Opisana jest łatwa i niezawodna technika wizualizacji i ilościowego określania ruchliwości rzęsek w drogach oddechowych oraz przepływu generowanego przez rzęski za pomocą tchawicy myszy. Technikę tę można zmodyfikować w celu określenia, w jaki sposób szeroki zakres czynników wpływa na ruchliwość rzęsek, w tym czynniki farmakologiczne, czynniki genetyczne, narażenie środowiskowe i/lub czynniki mechaniczne, takie jak obciążenie śluzem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ex vivo Metoda obrazowania w wysokiej rozdzielczości ruchliwości rzęsek w nabłonku dróg oddechowych gryzoni
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ustalono technikę ex vivo obrazowania nabłonka dróg oddechowych myszy do analizy ilościowej funkcji ruchliwych rzęsek, ważnej dla wglądu w funkcję klirensu śluzowo-rzęskowego. Świeżo zebraną tchawicę myszy przecina się wzdłużnie przez mięsień tchawicy i umieszcza w płytkiej komorze o ściankach na naczyniu ze szklanym dnem. Próbkę tchawicy umieszcza się wzdłuż jej długiej osi, aby wykorzystać mięsień tchawicy do zwijania się wzdłużnie. Pozwala to na obrazowanie ruchu rzęsek w widoku profilu na całej długości tchawicy. Filmy z szybkością 200 klatek na sekundę są uzyskiwane przy użyciu mikroskopii kontrastowej interferencji różnicowej i szybkiej kamery cyfrowej, aby umożliwić ilościową analizę częstotliwości uderzeń rzęsek i kształtu fali rzęskowej. Dzięki dodaniu kulek fluorescencyjnych podczas obrazowania można również określić przepływ płynu generowany przez rzęski. Czas trwania protokołu wynosi około 30 minut, z czego 5 minut na przygotowanie komory, 5-10 minut na montaż próbki i 10-15 minut na wideomikroskopię.
Wprowadzenie
Analiza funkcji ruchliwych rzęsek w nabłonku dróg oddechowych jest eksperymentalnie ważna dla wyjaśnienia czynników genetycznych i środowiskowych, które mogą wpływać na klirens śluzowo-rzęskowy i zdrowie płuc 1. Prosty protokół opracowany do obrazowania nabłonka dróg oddechowych myszy zapewnia skuteczną metodę badania ruchliwości rzęsek dróg oddechowych w zmutowanych i nokautujących modelach myszy i wymaga jedynie podstawowych umiejętności w zakresie sekcji tkanki tchawicy myszy i obrazowania ex vivo ruchliwości rzęsek dróg oddechowych za pomocą wideomikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Protokół ten został opracowany i udoskonalony podczas zakrojonego na szeroką skalę badania mutagenezy myszy, aby umożliwić szybką ocenę funkcji ruchliwych rzęsek (częstotliwość uderzeń rzęsek, kształt uderzeń rzęsek, przepływ generowany przez rzęski) u mutantów z wrodzoną wadą serca związaną z heterotaksją 2-5.
Obecne techniki używane do badania ruchliwości rzęsek dróg oddechowych można podzielić na ostre metody eksperymentalne ex vivo lub długoterminowe doświadczenia in vitro. Ostre eksperymenty obejmują wizualizację ex vivo biopsji ludzkiej szczoteczki do nosa/dróg oddechowych 6,7 oraz analizę prostych poprzecznych odcinków dróg oddechowych 8. Podejścia in vitro wykorzystują różne techniki hodowli komórkowych do generowania arkuszy zróżnicowanego nabłonka rzęskowego, takich jak hodowle na granicy faz powietrza i cieczy lub hodowle zawiesiny dróg oddechowych9-11. Jednak te techniki nawleczania nabłonka dróg oddechowych wymagają bardzo znacznych inwestycji czasu i treningu, zanim jakiekolwiek użyteczne komórki nabłonka rzęskowego zostaną wyprodukowane do eksperymentów (4-6 tygodni 9,10). Podczas gdy ostra analiza ex vivo biopsji szczoteczki nabłonka dróg oddechowych jest powszechnie stosowana w badaniach klinicznych na ludziach, metoda ta nie jest stosowana w badaniach na myszach ze względu na zaostrzone mechaniczne uszkodzenie tkanek 12.
