Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Podsumowanie

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Streszczenie

Makrofagi pochodzące z monocytów reprezentują ważny typ komórek wrodzonego układu odpornościowego. Modele mysie badające biologię makrofagów cierpią z powodu różnic fenotypowych i funkcjonalnych między makrofagami pochodzącymi od myszy i ludzi. Dlatego opisujemy tutaj model in vitro do generowania i badania pierwotnych ludzkich makrofagów. Krótko mówiąc, po odwirowaniu w gradiencie gęstości krwi obwodowej pobranej z żyły przedramienia, monocyty izoluje się z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą ujemnej izolacji kulek magnetycznych. Te monocyty są następnie hodowane przez sześć dni w określonych warunkach w celu wywołania różnych typów różnicowania lub polaryzacji makrofagów. Model jest łatwy w użyciu i omija problemy spowodowane różnicami gatunkowymi między myszą a człowiekiem. Co więcej, jest bliższy warunkom in vivo niż zastosowanie unieśmiertelnionych linii komórkowych. Podsumowując, opisany tutaj model nadaje się do badania biologii makrofagów, identyfikacji mechanizmów chorobowych i nowych celów terapeutycznych. Mimo że nie zastępuje w pełni eksperymentów na tkankach zwierzęcych lub ludzkich uzyskanych post mortem, opisany tutaj model pozwala na identyfikację i walidację mechanizmów chorobowych i celów terapeutycznych, które mogą być bardzo istotne dla różnych chorób ludzkich.

Wprowadzenie

Makrofagi pochodzące z monocytów stanowią ważny składnik komórkowy wrodzonego układu odpornościowego i przyczyniają się do wielu ostrych lub przewlekłych procesów zapalnych ¹. Makrofagi odgrywają ważną rolę w wielu chorobach zapalnych, takich jak miażdżyca czy rak ². Makrofagi wykazują wysoki stopień plastyczności i są w stanie przyjmować różne fenotypy w zależności od lokalnego mikrośrodowiska ³. W związku z tym badanie różnicowania i heterogeniczności makrofagów ma zasadnicze znaczenie dla poszerzenia naszej wiedzy na temat patofizjologii wielu chorób oraz umożliwienia identyfikacji nowych celów terapeutycznych i opracowania nowych terapii.

W wielu przypadkach mysie modele są używane do badania patofizjologii konkretnych chorób. Jednak badaniu biologii makrofagów przy użyciu modeli mysich towarzyszy kilka niedociągnięć: (1) Proporcja liczby podzbiorów leukocytów (tj. monocytów i granulocytów) we krwi obwodowej myszy lub ludzi różni się znacząco, co sugeruje różne role monocytów w patofizjologii myszy i człowieka. (2) Istnieją znaczne różnice w ekspresji genów między monocytami krwi obwodowej myszy i człowieka, co sugeruje znaczne różnice w ich funkcji podczas zdrowia i choroby ⁴. (3) Pewna liczba markerów, które są używane do identyfikacji mysich monocytów i makrofagów (F4/80, LyC itp.) nie istnieje w ludzkich komórkach szpikowych, co sprawia, że przeniesienie wyników z modeli mysich do sytuacji ludzkiej jest raczej trudne.

Dlatego, aby zwiększyć nasze zrozumienie różnicowania i heterogeniczności makrofagów w chorobach ludzkich, musimy korzystać z modeli pracujących z ludzkimi makrofagami. Dlatego opisujemy tutaj model ludzkiej pierwotnej generacji makrofagów, który jest łatwy w użyciu i umożliwia badanie ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów in vitro w różnych warunkach, co skutkuje różnymi typami polaryzacji makrofagów. W kilku badaniach wykorzystaliśmy model in vitro pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do analizy biologii makrofagów i jej potencjalnego znaczenia dla miażdżycy tętnic ^{u ludzi 5-7}.

Chociaż nie zastępuje w pełni eksperymentów z tkankami zwierzęcymi lub ludzkimi uzyskanymi pośmiertnie, opisany tutaj model pozwala na identyfikację i walidację mechanizmów chorobowych i celów terapeutycznych, które mogą być bardzo istotne dla różnych chorób ludzkich.

