i inne komórki/tkanki.
  5. Dodać 3 objętości roztworu NH4Cl (0,8% roztwór NH4Cl, technologia komórek macierzystych) i inkubować na lodzie przez 10 minut w celu usunięcia czerwonych krwinek.
  6. Wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Zawiesić osad komórkowy w zimnym PBS+2%FBS (20-50 ml, w zależności od ilości komórek).

2. Indukcja Formacja BMDM

  1. Zawiesić izolowane komórki szpiku kostnego w pożywce wzrostowej BMDM (2x106 komórek/ml).

Podłoże wzrostu BMDM:

Zmodyfikowane podłoże Dulbecco (IMDM) Iscove'a + 10% FBS + 15% przefiltrowane (0,2 μm) supernatant hodowli komórek L-929 (ATCC, CCL-1) (zawierający czynnik stymulujący monocyty, M-CSF) lub 10 ng/ml M-CSF.

Uwaga: Supernatant komórek L-929 zawiera M-CSF18. Aby zapewnić skuteczną aktywność kondycjonowanej pożywki, 5 X 105 komórek L-929 wysiewa się w kolbach T75 cm2 przez 6-7 dni, kondycjonowane podłoże zbiera się i przepuszcza przez filtr 0,45 μM przed użyciem. Średnie podwielokrotności można zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C przez 1-2 miesiące.

  1. Komórki nasienne na 6 lub 12-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej (w zależności od projektu eksperymentalnego) (Corning Costar).
  2. Zmień świeżą pożywkę wzrostową BMDM w dniu 3.
  3. W 7 dniu tworzenie dojrzałego BMDM ocenia się za pomocą analizy cytometrii przepływowej i przeciwciał sprzężonych z fluoroforami w celu wykrycia komórek wykazujących ekspresję CD11b i F4/80.

3. Aktywacja spolaryzowana BMDM

  1. W 7 dniu zmień na świeżą pożywkę stymulacyjną: do aktywacji M1 użyj IMDM zawierającego 10% FBS i 100 ng/ml LPS lub 100 ng/ml LPS z 50 ng/ml IFNγ; do aktywacji M2 użyj IMDM zawierającego 10% FBS z 10 ng/ml IL-4 i/lub 10 ng/ml IL-13.
  2. Zbierz stymulowane BMDM, odłączając je od naczynia za pomocą ciepłej 0,05% trypsyny, a następnie dwukrotnie myjąc komórki PBS zawierającym 10% FBS.

Uwaga: Aby odłączyć i ponownie zawiesić dojrzałe makrofagi po różnicowaniu, można użyć 0,05% roztworu trypsyny (zawierającego 0,48 mM EDTA, Invitrogen) lub 2-5 mM EDTA w PBS wolnym od Ca i Mg lub zrównoważonym buforze Hanka (HBSS). W przypadku stosowania pożywki trawiennej zawierającej trypsynę, komórki są poddawane działaniu środka w temperaturze 37 °C przez mniej niż 10 minut, aby uniknąć utraty białek powierzchniowych z powodu nadmiernego trawienia.

  1. Użyj przeciwciał do wykrywania ekspresji antygenów powierzchniowych komórek, w tym CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 lub CD86 w różnych punktach czasowych przy użyciu standardowych procedur barwienia cytometrią przepływową.
  2. Określ ekspresję genów charakterystycznych dla aktywowanych makrofagów M1 i M2, w tym IL-1β, TNF-α i IL-6 (aktywacja M1) lub IL-10, IL-13, arginazy1 i PPARγ (aktywacja M2) za pomocą qRT-PCR. Określ aktywację komórkowych szlaków sygnałowych zaangażowanych w aktywację makrofagów M1 lub M2 za pomocą analizy western blot.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono schematyczny opis procedury generowania BMDM (Rysunek 1). Wysoką czystość dojrzałych makrofagów można zaobserwować w 7 dniu, kiedy reprezentują one od 95 do 99% komórek CD11b + F4 / 80 + (ryc. 2). Spolaryzowane makrofagi można badać za pomocą przeciwciał przeciwko CD11b, F4/80, CD11c i CD206, a następnie analizować za pomocą cytometrii przepływowej. Jak pokazano na rysunku 3, makrofagi M1 są wykrywane jako komórki CD11b + F4 / 80 + CD11c + CD206 (Q2), podcz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj prostą i łatwą do adaptacji procedurę in vitro w celu wywołania aktywacji makrofagów pochodzących z komórek progenitorowych szpiku kostnego. Procedura ta może być wykorzystana do badania mechanizmów odpowiedzialnych za polaryzację makrofagów. Czystość dojrzałych makrofagów uzyskanych przy użyciu tego protokołu wynosi średnio od 95 do 99% i nie są wymagane żadne dodatkowe procedury oczyszczania. Aby zbadać funkcję określonych genów będących przedmiotem zainteresowania w kontekście polaryzacji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez American Heart Association (BGIA 7850037 do dr Beiyan Zhou).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IMDMThermo ScientificSH30259.01
Płodowa surowica bydlęcaInvitrogen10438-026
Mysz GM-CSFPeproTech315-03
NH4ClStemCell Technologies7850
L-929ATCCCCL-1
70 μ m Filtr siatkowy do komórekBD Biosciences352350
10 x PBSThermo ScientificAP-9009-10
Anty-mysz CD11b-APCeBioscience17-0112-81
Anty-mysz F4/80-FITCeBioscience11-4801-81
Anty-mysz CD69-PEeBioscience12-0691-81
Anty-mysz CD86-PEeBioscience12-0862-81
Jod propidynowyInvitrogenP3566

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
  2. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
  3. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  4. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  5. Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
  6. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
  7. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
  8. Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
  11. Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
  12. Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
  13. Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
  14. Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
  15. Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
  16. Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
  17. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
  18. Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
  19. Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
  20. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cytometria przep ywowaPCR w czasie rzeczywistymWestern blotantygeny powierzchniowe kom rekanaliza ekspresji gen waktywacja M1 M2detekcja cytokinszlaki sygnalizacji kom rkowej

Powiązane artykuły