Technika opisana w tym protokole do analizy nabłonka dróg oddechowych tchawicy myszy jest nie tylko prosta do wykonania, ale nie wymaga żadnych specjalnych umiejętności preparacyjnych ani żadnego specjalistycznego sprzętu poza standardowymi dla obrazowania za pomocą wideomikroskopii. Ten prosty protokół ma wiele zalet. Po pierwsze, ponieważ pobieranie tkanki tchawicy myszy jest szybkie i łatwe do wykonania, pozwala na szybką ocenę funkcji rzęsek dróg oddechowych u dużej liczby myszy. Może to obejmować wnikliwą analizę krótkoterminowych skutków różnych metod leczenia in vitro. Po drugie, będąc techniką ex vivo, nabłonek rzęskowych dróg oddechowych pozostaje do niego przyczepiony pod tkankami podporowymi, a tym samym zachowuje powiązane szlaki sygnalizacji komórkowej. Dlatego w porównaniu do nabłonka dróg oddechowych reciliconego in vitro, preparat ten jest lepszym odwzorowaniem naturalnego środowiska tkankowego in vivo. Po trzecie, protokół ten pozwala na uzyskanie wielu różnych parametrów ilościowych, które mogą zapewnić obiektywną ocenę funkcji ruchliwych rzęsek. Wreszcie, w przeciwieństwie do innych obecnych metod wizualizacji rzęsek w drogach oddechowych, protokół ten pozwala na wizualizację rzęsek pod kątem prostym do kierunku uderzenia rzęsek, umożliwiając widok profilu rzęsek, który jest optymalny do obrazowania w wysokiej rozdzielczości bicia rzęsek i generowania fal śródrzęskowych.
Ten protokół może być modyfikowany na wiele sposobów, aby zaspokoić szeroki zakres potrzeb eksperymentalnych, takich jak rola środków farmakologicznych, czynniki genetyczne, ekspozycje środowiskowe i/lub czynniki mechaniczne, takie jak obciążenie śluzem funkcji rzęsek dróg oddechowych oraz generowanie/utrzymanie bicia rzęsek dróg oddechowych i propagacji fal śródkrwistych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Konfiguracja odczynników
1.1 Podłoże do preparacji i obrazowania
Pożywka L-15 Leibovitz (L15) jest uzupełniana FBS (10%) i Penicylina-Streptomycyna (100 jednostek/ml penicyliny G sodu i 100 μg/ml siarczanu streptomycyny) jest używana zarówno podczas zbioru, jak i obrazowania próbek tchawicy.
2. Zespół Płytkiej Komory Hodowlanej
Komora używana do przechowywania tkanki tchawicy jest pokazana na rysunku 1. Podłoga komory to naczynie hodowlane o średnicy 35 mm ze szklanym dnem. Górna i boczna część komory jest generowana przez umieszczenie małego kawałka silikonowej folii o grubości 0,3 mm na szklanym naczyniu. Krawędź arkusza jest przycinana tak, aby pasowała do naczynia z okrągłym dnem, a środek jest dalej przycinany, aby utworzyć płytką komorę centralną (patrz kroki 2.1-2.3). Na wierzchu tego zespołu umieszczono okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 mm, aby wygenerować zamkniętą komorę odpowiednią do obrazowania.
- Całkowicie przykryj okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 mm kwadratem z folii silikonowej o grubości 0,3 mm.
- Za pomocą standardowych ostrych nożyczek preparacyjnych odetnij nadmiar folii silikonowej z okolic krawędzi szkiełka nakrywkowego (w wyniku czego utworzy się okrągła warstwa folii silikonowej).
- Ostrym skalpelem wytnij i usuń środkowy kwadrat folii silikonowej (około 10 mm kwadratowej) ze środka zakrytego szkiełka nakrywkowego (tworząc w ten sposób górną i boczną część komory obrazowania).
3. Zbieranie i przygotowanie tchawicy
- Poddaj myszy eutanazji zgodnie z lokalnymi instytucjonalnymi komitetami ds. opieki nad zwierzętami i / lub wytycznymi rządowymi i usuń tchawicę do standardowego plastikowego naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm z wystarczającą ilością pożywki L15 do zanurzenia tkanki (autorzy używali myszy tuż przed urodzeniem w 16,5 dniu ciąży, aż do noworodków, noworodków i dorosłych zwierząt 2).