Protokół

1. Protokół

1. Przygotuj w następujący sposób:
   1. Przygotuj bufor do izolacji PBMC: "Bufor do płukania" = 0,02% EDTA w PBS (użyj 0,5 M EDTA).
   2. Przygotować bufor do izolacji monocytów: "Bufor płuczący MACS" = 0,5% BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 μl) + PBS (50 ml). Odgazuj bufor.
   3. Przygotować bufor do barwienia FACS i przechowywania komórek: "Bufor FACS" = 10% FCS w PBS i "bufor utrwalający" = 1% PFA w PBS.
2. Pobierz 30 ml krwi pełnej z żyły przedramienia. Użyj EDTA jako antykoagulantu.
3. Wyizolować PBMC (histopaque) w następujący sposób:
   1. Przygotuj dwie sterylne probówki o pojemności 50 ml (bez polistyrenu).
   2. Rozcieńczyć krew z kroku 2 PBS 1:1.
   3. Dodać 25 ml histopaku + 25 ml krwi pełnej/PBS na probówkę. Upewnij się, że histopak i krew nie mieszają się.
   4. Wirować przy 400 x g przez 30 minut przy RT, bez hamulca.
   5. Odessać osocze i wyrzucić.
   6. Odessać nieprzezroczystą złączkę i pipetować do czystej probówki o pojemności 50 ml.
   7. Dodać 20 ml 0,02% EDTA do PBS.
   8. Wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   9. Odrzucić supernatant.
   10. Dodać 10 ml 0,02% EDTA do PBS.
4. Policz komórki w następujący sposób:
   1. Dobrze wymieszaj, wirując przez 10 sekund.
   2. Weź 200 μl zawiesiny komórek + 300 μl 0,02% EDTA w PBS + 500 μl błękitu trypanowego (200-500 komórek / 10 kwadratów, w przeciwnym razie zmień współczynnik rozcieńczenia).
5. Wykonaj ujemną izolację monocytów w następujący sposób:
   1. Odwirować komórki otrzymane w kroku 3.10 przez 10 minut, 120 x g. Odrzucić supernatant.
   2. Przemyć osad komórkowy 2x dodając 10 ml PBS + 0,02% EDTA i odwirować przez 10 min, 120 x g.
   3. Dodaj 9 ml sterylnej wody przez 3 sekundy, dodaj 1 ml 10X PBS.
   4. Przemyć jeszcze raz PBS + 0,02% EDTA i odwirować 10 min, 120 x g.
   5. Policz podczas wirowania.
   6. Rozcieńczyć w buforze EasySep w stężeniach 5 x 10⁷/ml.
   7. Dodać 50 μl/ml koktajlu wzbogacającego monocyty.
   8. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   9. Wiruj koraliki przez 30 sek.
   10. Dodać 50 μl/ml kulek.
   11. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   12. Napełnij buforem EasySep do pełnej objętości 2,5 ml. Roztwór wydaje się teraz brązowawy.
   13. Włóż do magnesu.
   14. Poczekaj 2.5 minuty w RT. W tym czasie komórki niemonocytowe związane ze kulką magnetyczną przesuną się do ścianki rurki i tam się przykleją.
   15. Wlać bufor z niewiążącymi monocytami do świeżej sterylnej probówki. Ten roztwór wygląda na białawy.
   16. Przemyć raz PBS + 0,02% EDTA i odwirować przez 10 minut, 120 x g.
6. Komórki płytkowe w plastikowym naczyniu lub płycie wielościennej o gęstości 0,5 x 10⁶/cm². Dodać 1 ml pożywki hodowlanej/1 x 10⁶ komórek.
7. Hoduj komórki w interesujących warunkach przez 6-14 dni.
8. Zmień nośnik po 3 dniach, zastępując 50% nośnika nowym nośnikiem (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1).
9. Po sześciu dniach zbierz komórki do izolacji mRNA, cytometrii przepływowej, Western blot itp.

Wyniki

Stosując opisany powyżej protokół, rutynowo otrzymujemy 25,1 x 10⁶ ± 2,2 x 10⁶ monocytów/100 ml krwi (średnia ± błąd standardowy z 26 niezależnych eksperymentów, Rycina 1A). Czystość monocytów, określona za pomocą barwienia cytometrycznego dla CD14, jest rutynowo wyższa niż 95% (97,1 ± 0,4%, średnia ± błąd standardowy z 3 niezależnych eksperymentów, Rycina 1B). Żywotność świeżo wyizolowanych monocytów, określona za pomocą barwienia błękitem trypanu, jest rutynowo wy...

Dyskusja

Makrofagi pochodzące z monocytów reprezentują kluczowy typ komórek wrodzonego układu odpornościowego. Odgrywają ważną rolę w wielu chorobach zapalnych, w tym miażdżycy czy nowotworach ². W związku z tym badanie biologii makrofagów jest niezbędne do poszerzenia naszej wiedzy na temat patofizjologii wielu chorób i umożliwienia opracowania nowych terapii.

Wiele badań dotyczy modeli mysich z nadekspresją lub brakiem pewnych interesujących genów. W przypadku makrofagów pochodzących z mon...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka wirówkowa 50 ml (sterylna)	Fisher	055398
D-PBS (1X), płynna (bez wapnia i magnezu)	Invitrogen	14190-250
EDTA	Sigma	T9285
BSA	Sigma	A-8806
FCS	Invitrogen
EasySep	Technologie stemCell	19059
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Probówki FACS	Fisher	352008
Macrophage-SFM (1X)	Invitrogen	12065-074
Penicylina-streptomycyna	Sigma	P-4458
Nutridoma-SP	Roche	11011375001
ludzki M-CSF 10 μ g	Peprotech	300-25
Płytki do hodowli komórkowych 6-dołkowe	Fisher	07-200-80

Zestaw do wzbogacania ludzkich monocytów