Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Podsumowanie

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Streszczenie

Makrofagi pochodzące z monocytów reprezentują ważny typ komórek wrodzonego układu odpornościowego. Modele mysie badające biologię makrofagów cierpią z powodu różnic fenotypowych i funkcjonalnych między makrofagami pochodzącymi od myszy i ludzi. Dlatego opisujemy tutaj model in vitro do generowania i badania pierwotnych ludzkich makrofagów. Krótko mówiąc, po odwirowaniu w gradiencie gęstości krwi obwodowej pobranej z żyły przedramienia, monocyty izoluje się z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą ujemnej izolacji kulek magnetycznych. Te monocyty są następnie hodowane przez sześć dni w określonych warunkach w celu wywołania różnych typów różnicowania lub polaryzacji makrofagów. Model jest łatwy w użyciu i omija problemy spowodowane różnicami gatunkowymi między myszą a człowiekiem. Co więcej, jest bliższy warunkom in vivo niż zastosowanie unieśmiertelnionych linii komórkowych. Podsumowując, opisany tutaj model nadaje się do badania biologii makrofagów, identyfikacji mechanizmów chorobowych i nowych celów terapeutycznych. Mimo że nie zastępuje w pełni eksperymentów na tkankach zwierzęcych lub ludzkich uzyskanych post mortem, opisany tutaj model pozwala na identyfikację i walidację mechanizmów chorobowych i celów terapeutycznych, które mogą być bardzo istotne dla różnych chorób ludzkich.

Wprowadzenie

Makrofagi pochodzące z monocytów stanowią ważny składnik komórkowy wrodzonego układu odpornościowego i przyczyniają się do wielu ostrych lub przewlekłych procesów zapalnych ¹. Makrofagi odgrywają ważną rolę w wielu chorobach zapalnych, takich jak miażdżyca czy rak ². Makrofagi wykazują wysoki stopień plastyczności i są w stanie przyjmować różne fenotypy w zależności od lokalnego mikrośrodowiska ³. W związku z tym badanie różnicowania i heterogeniczności makrofagów ma zasadnicze znaczenie dla poszerzenia naszej wiedzy na temat patofizjologii wielu chorób oraz umożliwienia identyfikacji nowych celów terapeutycznych i opracowania nowych t....

Protokół

1. Protokół

1. Przygotuj w następujący sposób:
   1. Przygotuj bufor do izolacji PBMC: "Bufor do płukania" = 0,02% EDTA w PBS (użyj 0,5 M EDTA).
   2. Przygotować bufor do izolacji monocytów: "Bufor płuczący MACS" = 0,5% BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 μl) + PBS (50 ml). Odgazuj bufor.
   3. Przygotować bufor do barwienia FACS i przechowywania komórek: "Bufor FACS" = 10% FCS w PBS i "bufor utrwalający" = 1% PFA w PBS.
2. Pobierz 30 ml krwi pełnej z żyły przedramienia. Użyj EDTA jako antykoagulantu.
3. Wyizolować PBMC (histopaque) w następujący sposób:
   1. Przygotuj dwie sterylne probówki o pojemności 50 ml (be....

Wyniki

Stosując opisany powyżej protokół, rutynowo otrzymujemy 25,1 x 10⁶ ± 2,2 x 10⁶ monocytów/100 ml krwi (średnia ± błąd standardowy z 26 niezależnych eksperymentów, Rycina 1A). Czystość monocytów, określona za pomocą barwienia cytometrycznego dla CD14, jest rutynowo wyższa niż 95% (97,1 ± 0,4%, średnia ± błąd standardowy z 3 niezależnych eksperymentów, Rycina 1B). Żywotność świeżo wyizolowanych monocytów, określona za pomocą barwienia błękitem trypanu, jest rutynowo wy.......

Dyskusja

Makrofagi pochodzące z monocytów reprezentują kluczowy typ komórek wrodzonego układu odpornościowego. Odgrywają ważną rolę w wielu chorobach zapalnych, w tym miażdżycy czy nowotworach ². W związku z tym badanie biologii makrofagów jest niezbędne do poszerzenia naszej wiedzy na temat patofizjologii wielu chorób i umożliwienia opracowania nowych terapii.

Wiele badań dotyczy modeli mysich z nadekspresją lub brakiem pewnych interesujących genów. W przypadku makrofagów pochodzących z mon.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka wirówkowa 50 ml (sterylna)	Fisher	055398
D-PBS (1X), płynna (bez wapnia i magnezu)	Invitrogen	14190-250
EDTA	Sigma	T9285
BSA	Sigma	A-8806
FCS	Invitrogen
EasySep	Technologie stemCell	19059
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Probówki FACS	Fisher	352008
Macrophage-SFM (1X)	Invitrogen	12065-074
Penicylina-streptomycyna	Sigma	P-4458
Nutridoma-SP	Roche	11011375001
ludzki M-CSF 10 μ g	Peprotech	300-25
Płytki do hodowli komórkowych 6-dołkowe	Fisher	07-200-80

Zestaw do wzbogacania ludzkich monocytów