- Usuń tkankę niezwiązaną z tchawicą przyczepioną na zewnątrz tchawicy za pomocą rozwarstwienia.
- Usuń krtań z poprzecznym cięciem tuż pod chrząstką cricoid za pomocą nożyczek do mikropreparacji (ryc. 2A, wiersz 1).
- Usuń lewą i prawą pierwotną gałąź oskrzeli z poprzecznym cięciem tuż nad cariną za pomocą nożyczek do mikropreparowania (ryc. 2A, wiersz 2).
- Delikatnie przytrzymaj tchawicę cienkimi kleszkami i przepłucz światło 2-3 razy ~1 ml pożywki do kąpieli L15 za pomocą końcówki P1000 Pipetman i P1000, aby usunąć śluz i krew.
- Wytnij 3-4 pierścieniowy segment tchawicy za pomocą poprzecznego cięcia nożyczkami do mikropreparowania (ryc. 2B, wiersz 1).
- Przeciąć wzdłużnie środek mięśnia tchawicy tego krótkiego segmentu tchawicy za pomocą nożyczek do mikropreparowania (ryc. 2B, wiersz 2).
- Przeciąć wzdłużnie środek pierścieni chrząstki tchawicy za pomocą nożyczek do mikropreparowania (ryc. 2C, linia), pozostawiając dwa odcinki tkanki tchawicy nadające się do obrazowania (pojedynczy przekrój pokazany na rysunku 2D).
4. Obrazowanie rzęsek
- Przenieść segmenty tkanki tchawicy świetlistą stroną do dołu na środek naczynia hodowlanego ze szklanym dnem o średnicy 35 mm z 100-200 μl pożywki L-15.
- Aby określić ilościowo przepływ generowany przez rzęski, dodaj niewielką ilość fluorescencyjnych mikrosfer 0,20 μm do pożywki L-15, kąpiąc próbkę tkanki tchawicy (~1 x 1011 cząstek/ml lub 20 μl/ml wodnej zawiesiny mikrosfery Fluoresbrite 2,5%).
- Umieścić przygotowaną wcześniej komorę obrazowania (patrz procedura 1-3 powyżej) na wierzchu arkusza silikonowego próbki tchawicy stroną do dołu, tak aby próbka tchawicy znajdowała się pośrodku płytkiej komory o ściankach utworzonej przez okienko wycięte w folii silikonowej (rysunek 1).
- Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby zabezpieczyć je na miejscu i usunąć nadmiar nośnika L-15 z krawędzi za pomocą końcówki P1000 i Pipetmana P1000.
- Zamontuj naczynie hodowlane ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i próbkę tchawicy na mikroskopie odwróconym z obiektywem 100X i optyką DIC.
- Korzystając z szybkiej kamery i oprogramowania do akwizycji filmów, zbieraj filmy przedstawiające ruchliwość rzęsek z prędkością 200+ klatek na sekundę wzdłuż rzęskowego nabłonka tchawicy zwiniętej krawędzi mięśnia tchawicy (Rysunek 2D Zarysowane ramka, E: przykładowy nieruchomy obraz z nagranego filmu (Film uzupełniający 1).
- Korzystając z obrazowania epifluorescencyjnego FITC i kamery CCD przy słabym oświetleniu (patrz lista sprzętu powyżej), zbierz filmy przedstawiające ruch mikrosfery fluorescencyjnej po powierzchni nabłonka rzęskowej tchawicy, aby umożliwić późniejszą kwantyfikację przepływu generowanego przez rzęski (film uzupełniający 2).
5. Kwantyfikacja ruchliwości rzęsek
- Załaduj filmy zobrazowane w formacie DIC do pakietu oprogramowania ImageJ i postępując zgodnie z techniką opisaną przez Iaina Drummonda 13, użyj narzędzia linia, aby narysować linię rastrową przecinającą bijące rzęski. "Przekrój" tej linii generuje obraz typu kimograf, w którym ruch rzęsek w poprzek linii generuje wzór fali. Liczba pikseli między każdym szczytem fali jest mierzona (jeden piksel = jedna klatka filmu), na podstawie której można następnie obliczyć liczbę uderzeń na minutę (tj. Hz).
- Aby zmierzyć przepływ generowany przez rzęski, załaduj fluorescencyjne filmy perełkowe do pakietu oprogramowania ImageJ i użyj wtyczki MTrackJ 14, aby ręcznie śledzić kulki fluorescencyjne na powierzchni nabłonka tchawicy i pozwól oprogramowaniu wygenerować prędkość i kierunkowość koralików dla każdego śledzonego koralika.
Należy zachować ostrożność podczas używania fluorescencyjnych koralików do ilościowego określania przepływu, ponieważ odległość od rzęsek dudniących może silnie wpływać na mierzoną wielkość przepływu. Ruch koralików w filmie uzupełniającym 2 jest tego dobrym przykładem. W tym przykładzie ruch koralików jest szybki na powierzchni bijących rzęsek i znacznie spada w przypadku koralików znajdujących się dalej w podłożu kąpielowym. Aby to kontrolować, we wszystkich próbkach należy pobierać ślady kulek tylko w stałej odległości nad nabłonkiem rzęskowym, aby umożliwić prawidłowe porównania. Wreszcie, aby uzyskać reprezentatywne dane dotyczące przepływu płynu, kulki powinny być śledzone tak długo, jak to możliwe; Wolimy używać ścieżek koralików, które pokrywają 10+ komórek rzęskowych do obliczania przepływu płynu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Kontrolne rzęski dróg oddechowych powinny być wyraźnie widoczne i bić w sposób skoordynowany (Supplemental Movie 1; odtwarzanie filmu spowolnione do 15% czasu rzeczywistego), z zauważalnym przepływem w kierunku bicia rzęsek (Supplemental Movie 2; odtwarzanie filmu w 100% czasu rzeczywistego). Ilościowa analiza filmów z rzęskami powinna dać wyniki zbliżone do tych przedstawionych na Rysunku 3. Rejestracja wysokich prędkości filmów DIC umożliwia kwantyfikację częstotliwośc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomiar częstotliwości uderzeń rzęsek (CBF) jest stosunkowo łatwy przy użyciu obiektywów mikroskopu o dużej mocy i sprzętu do szybkiej akwizycji obrazu 13,15 i wyjaśnia, dlaczego pomiary CBF stanowią podstawę większości badań nad klirensem śluzowo-rzęskowym w okresie zdrowia i choroby. Jednakże, podczas gdy pomiar CBF jest niezbędny do zrozumienia klirensu śluzowo-rzęskowego, sam pomiar CBF ignoruje podstawowe znaczenie zarówno przepływu generowanego przez rzęski, jak i kształtu fali uderzenia rzęsek, które są ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Projekt był wspierany przez U01HL098180 grantów NIH z National Heart, Lung, and Blood Institute. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi lub Narodowych Instytutów Zdrowia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Leibovitz' s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | Bez czerwieni fenolowej |
| Płodowa surowica bydlęca | Hyclon | SH30088.03 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x drobne kleszcze | Roboz | RS-4976 | |
| Nożyczki preparacyjne | Roboz | RS-5676 | |
| Nożyczki do mikropreparacji | Roboz | RS-5620 | |
| Skalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| końcówki P1000 | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastikowe naczynia hodowlane 35 mm | Corning | 430588 | |
| Szklane dno 35 mm naczynia hodowlane | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Arkusz silikonowy o grubości 0,012" (0,3 mm) | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0,20 μ m średnica Fluoresbrite YG Karboksylan | Mikrosfery Polysciences | 09834-10 | |
| Mikroskop odwrócony, z obiektywem olejowym 100x i filtrami DIC | Marka Lecia | DMIRE2 | nie jest krytyczna. |
| 100-watowa lampa rtęciowa, epifluorescencyjne filtry wzbudzenia/emisji FITC | Marka Lecia | nie jest krytyczna | |
| Inkubator ze stopniem mikroskopu | Lecia | 11521749 | Nie jest wymagane, jeśli obrazowanie rzęsek w temperaturze pokojowej |
| Szybka kamera jasne pole | Vision Research | Phantom v4.2 | Marka nie jest krytyczna. Musi być szybszy niż 125 kl./s |
| Szybka kamera fluorescencyjna | Hamamatsu | C9100-12 | Marka nie jest krytyczna. Musi być szybszy niż 10 kl./s |
| Oprogramowanie do analizy filmów | National Institutes of Health | ImageJ z wtyczką |
Bibliografia
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I. Studying cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
